本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領(lǐng)域，具體涉及長鏈非編碼rnalinc00472的原位雜交探針、試劑及其應用方法。

背景技術(shù)：

鼻咽癌是常見高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預后較差。研究表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程，其中抑癌基因的失活與癌基因的激活發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

tp53基因(編碼p53蛋白)自1979年被克隆以來，一直是腫瘤分子生物學研究領(lǐng)域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的證據(jù)表明，tp53基因通過調(diào)控一系列信號轉(zhuǎn)導通路廣泛參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在細胞受到各種致癌因素的刺激時，p53蛋白激活并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游關(guān)鍵靶基因的表達，阻滯細胞周期、誘導細胞分化、啟動細胞衰老及凋亡、參與dna損傷修復維持基因組的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)能量代謝和抑制腫瘤血管生成，從而阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究發(fā)現(xiàn)，tp53基因是包括鼻咽癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中最常見的突變基因之一，33％～76％的患者存在tp53基因異常。因此，恢復鼻咽癌中tp53基因功能或逆轉(zhuǎn)其下游信號通路，對鼻咽癌的治療具有重要的意義。

長鏈非編碼rnas(longnon-codingrnas,lncrnas)是一類長度超過200nt、缺少特異完整的開放閱讀框、無或很少有蛋白編碼功能的rnas分子。最近的研究表明，lncrnas通過在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平廣泛調(diào)節(jié)基因的表達，它們參與了生物體生長、發(fā)育、衰老及死亡等重要生命活動的調(diào)控。越來越多的研究表明lncrnas的異常表達或功能缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些lncrnas分子在腫瘤的診斷和治療方面具有重要的意義，且可以作為腫瘤預后判斷新的分子標記。目前，已經(jīng)克隆的人類lncrnas基因已超過4萬多個，但絕大部分lncrna的功能未知。

為了尋找鼻咽癌中tp53基因調(diào)控的下游lncrnas及其在鼻咽癌中的應用價值，我們在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染tp53基因，收集不同時間點的細胞用新一代lncrnas芯片檢測了已知lncrna的表達水平。芯片檢測的結(jié)果顯示，lncrnalinc00472的表達差異最顯著，其表達明顯上調(diào)，提示linc00472可能具有抑瘤基因的作用。

我們構(gòu)建了表達linc00472的真核表達載體，轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細胞株中，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)和裸鼠移殖瘤體內(nèi)模型中均證實lncrnalinc00472可明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的生長，因此linc00472是一個新的抑瘤性lncrna。將linc00472真核表達載體負載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米基因轉(zhuǎn)運體，多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒，可保護linc00472載體免受核酸酶降解，延長作用時間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。

進一步地，我們檢測了linc00472在臨床離體腫瘤樣本中的表達水平，并分析了linc00472表達水平與臨床病例資料的相關(guān)性。我們從鼻咽癌及相對應的正常對照組織中抽提rna后通過逆轉(zhuǎn)錄，實時定量pcr，檢測了linc00472的表達情況，結(jié)果顯示linc00472在鼻咽癌組織中表達下調(diào)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進一步在存檔石蠟樣本驗證了linc00472在鼻咽癌中表達顯著下調(diào)，因此針對linc00472的檢測制劑可用于鼻咽癌的輔助診斷，結(jié)合臨床回訪資料進行生存曲線分析發(fā)現(xiàn)linc00472表達低的患者其生存時間短于該lncrna表達高的患者，因此針對該lncrna的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的預后判斷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供長鏈非編碼rnalinc00472的原位雜交探針、試劑及其應用方法，原位雜交檢測該長鏈非編碼rnalinc00472的試劑可以用于制備鼻咽癌患者的預后制劑。

長鏈非編碼rnalinc00472的原位雜交探針，序列如下中的一種或幾種：

linc00472探針1：5’-caaaactaggattctgtctttgaggcagac-3’

linc00472探針2：5’-aagaatggaagtgggaagagagaaagactt-3’

linc00472探針3：taattcaggggtatccgtcttagtttaggc；

該長鏈非編碼rnalinc00472的序列見seqno:1。

一種長鏈非編碼rnalinc00472的原位雜交檢測試劑，含有如下用于原位雜交檢測linc00472表達的寡核苷酸探針中的一種或幾種：

linc00472探針1：5’-caaaactaggattctgtctttgaggcagac-3’

linc00472探針2：5’-aagaatggaagtgggaagagagaaagactt-3’；

linc00472探針3：taattcaggggtatccgtcttagtttaggc；

該長鏈非編碼rnalinc00472的序列見seqno:1。

試劑中還含有如下陽性對照探針中的一種或幾種，

gapdh探針1：5'-ccactttaccagagttaaaagcagccctgg-3'

gapdh探針2：5'-gtcagaggagaccacctggtgctcagtgta-3

gapdh探針3：5’-cagtagaggcagggatgatgttctggagag-3’'。

所述的長鏈非編碼rnalinc00472的原位雜交檢測試劑的應用方法，用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑。

所述的鼻咽癌輔助診斷或者療效預測制劑是根據(jù)長鏈非編碼rnalinc00472在鼻咽癌中的表達情況來進行輔助診斷和療效預測，鼻咽癌組織中l(wèi)inc00472表達顯著下調(diào)。

上述檢測試劑中還含有：地高辛寡核苷酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑、dab染色試劑；

其它常規(guī)生物化學試劑，包括20x檸檬酸鈉緩沖溶液(salinesodiumcitrate,ssc)，硫酸葡聚糖(dextransulphate)，去離子甲酰胺(deionizedformamide)，多聚腺苷酸(polyadenylicacid，polya)，多聚脫氧腺苷酸(polydeoxyadenylicacid，polyda)，變性剪切的蛙精dna(denaturedandshearedsalmonspermdna，ssdna)，酵母轉(zhuǎn)運rna(yeastt-rna，trna)，二硫蘇糖醇(dtt)，50x鄧罕氏緩沖液(denhardts’ssolution)，磷酸緩沖液(pbsbuffer)，胃蛋白酶k，牛血清白蛋白(bsa)，三乙醇胺(tea)，醋酸酐，阻斷試劑(blockingreagentagent)，tnb緩沖液(即：ph7.5的0.1mtris-cl+0.15mnacl+0.5％阻斷試劑)，tnt緩沖液(即：ph7.5的0.1mtris-cl+0.15mnacl+0.05％tween20)。

我們通過原位雜交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存檔石蠟組織標本中發(fā)現(xiàn)linc00472在鼻咽癌中表達顯著下調(diào)，且linc00472的表達與預后密切相關(guān)，linc00472表達低的患者更快地死亡，提示linc00472可作為鼻咽癌預后預測的分子標志。本發(fā)明為鼻咽癌的輔助診斷和預后預測提供了強有力的分子生物學工具，具有深遠的臨床意義和重要的推廣應用前景。

附圖說明

圖1為tp53基因可誘導lncrnalinc00472表達情況；

a：在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染tp53基因表達載體0、12、24和48小時后用實時熒光定量pcr檢測tp53基因的表達，tp53基因mrna表達水平顯著上調(diào)；

b：在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染tp53基因表達載體0、12、24和48小時后用westernblotting方法檢測tp53基因的表達，tp53基因蛋白表達水平顯著上調(diào)；

c：在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染tp53基因表達載體0、12、24和48小時后用熒光素酶報告基因活性方法檢測tp53基因表達的p53蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，p53轉(zhuǎn)錄活性顯著上調(diào)；

d：在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染tp53基因表達載體12、24和48小時后利用lncrna芯片檢測細胞內(nèi)lncrna表達水平的變化，本圖顯示了細胞中轉(zhuǎn)染tp53基因后表達上調(diào)最顯著的30個lncrna基因，linc00472已在圖中框出；

e：實時熒光定量pcr技術(shù)驗證lncrna芯片的結(jié)果，轉(zhuǎn)染tp53基因后細胞中l(wèi)ncrnalinc00472的表達顯著上調(diào)；

圖2為在鼻咽癌細胞中導入lncrnalinc00472抑制鼻咽癌細胞的生長情況；

a：生長曲線實驗表明在鼻咽癌細胞中轉(zhuǎn)染linc00472表達載體后細胞生長速度減慢；

b：流式細胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染linc00472表達載體后，鼻咽癌細胞周期阻滯于g2/m期；

c：流式細胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染linc00472表達載體后，凋亡的鼻咽癌細胞明顯增多；

圖3為動物實驗證實lncrnalinc00472抑制鼻咽癌細胞的生長和增殖情況；

a：在鼻咽癌細胞中轉(zhuǎn)染linc00472表達載體后，注射到裸鼠腋窩皮下，每5天測量移殖瘤大小，linc00472可顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖；

b：30天后處死裸鼠，大體觀察表明重表達linc00472組移殖瘤較??；

c：處死裸鼠后取出移殖瘤比較和測量移殖瘤大小，重表達linc00472組移殖瘤較??；

圖4為利用實時熒光定量pcr的方法檢測鼻咽癌離體樣本中l(wèi)inc00472的表達情況；linc00472在鼻咽癌(t)中的表達比正常對照(n)樣本中顯著下調(diào)；

圖5為原位雜交檢測linc00472在鼻咽癌及癌旁粘膜中的表達情況；左圖為癌旁組織，右圖為鼻咽癌組織(放大倍數(shù)：200×)，linc00472在鼻咽癌中表達水平較低；

圖6為鼻咽癌中l(wèi)inc00472的表達與患者的預后相關(guān)分析；linc00472表達低或者不表達的患者更快的死亡。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施方式進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

實施例1，在鼻咽癌細胞中導入tp53基因，lncrnalinc00472表達顯著上調(diào)

1.材料與方法：

1.1試劑及試劑盒

瓊脂糖(agrose)等常用生化試劑、膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，利用minikit(qiagen)抽提試劑盒抽提高質(zhì)量的rna，superscript^tmiii(invitrogen)試劑盒將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna。熒光素酶報告基因檢測試劑盒dual-luciferasereporterassaysystem購自promega公司。本發(fā)明所用的鼻咽癌細胞hne2為中南大學腫瘤研究所保存。細胞培養(yǎng)所用rpmi1640培基和胎牛血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國gibco公司產(chǎn)品。lncrna芯片為安捷倫公司產(chǎn)品，該芯片規(guī)格為4*180k，其中l(wèi)ncrnas探針46506條。

tp53真核表達質(zhì)粒購自美國clontech公司，用于檢測p53蛋白轉(zhuǎn)錄活性的pp53-ta-luc熒光素酶報告質(zhì)粒購自碧云天公司。

實時熒光定量檢測引物序列有：

tp53基因上游引物：5’-cccttcccagaaaacctacc-3’

tp53基因下游引物：5’-ctccgtcatgtgctgtgact-3’

內(nèi)參看家基因gapdh上游引物：5’-accacagtccatgccatcac-3’

內(nèi)參看家基因gapdh下游引物：5’-tccaccaccctgttgctgta-3’

linc00472上游引物：5’-gcatctgtcaacgctcctct-3’

linc00472下游引物：5’-ccgcgttctttgtgtgtctc-3’

westernblotting檢測p53蛋白及內(nèi)參基因gapdh表達的抗體購自cellsignalingtechnology公司。

1.2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細胞hne2按2×10⁵個細胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細胞生長至50-70％密度即可開始tp53真核表達載體的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過程如下：

在無菌ep管中加入3μl的lipofectamine2000于100μl無血清培養(yǎng)基中混勻靜置5min；將tp53表達載體加入100μl無血清培養(yǎng)基中；然后與上述包含lipofectamine的100μl無血清培養(yǎng)基溫和混勻，室溫靜置30分鐘，使dna與脂質(zhì)體形成復合體；用d-hank's液洗滌細胞3次；將上述混合物中加入800μl無血清培養(yǎng)基(無抗生素)，溫和混勻后加入6孔板中的1個孔；將6孔板置于co2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)6小時，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48小時。

1.3實時熒光定量法檢測tp53基因和linc00472的表達

鼻咽癌細胞hne2轉(zhuǎn)染tp53真核表達載體后于0、12、24和48小時收集細胞，抽提細胞中的總rna，2μgrna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cdna后，進行實時熒光定量pcr。

實時熒光定量pcr反應體系

實時熒光定量pcr反應步驟

反應結(jié)束后確認實時熒光定量pcr的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根據(jù)ct值(thresholdcyclevalues)、內(nèi)參基因(gapdh)標化后，采用groupt-test檢驗計算p值。

1.4westernblotting檢測p53蛋白的表達

鼻咽癌細胞hne2轉(zhuǎn)染tp53真核表達載體后于0、12、24和48小時收集細胞，抽提細胞中的總蛋白，常規(guī)westernblotting方法檢測p53蛋白的表達，gapdh作為內(nèi)參基因。

1.5熒光素酶報告基因檢測p53的轉(zhuǎn)錄活性

鼻咽癌細胞hne2轉(zhuǎn)染tp53真核表達載體，同時轉(zhuǎn)染pp53-ta-luc熒光素酶報告質(zhì)粒，于0、12、24和48小時收集細胞，根據(jù)promega公司熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測p53轉(zhuǎn)錄因子活性。

1.6lncrna芯片檢測轉(zhuǎn)染tp53基因后鼻咽癌細胞中l(wèi)ncrna表達變化

按安捷倫公司產(chǎn)品說明，抽提細胞總rna、純化，隨機引物合成cdna，并在cdna上標記熒光cy3，與lncrna芯片雜交，芯片雜交后經(jīng)洗滌后在安捷倫專用芯片掃描儀上掃描，獲得芯片上每個探針點的熒光強度，專用軟件分析轉(zhuǎn)換成對應的lncrna表達水平。比較鼻咽癌細胞hne2轉(zhuǎn)染tp53真核表達載體后0、12、24和48小時細胞內(nèi)lncrna的表達水平，獲得差異表達基因圖譜。

2.結(jié)果

2.1tp53真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞hne2后的表達效果：

將tp53真核表達載體轉(zhuǎn)染hne2細胞后，12、24和48小時均可檢測到tp53mrna(圖1a)和p53蛋白(圖1b)的表達顯著升高，且表達出的p53蛋白具有較強的轉(zhuǎn)錄因子活性(圖1c)。

2.2轉(zhuǎn)染tp53真核表達載體后鼻咽癌細胞中部分lncrna的表達水平顯著改變：

利用lncrna芯片，我們檢測了轉(zhuǎn)染tp53表達載體0、12、24和48小時后鼻咽癌細胞hne2中l(wèi)ncrna的表達狀態(tài)，部分lncrna表達水平發(fā)生了顯著的變化(圖1d列舉了表達上調(diào)最顯著的30個lncrna)。隨后，我們對轉(zhuǎn)染tp53載體后hne2細胞中l(wèi)inc00472的表達水平用實時熒光定量法進行驗證，證實linc00472的表達確實顯著上調(diào)(圖1e)，表明tp53在hne2細胞中調(diào)控了linc00472的表達，鑒于tp53基因是最重要的抑瘤基因之一，提示linc00472可能也具有抑瘤基因功能。

實施例2，lncrnalinc00472抑制鼻咽癌細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡

1.材料與方法

1.1試劑及試劑盒

限制性內(nèi)切酶nhei和ecorv及t4dna連接酶等購自takara公司；trizol^tmreagent(invitrogen)；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒(omega)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega)；蛋白酶k、dnasei、rnasin、rnasea(gbicol公司)；四甲基偶氮唑藍(mtt，sigma)；抗生素g418(ameresc)。

1.2pcdna3.1–linc00472真核表達載體的構(gòu)建

我們選擇pcdna3.1空白載體(來源于invitrogen公司)構(gòu)建linc00472的過表達載體。我們選擇nhei和ecorv酶切位點用于酶切pcdna3.1載體并將linc00472序列插入該位點。

構(gòu)建pcdna3.1–linc00472真核載體步驟如下：

1)以轉(zhuǎn)染tp53質(zhì)粒的hne2細胞cdna為模板，利用takarala酶進行pcr擴增全長linc00472序列。linc00472全長序列擴增引物如下：

上游引物：5’-atgcgaggctggggccggtt-3’

下游引物：5’-tttagactccaaatggctgttttatt-3’

在上、下游引物的5’端分別加上限制性內(nèi)切酶nhei和ecorv識別位點及保護堿基后，引物序列如下：

上游：5’-aggagctagcatgcgaggctggggccggtt-3’(下劃線部分為nhei識別位點)

下游：5’-atgcgatatctttagactccaaatggctgttttatt-3’(下劃線部分為ecorv識別位點)

2)pcr擴增，linc00472全長序列，pcr反應條件如下：

pcr反應步驟

3)將pcr產(chǎn)物電泳、膠回收目的片段后經(jīng)nhei和ecorv雙酶切后電泳，再次膠回收。

4)pcdna3.1質(zhì)粒經(jīng)nhei和ecorv雙酶切后電泳膠回收目的片段。

5)以t4dna連接酶連接4)和5)步膠回收產(chǎn)物，即可得到可用于真核表達lncrnalinc00472的載體質(zhì)粒。

6)將第5)步得到的包含linc00472全長序列的pcdna3.1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌jm109，以擴增質(zhì)粒。

1.3制備多聚賴氨酸包被的硅納米顆粒

多聚賴氨酸包被的硅納米顆粒是運用op-10/環(huán)己烷/氨水微乳液自組裝技術(shù)進行硅納米顆粒(silicananoparticle,sinp)的合成，并利用硅納米顆粒的表面能和通過離子靜電作用，制備多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒；所述的納米顆?？梢杂梢韵路椒ㄖ苽涞玫剑?/p>

1)將op-10、環(huán)己烷和氨水混合，室溫攪拌均勻后加入正硅酸異酯(teos)，繼續(xù)攪拌至聚合完成，加入等體積丙酮，超聲分散，離心，雙蒸水洗滌三次，離心收集沉淀于80℃干燥，研細得硅納米顆粒(sinp)。其中h2o與op-10及h2o與teos的摩爾比為2～10、氨水濃度為1.6～28％、teos在環(huán)己烷中的摩爾濃度為0.1～3mol/l。

2)將sinp按0.1～10mg/ml重懸于0.6mnaco3溶液中，超聲分散，離心，棄上清，再將沉淀物按0.1～10mg/ml重懸于pbs(ph7.4)中，超聲分散，加多聚賴氨酸(終濃度為4～15nmol/ml)，充分混勻，室溫混搖；離心，棄上清，沉淀重懸于雙蒸水中，得到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒。多聚賴氨酸的終濃度為4～15nmol/ml。

3)將改性硅納米顆粒超聲分散，按質(zhì)量比5～30:1與上述linc00472表達載體混合，室溫靜置使其結(jié)合。

1.4細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細胞hne2按2×10⁵個細胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細胞生長至50-70％密度即可開始linc00472真核表達載體的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過程如下：

在無菌ep管中加入100μl制備好的攜帶linc00472真核表達質(zhì)粒的多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒懸液，與100μl無血清培養(yǎng)基溫和混勻；用d-hank's液洗滌細胞3次；將上述混合物中加入800μl無血清培養(yǎng)基(無抗生素)，溫和混勻后加入6孔板中的1個孔；將6孔板置于co2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)6小時，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。用攜帶pcdna3.1空載體的多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒作為實驗對照。

1.5mtt細胞增殖實驗

1)消化上一步得到的細胞，用細胞計數(shù)儀對細胞進行計數(shù)，將轉(zhuǎn)染linc00472和pcdna3.1空載體的細胞接種于96孔板中，每孔接種1000個細胞，每種細胞接種5孔，結(jié)果取其均值。

2)37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時，待細胞貼壁后，每孔加mtt液(5mg/ml)20μl。繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。每孔再加入150μldmso，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。

3)選擇490nm波長，同時設定調(diào)零孔，在酶聯(lián)免疫檢測儀上，測定各孔吸光度值并記錄結(jié)果。

4)每隔24小時重復步驟同上，共檢測6天。以吸光度值為縱坐標，間隔時間為橫坐標繪制mtt曲線。

5)實驗重復三次。以各時間點為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.6流式細胞儀分析細胞周期

1)培養(yǎng)細胞達到85％融合時用胰酶消化細胞，1200rpm/min離心5min，收集細胞沉淀。

2)1xpbs重懸細胞，1200rpm/min，離心5min，收集細胞。重復此步驟2次。

3)1xpbs重懸細胞，加入預冷的70％乙醇固定細胞過夜。

4)1000rcf/min，離心5min，收集細胞沉淀。

5)ph7.4pbs洗滌細胞1次，離心后加入pbs重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度至ix10⁶/ml。

6)加入碘化丙錠(pi)染色液(含50mg/lpi,1g/ltritonx-100，100g/lrnase)混勻，4℃避光孵育30min。

7)流式細胞儀facstar(美國bd公司)檢測。接收的信號經(jīng)cellquest軟件處理，對檢測細胞的熒光強度進行分析。實驗重復3次。

1.7流式細胞儀分析細胞調(diào)亡率

1)培養(yǎng)細胞達到85％融合時，用胰酶消化各組細胞并收集于離心管內(nèi)，同時收集各組上清懸浮細胞。注意輕輕吹打細胞，避免胰酶過度消化。

2)分別合并各組細胞并轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，棄上清收集細胞，pbs輕輕重懸后，細胞計數(shù)。

3)取5～10萬重懸細胞，1000rpm離心5min，棄上清，加入195ulannexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細胞。

4)加入5ulannexinv，輕輕混勻。避光室溫孵育10min。

5)1000rpm離心5min，棄上清，加入190ulannexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細胞。

6)加入10ulpi染色液，輕輕混勻，冰浴避光。

7)隨即進行流式細胞儀檢測，annexinv-fitc為綠色熒光，pi為紅色熒光。

2.結(jié)果

2.1linc00472抑制鼻咽癌細胞的生長

轉(zhuǎn)染linc00472真核表達載體后，與轉(zhuǎn)染空載體的細胞相比，鼻咽癌細胞hne2的生長速度顯著減慢(圖2a)。

2.2linc00472通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡抑制鼻咽癌細胞的生長

流式細胞儀分析表明，在鼻咽癌細胞hne2中轉(zhuǎn)染linc00472后，g2/m期細胞比例顯著增加，而s期及g0/g1期細胞比例減少，表明linc00472可將hne2細胞阻滯于g2/m期，使其細胞分裂減慢速度(圖2b)。同時，在鼻咽癌細胞hne2中轉(zhuǎn)染linc00472后凋亡細胞比例明顯增加(圖2c)，這也是linc00472抑制鼻咽癌細胞生長的原因之一。

實施例3，裸鼠移殖瘤模型中l(wèi)inc00472抑制鼻咽癌細胞生長

1.材料與方法

8只雄性balb/c裸鼠，4周齡，重量為19±2g，購買于上海斯萊克實驗動物有限公司。所有裸鼠均質(zhì)檢合格，在中南大學實驗動物部，于無特定病原體(spf)條件下飼養(yǎng)。

linc00472真核表達載體構(gòu)建及多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒的制備、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染等同實施例2。

轉(zhuǎn)染linc00472或pcdna3.1空白載體的hne2細胞，以及未作任何處理的hne2細胞(mock)各取2×10⁶分別注入裸鼠腋下的皮下，觀察比較腫瘤的生長情況，第5天起，用游標卡尺隔著皮膚測量移殖瘤大小，第30天時處死裸鼠，取出移殖瘤測量，比較各組移殖瘤的大小。

2.結(jié)果

裸鼠移殖瘤模型進一步證實，lncrnalinc00472可抑制鼻咽癌細胞的生長(圖3)

實施例4，實時熒光定量法檢測證實linc00472在鼻咽癌中表達下調(diào)

1.材料與方法：

9例正常鼻咽粘膜上皮和9例鼻咽癌組織抽提總rna，2μgrna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cdna后，進行實時熒光定量pcr。linc00472上游引物為5'-gcatctgtcaacgctcctct-3'和下游引物5'-ccgcgttctttgtgtgtctc-3'。

用于對照的內(nèi)參看家基因gapdh上游引物為5'-accacagtccatgccatcac-3'和下游引物5'-tccaccaccctgttgctgta-3'，

實時熒光定量pcr反應體系

實時熒光定量pcr反應步驟

反應結(jié)束后確認實時熒光定量pcr的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根據(jù)ct值(thresholdcyclevalues)、內(nèi)參基因(gapdh)標化后，采用groupt-test檢驗計算p值。

2.結(jié)果

lncrnalinc00472在正常對照組織中表達較低，而在鼻咽癌組織中低表達或者不表達p<0.001(圖4)

實施例5，原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)linc00472在鼻咽癌中的表達與患者預后相關(guān)

1.材料與方法：

1.1設計并合成雜交探針

為了采用原位雜交方法檢測linc00472的表達情況，我們設計了針對原位雜交檢測linc00472表達的寡核苷酸探針及陽性對照兩組原位雜交寡核苷酸探針各3條。

用于原位雜交檢測linc00472表達的寡核苷酸探針：

linc00472探針1：5’-caaaactaggattctgtctttgaggcagac-3’

linc00472探針2：5’-aagaatggaagtgggaagagagaaagactt-3’；

linc00472探針3：5’-taattcaggggtatccgtcttagtttaggc-3’。

陽性對照探針(檢測看家基因gapdh)：

gapdh探針1：5'-ccactttaccagagttaaaagcagccctgg-3'

gapdh探針2：5'-gtcagaggagaccacctggtgctcagtgta-3'

gapdh探針3：5’-cagtagaggcagggatgatgttctggagag-3’。

寡核苷酸探針序列的合成采用化學合成方法合成上述設計各基因特異性的寡核苷酸探針序列。

1.2寡核苷酸探針標記試劑盒和原位雜交檢測試劑

地高辛寡核苷酸加尾試劑(digoligonucleitidetailingkit2^ndgeneration，roche公司)，抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑盒(anti-digoxigenin-pod，fabfragments，roche公司)，增強原位表達檢測信號的tsa信號放大系統(tǒng)(tsa^tmbiotinsystem，nel700試劑盒，perkinelmer公司)，dab染色試劑盒(北京中山公司)，20x檸檬酸鈉緩沖溶液(salinesodiumcitrate,ssc)，硫酸葡聚糖(dextransulphate)，去離子甲酰胺(deionizedformamide)，多聚腺苷酸(polyadenylicacid，polya)，多聚脫氧腺苷酸(polydeoxyadenylicacid，polyda)，變性剪切的蛙精dna(denaturedandshearedsalmonspermdna，ssdna)，酵母轉(zhuǎn)運rna(yeastt-rna，trna)，二硫蘇糖醇(dtt)，50x鄧罕氏緩沖液(denhardts’ssolution)，磷酸緩沖液(pbsbuffer)，胃蛋白酶k，牛血清白蛋白(bsa)，三乙醇胺(tea)，tnbbuffer(0.1mtris-hcl，ph7.5，0.15mnacl，0.5％blockingreagent)，tntbuffer(0.1mtris-hcl，ph7.5，0.15mnacl，0.05％tween20)，醋酸酐，阻斷試劑(blockingreagentagent，roche公司)。

1.3其他主要試劑和材料

無水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松節(jié)油、雙蒸水、pbs緩沖液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo44.3mmol/l，kh2po41.4mmol/l)；3％甲醇-雙氧水溶液(80％甲醇和30％雙氧水配置)；0.01mol/l檸檬酸鹽緩沖液(citratebuffer,cb，ph6.0±0.1，9ml0.1m檸檬酸溶液和41ml0.1m檸檬酸鈉溶液加入450ml蒸餾水中臨時配置后再校正工作液ph值)；0.1％胰蛋白酶；蘇木素；1％鹽酸酒精(1ml濃鹽酸+99ml70％酒精配置)；封片膠(ptscuremountⅱ)；專用蓋玻片(480×240mm²)定制于鄭州玻璃儀器廠。leica低熔點(58℃)石蠟，國產(chǎn)蜂蠟，無水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/l,ph7.4，depc雙蒸水和pbs緩沖液配制)，蘇木素，伊紅，中性封片樹膠，蓋玻片，載玻片。1.4標記探針

利用3-tailingdigolignucleutidekit進行寡核苷酸探針標記，反應體系如下。

混勻，稍離心。37℃水浴反應30min，加2μledta(0.2m，ph8.0)中止反應。

1.5寡核苷酸探針標記后純化

為了增加標記探針的純度，需對已標記的探針進行純化，具體操作如下：

1)探針反應混合物(22μl)+2.5μl4mlicl+75μl100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g4℃離心15min。

4)棄上清，用50μl冰冷的70％(v/v)乙醇洗滌。

5)13.000xg4℃，離心5min。

6)棄上清，真空4℃干燥。

7)用無菌雙蒸水重溶探針。

1.6原位雜交檢測存檔石蠟切片中l(wèi)inc00472的表達

石蠟切片雜交前處理

1)4℃保存的石蠟切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蠟。

2)二甲苯依次脫蠟3×5min。

3)梯級酒精洗滌，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→depc水洗滌2×3min→depc-pbs洗滌2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶k(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入pbs(0.1mpbs+2mg/ml谷氨酸)洗滌1min，中止反應。

6)切片入0.2nhcl，于37℃反應20-30min，增加組織的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1mpbs溶解)后固定10min，室溫。

8)為了增加組織陽性雜交強度，對切片進行乙酰處理。切片入0.25％乙酸酐bufferⅰ(0.1m三乙醇胺)，室溫10min。

9)1mpbs洗滌2×5min。

預雜交和雜交

預雜交：-20℃保存的預雜交液，先置于37℃孵育60min，預雜交液的用量為50μl，石蠟膜履蓋切片，37℃濕盒中預雜交2小時。(預雜交液成份包括：2xssc，10％dextransulphate，1xdenhardt’ssolution，50mmphosphatebuffer(ph7.0)，50mmdtt，250μl，100μg/mlpolya，5μg/mlpolyda，250μg/mlyeastt-rna，500μg/mlssdna，47％deionizedformamide)。

1)移去石蠟膜，甩掉預雜交液，切片置于2×ssc中5min。

2)雜交反應：37℃雜交過夜(18-20h)。每一切片加入250μl雜交液并用石蠟膜履蓋。預雜交液中加入相應的探針就成為雜交液。雜交液在預雜交時配制，放置37℃孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實驗用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標記試劑盒標記探針濃度計算依據(jù)：每一探針的濃度按其與陽性定量探針時檢測反應時顯色進行比對和100pmol30個堿基的裸探針標記反應理論探針產(chǎn)量為900ng兩種標準進行綜合計算出標記探針的濃度。

3)雜交后洗滌，切片浸入2×ssc，10min，揭去石蠟膜。依次于搖床上搖動洗滌，2×ssc(0.5％sds)，2×15min→0.25×ssc(0.5％sds)，2×15min。

雜交后顯色檢測反應

1)采用anti-digoxigenin-pod檢測地高辛探針與mrna結(jié)合復合物；tsa放大系統(tǒng)增強原位雜交反應顯色反應的陽性信號，dab顯色。

2)切片轉(zhuǎn)至tnt緩沖液中，3×5min。

3)滴加tnb阻斷緩沖液，300μl/tmas，室溫，30min。

4)吸去多余阻斷劑，1:100稀釋的anti-digoxigenin-pod(tbs+0.1％tritonx-100+1％阻斷劑)，室溫4小時。

5)tntbuffer(0.1mtris-cl，ph7.5，0.15mnacl，0.05％tween20)洗滌，3x5min。

6)切片上滴加信號放大試劑biotinyltyamid，300μl/tmas，(biotinyltyramid貯存液：biotinyltyramid溶解于0.2mldmso，biotinyltyramid工作液：1×稀釋液，1:50稀釋biotinyltyramid貯存液)，室溫10分鐘。

7)tnt洗，3×5min。

8)切片滴加sa-hrp(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，300μl/tmas，室溫30min。

9)tnt洗，3×5min。

10)蒸溜水洗滌，1×1min。

11)dab顯色，顯微鏡下控制顯色反應。

12)蘇木素復染，

13)酒精梯級脫水，切片干燥。

14)滴加封片膠，相應規(guī)格的蓋玻片蓋片，紫外燈下交聯(lián)切片1min。

1.7結(jié)果判斷及標準

應用光學顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進行觀察，首先觀察目標rna的陽性表達信號在觀察目標細胞內(nèi)的定位：位于細胞核、細胞漿或細胞膜。

再分別以該檢測rna表達部位陽性信號的強度和陽性表達的細胞數(shù)兩種標準進行綜合評分，判斷標準為：(1)依據(jù)陽性細胞染色強度判斷：a.細胞無染色，記0分；b.細胞染成淺棕色為弱陽性，記1分；c.細胞染成棕色且無背景著色，或細胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽性，記2分；d.細胞染成深棕色且無背景著色為強陽性，記3分。(2)依據(jù)陽性細胞表達數(shù)計分：a.無陽性細胞表達，記0分；b.陽性表達細胞數(shù)≤25％，記1分；c.25％＜陽性細胞數(shù)＜50％，記2分；d.陽性表達細胞數(shù)≥50％，記3分。

為了盡量降低評分結(jié)果的主觀因素，由兩位病理學專家分別按上述標準之一各自進行判斷和評分，再將兩者評分相乘，結(jié)果為：①0分者最終計為0分，認為陰性表達；②1分和2分者最終計為1分，認為弱陽性表達；③3分和4分者最終計為2分，認為中等陽性表達；④6分到9分者最終計為3分，認為強陽性表達。

1.8分析和統(tǒng)計軟件

應用spss13.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用χ²test或fisherexacttest，相關(guān)性分析采用spearmencorrelation方法；p＜0.05即差異有統(tǒng)計學意義。生存曲線分析采用kaplan-meiermethod及l(fā)og-ranktest；多變量分析采用cox’sproportionalhazardsmodel；p＜0.05即差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1lncrnalinc00472鼻咽癌中的表達情況

lncrnalinc00472在正常鼻咽上皮中有表達(圖5左)，而在部分鼻咽癌組織中低表達或不表達(圖5右)。

2.2linc00472的表達與鼻咽癌患者預后的關(guān)系

我們對250例鼻咽癌患者進行了電話隨訪，詳細詢問了他們的首發(fā)時間、治療情況、有無復發(fā)、有無再患其他疾病、復發(fā)及死亡時間等，并登記了生存時間和狀態(tài)，并對鼻咽癌組織中l(wèi)ncrnalinc00472的表達與病人的生存時間和狀態(tài)進行的生存分析，發(fā)現(xiàn)linc00472高表達患者平均生存時間較linc00472表達低或者不表達的患者長(圖6)。說明linc00472是一個與鼻咽癌預后相關(guān)的分子標記，該lncrna表達低，病人預后差。

sequencelisting

<110>中南大學

<120>長鏈非編碼rnalinc00472的原位雜交探針、試劑及其應用

<130>無

<160>17

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>9515

<212>rna

<213>長鏈非編碼rnalinc00472的序列

<400>1

augcgaggcuggggccgguugccuaccggccgcuucucgccgaggcaguccagacuuuuc60

ccccggcggugcccgcuccaagacagcaucugucaacgcuccucuucuccccuccuccuc120

cugccgggccgggcuccgccggcugcggccgagaggacgcgggacccggcgcggugagcc180

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<213>含有酶切位點和保護性堿基的linc00472全長序列擴增下游引物

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