專利名稱：：一種農(nóng)藥生物活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)藥生物測(cè)定領(lǐng)域，具體涉及一種以鹵蟲(chóng)(ArtemiaSalina)為模式生物的農(nóng)藥殺蟲(chóng)活性生物測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：生物活性篩選是農(nóng)藥研發(fā)的重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的效率與成敗。傳\統(tǒng)的殺蟲(chóng)活性生物測(cè)定主要以粘蟲(chóng)、家蠅、赤擬谷盜、米象、蚜蟲(chóng)、玉米螟、小菜蛾、菜粉蝶幼蟲(chóng)等標(biāo)準(zhǔn)試蟲(chóng)為靶標(biāo)生物。這些模式生物對(duì)環(huán)境條件的要求較高，試蟲(chóng)的培養(yǎng)和大量提供是一個(gè)相當(dāng)專業(yè)且較為困難的工作。另外，上述供試生物個(gè)體較大、消耗大量試材和化合物樣品、占用較大實(shí)驗(yàn)空間、勞動(dòng)強(qiáng)度大，因此，應(yīng)用傳統(tǒng)生物測(cè)定技術(shù)進(jìn)行殺蟲(chóng)活性篩選的效率較低。當(dāng)前，新農(nóng)藥研發(fā)對(duì)于高通量生物活性篩選方法的需求越來(lái)越迫切。鹵蟲(chóng)(ArtemiaSalina)又稱鹽水豐年蟲(chóng)，在分類學(xué)上屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱鰓足亞綱無(wú)甲目鹽水豐年蟲(chóng)科，是一種廣溫耐高鹽的水生生物。鹵蟲(chóng)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、不飽和脂肪酸、微量元素和核黃素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)餌料。由于鹵蟲(chóng)具有對(duì)毒物敏感、個(gè)體微小、容易獲得與培養(yǎng)等特點(diǎn)，因此，有資料報(bào)導(dǎo)可應(yīng)用于海洋、江河中有毒化學(xué)物質(zhì)的毒性檢測(cè)，美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(EPA)把鹵蟲(chóng)列為排污的毒性試驗(yàn)生物。但是，利用鹵蟲(chóng)在農(nóng)藥殺蟲(chóng)活性生物測(cè)定方面的應(yīng)用較少，至今未見(jiàn)利用鹵蟲(chóng)進(jìn)行農(nóng)藥生物測(cè)定方法的專利公開(kāi)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于提供一種采用鹵蟲(chóng)為對(duì)象的農(nóng)藥生物活性測(cè)定和篩選方法，可以用于對(duì)現(xiàn)有農(nóng)藥品種進(jìn)行殺蟲(chóng)活性的測(cè)定，也可以用于農(nóng)藥抗藥性研究以及化合物或農(nóng)藥對(duì)環(huán)境中水生生物的安全性檢測(cè)，尤其適合對(duì)植物提取物樣品進(jìn)行殺蟲(chóng)活性的快速篩選。本發(fā)明采用的技術(shù)方案—種農(nóng)藥生物活性測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將待測(cè)供試樣品物用蒸餾水溶解配制成母液；難溶于水的樣品先加入少量丙酮溶解，再用人工海水逐步稀釋得待測(cè)供試藥液，對(duì)于測(cè)供試樣品物為農(nóng)藥時(shí)待測(cè)供試藥液濃度為0.0055mg/L，測(cè)供試樣品物為植物提取物時(shí)待測(cè)供試藥液濃度為101000mg/L;(2)移取鹵蟲(chóng)液10uL，內(nèi)含鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體3040頭，于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入1.5mL待測(cè)供試藥液，置于25t:的光照度2000Lx、光照周期12L12D的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)48h后，于解剖鏡下觀察鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體死亡個(gè)體數(shù)，計(jì)算校正死亡率，評(píng)價(jià)待測(cè)樣品的殺蟲(chóng)生物活性。所述供試樣品是農(nóng)藥現(xiàn)有的化合物殺蟲(chóng)劑品種或植物提取物樣品。人工海水的配制參考張福2002年公開(kāi)的方法，其無(wú)機(jī)鹽組分及配比見(jiàn)表1。引證文獻(xiàn)張福.鹵蟲(chóng)Na/Mg比值對(duì)鹵蟲(chóng)發(fā)育生長(zhǎng)的影響.海湖鹽與化工，2002，32(2):16-19。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明提供的方法，該鹵蟲(chóng)靶標(biāo)對(duì)大部分農(nóng)藥活性敏感，來(lái)源廣泛并容易大量飼養(yǎng)；測(cè)定成本低廉，方法簡(jiǎn)單方便；所需樣品量微量，對(duì)于化合物樣品，一次消耗量小于0.05毫克，對(duì)于植物提取物樣品，一次消耗量小于1.5毫克，尤其適合微量樣品的篩選或測(cè)定。具體實(shí)施例方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，下面通過(guò)實(shí)施例予以進(jìn)一步闡述。實(shí)驗(yàn)材料現(xiàn)有殺蟲(chóng)劑品種，三唑磷、毒死蜱、氟鈴脲、阿維菌素、噠螨靈原藥均為市售購(gòu)得；竹葉提取物樣品，將供試不同竹種的竹葉自然風(fēng)干，粉碎成末，分別稱取25g竹粉于索式提取器內(nèi)，丙酮浸泡過(guò)夜。在水浴溫度65t:，液料比10:l的比例下提取89h，至提取液無(wú)色。然后將提取液減壓濃縮至干，4t:冷藏備用。不同規(guī)格的多孔培養(yǎng)板為市售產(chǎn)品。鹵蟲(chóng)來(lái)源市購(gòu)鹵蟲(chóng)卵，稱取鹵蟲(chóng)卵O.OlOg于100mL量筒中，加入人工海水90mL，用NaHC03調(diào)節(jié)pH至8.08.5，置于25"恒溫水浴鍋內(nèi)，用一小型充氣泵由量筒底部緩緩充氣，使蟲(chóng)卵保持懸浮狀態(tài)，光照(2000Lx)孵化。24h后，得到孵出約4h的I期鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體，利用鹵蟲(chóng)的趨光性，吸管收集，備用。試驗(yàn)方法通過(guò)環(huán)境因子對(duì)鹵蟲(chóng)生物測(cè)定方法影響的研究結(jié)果表明，以鹵蟲(chóng)作為殺蟲(chóng)活性生物測(cè)定的模式生物，其培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽的含量不能低于5%。，pH值應(yīng)控制在7左右，培養(yǎng)溫度不宜超過(guò)35。C，測(cè)定過(guò)程中不宜24h持續(xù)光照。供試樣品藥液的配制將供試農(nóng)藥原藥或竹葉提取物用少量丙酮溶解后，用蒸餾水配制成10g/L的母液，再用人工海水(pH保持中性)逐步稀釋至供試濃度。農(nóng)藥原藥待測(cè)供試藥液濃度為0.0055mg/L，竹葉提取物待測(cè)供試藥液濃度為101000mg/L;移取鹵蟲(chóng)液10uL(無(wú)節(jié)幼體3040頭)于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入1.5mL供試樣品藥液，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)對(duì)照。置于25t:、光照周期12L12D的培養(yǎng)箱中(2000Lx)培養(yǎng)，試驗(yàn)期間無(wú)需投放餌料。培養(yǎng)48h后，體視顯微鏡下觀察鹵蟲(chóng)死亡個(gè)體數(shù)及試蟲(chóng)總數(shù)，計(jì)算鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體的死亡率、校正死亡率或者存活率、校正存活率。傳統(tǒng)蚜蟲(chóng)浸漬法進(jìn)行供試竹葉提取物殺蟲(chóng)活性篩選，并將結(jié)果與該發(fā)明方法篩選的結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證該發(fā)明方法的可靠性。蚜蟲(chóng)浸漬法如下將完整、生長(zhǎng)良好的無(wú)蟲(chóng)煙葉葉片，放入待測(cè)藥液(提取物質(zhì)量濃度為10g/L)中浸漬35秒后取出，吸去多余的藥液，陰干，并將濕潤(rùn)的棉條包裹在葉柄處，以保持葉片濕度，減少水分散失，放在培養(yǎng)皿中備用。同樣的辦法將帶蟲(chóng)葉片放在待測(cè)藥液中浸漬35秒后取出，吸去多余的藥液，然后用零號(hào)毛筆挑取大小一致、行動(dòng)活潑的無(wú)翅蚜，轉(zhuǎn)移到上述處理備用煙葉葉片上，每片40頭，罩上紗布，蓋上皿蓋。每個(gè)處理重復(fù)4次，同時(shí)設(shè)立相同濃度丙酮對(duì)照及自來(lái)水對(duì)照。在溫度25°C、相對(duì)濕度85%左右的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h，48h和72h檢查死亡蚜蟲(chóng)個(gè)體，計(jì)算校正死亡率。按上述試驗(yàn)方法，分別對(duì)三唑磷、毒死蜱、氟鈴脲、阿維菌素、噠螨靈原藥進(jìn)行了殺蟲(chóng)活性生物測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。應(yīng)用該發(fā)明方法對(duì)12種竹葉提取物進(jìn)行了殺蟲(chóng)活性篩選，結(jié)果見(jiàn)表3。應(yīng)用傳統(tǒng)蚜蟲(chóng)浸漬法對(duì)上述12種竹葉提取物殺蟲(chóng)活性的篩選結(jié)果見(jiàn)表4。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，鹵蟲(chóng)不僅可以有效地檢測(cè)現(xiàn)有農(nóng)藥品種在不同劑量下的殺蟲(chóng)活性，同時(shí)也能快速高效地進(jìn)行植物提取物的殺蟲(chóng)活性篩選，并與傳統(tǒng)蚜蟲(chóng)浸漬法進(jìn)行殺蟲(chóng)活性篩選的結(jié)果是一致的。對(duì)鹵蟲(chóng)活性高的提取物對(duì)蚜蟲(chóng)也表現(xiàn)出較好的生物活性，對(duì)鹵蟲(chóng)活性低的，對(duì)蚜蟲(chóng)效果也比較差。由于鹵蟲(chóng)相對(duì)于蚜蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)活性物質(zhì)更加敏感，因此，從上述結(jié)果中可見(jiàn)植物提取物對(duì)鹵蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性明顯高于蚜蟲(chóng)。表格表1人工海水無(wú)機(jī)鹽成份表(lOOOmL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2應(yīng)用該發(fā)明方法對(duì)供試農(nóng)藥殺蟲(chóng)活性的測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注1.測(cè)定時(shí)間為48h。表3應(yīng)用該發(fā)明方法對(duì)供試竹葉提取物殺蟲(chóng)活性篩選結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種農(nóng)藥生物活性測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將待測(cè)供試樣品物用蒸餾水溶解配制成母液；難溶于水的樣品先加入少量丙酮溶解，再用人工海水逐步稀釋得待測(cè)供試藥液，對(duì)于測(cè)供試樣品物為農(nóng)藥時(shí)待測(cè)供試藥液濃度為0.005～5mg/L，測(cè)供試樣品物為植物提取物時(shí)待測(cè)供試藥液濃度為10～1000mg/L；(2)移取鹵蟲(chóng)液10uL，內(nèi)含鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體30～40頭，于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入1.5mL待測(cè)供試藥液，置于25℃的光照度2000Lx、光照周期12L～12D的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)48h后，于解剖鏡下觀察鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體死亡個(gè)體數(shù)，計(jì)算校正死亡率，評(píng)價(jià)待測(cè)樣品的殺蟲(chóng)生物活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述供試樣品是農(nóng)藥現(xiàn)有的化合物殺蟲(chóng)劑品種或植物提取物樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述供試樣品是三唑磷、毒死蜱、氟鈴脲、阿維菌素或噠螨靈原藥。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)藥生物活性測(cè)定方法，包括以下步驟(1)將供試樣品(農(nóng)藥原藥或植物提取物)用蒸餾水配制成10g/L的母液，難溶于水的樣品先加入少量丙酮溶解，再用人工海水逐步稀釋至供試濃度。(2)移取鹵蟲(chóng)液10uL，于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入1.5mL待測(cè)供試農(nóng)藥藥液，置于25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)期間無(wú)需投放餌料。每個(gè)處理重復(fù)4次，同時(shí)設(shè)立含一定量丙酮的人工海水對(duì)照。(3)培養(yǎng)48h后，于解剖鏡下觀察鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體死亡個(gè)體數(shù)，計(jì)算校正死亡率，評(píng)價(jià)待測(cè)樣品的殺蟲(chóng)生物活性。本發(fā)明提供的方法，該靶標(biāo)對(duì)大部分農(nóng)藥活性敏感，來(lái)源廣泛并容易大量飼養(yǎng)；測(cè)定成本低廉，方法簡(jiǎn)單方便；所需樣品量微量，尤其適合微量樣品的篩選或測(cè)定。文檔編號(hào)G01N33/00GK101788545SQ20101010790公開(kāi)日2010年7月28日申請(qǐng)日期2010年2月4日優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日發(fā)明者吳祥為,唐俊,姚曦,岳永德,操海群,湯鋒,王進(jìn),花日茂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