本發(fā)明屬于植物細胞組培技術領域，具體涉及一種微量抽測植物懸浮培養(yǎng)細胞液濃度的方法。

背景技術：

植物細胞懸浮培養(yǎng)過程中，細胞均勻分散在液體培養(yǎng)基中，營養(yǎng)利用率高、增殖速度快，并且懸浮培養(yǎng)的方式能夠利用大型生物反應器進行植物細胞及其代謝物的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。

植物細胞懸浮培養(yǎng)的收獲目標是植物細胞或其代謝物，然而植物細胞僅能在一定的濃度范圍內(nèi)保持較快的生長，所以對細胞液的濃度進行實時監(jiān)測具有重要意義。植物細胞多為胚性胚柄細胞團結構，且透明、較大、易沉淀，難以使用濁度法進行濃度測量。

目前，懸浮初代培養(yǎng)過程中，研究者多使用細胞沉降體積(scv)測量細胞生物量，進行定量研究，經(jīng)過多次培養(yǎng)后，植物細胞分散在細胞液中，細胞液濃度變稀、不易沉降；所以面對懸浮細胞繼代培養(yǎng)的低濃度、高分散的特點，定量測定細胞生物量更加難以進行。同時懸浮初代實驗中發(fā)現(xiàn)過濾稱重、測量細胞scv每次需要的細胞量多，測后就不能再繼續(xù)培養(yǎng)；測較長時間細胞的生長曲線時，再加上實驗重復的設計，需要做的實驗非常多。顯然，scv法測量細胞液的濃度還不能完全滿足需求。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種微量抽測植物懸浮培養(yǎng)細胞液濃度的方法，需要的細胞液少，可批量數(shù)據(jù)處理，節(jié)約時間和減少人工判斷誤差。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種微量抽測植物懸浮培養(yǎng)細胞液濃度的方法，步驟如下：

1)配制懸浮繼代細胞的系列標準濃度細胞液；染色，拍攝獲得圖片；

2)使用image-proplus軟件處理拍攝的圖片，獲得細胞液中染色細胞的面積數(shù)據(jù)；

3)將獲得的染色細胞面積數(shù)據(jù)與其標準濃度一一對應，繪制散點圖、標準曲線并得到回歸方程，并對標準曲線進行相關性評價；

4)建立植物懸浮培養(yǎng)細胞繼代培養(yǎng)的生長模型；

5)應用生長模型計算獲得懸浮培養(yǎng)細胞液濃度。

步驟1)中，配制懸浮繼代細胞的系列標準濃度細胞液；染色，拍攝獲得圖片；具體過程如下：

(1)收集13-1懸浮繼代的細胞，測量細胞鮮重并配制3g/30ml原始濃度細胞液，搖晃均勻，取0ml、2ml、4ml、6ml、8ml原始濃度液體，分別加無菌水至10ml，制成0g/ml、0.02g/ml、0.04g/ml、0.06g/ml、0.08g/ml、0.1g/ml的標準濃度細胞液；

(2)在超凈工作臺中對各濃度的細胞液各取0.1ml加到5ml的離心管中；使用0.2ml1％醋酸洋紅染色1-2個小時，加水洗去染色液，將洗凈后的細胞液倒入35mm直徑的培養(yǎng)皿中；在白色底板上放置一透明潔凈的60mm玻璃平皿蓋，將35mm培養(yǎng)皿中的細胞液置于平皿蓋上，每個標準濃度抽測6個樣，使用相機對每個樣拍攝清晰的細胞染色照片。

步驟2)中，使用image-proplus軟件處理拍攝的圖片，獲得細胞液中染色細胞的面積數(shù)據(jù)；具體過程如下：

(1)拍攝的照片中13-1懸浮細胞染成紅色，采用imageproplus6.0軟件打開拍攝的染色細胞照片；單擊measure>count/size>點選手動選色manul選項>點擊selectcolors>設置hsi取色模式改變s值范圍為88-255>單擊file保存命名取色設置數(shù)據(jù)；單擊measure>打開datacollector>設置輸出的選項為圖片名、目標數(shù)目、目標總面積；設置好選色和輸出數(shù)據(jù)后單擊count便可在datacollector中返回相應的數(shù)據(jù)；

(2)image-proplus制作相應的宏程序，批量處理拍攝獲得的圖片，獲得細胞液中染色細胞的面積數(shù)據(jù)。

步驟2)中，制作批量處理的宏程序過程如下：設置datacollector參數(shù)同上>隨機打開一張圖片>單擊macro>單擊recordmacro>對macro命名>對打開的圖片加載保存命名的取色文件，單擊count>結束宏記錄>將記錄下的宏語句復制粘貼到預制的宏processdirectory的第121行后面并保存；當需要對文件夾中的圖片進行處理時，選中修改后的processdirectory并運行，按照提示選中文件夾中的第一張照片，就可以自動處理其他的照片并將數(shù)據(jù)返回到datacollector中。

步驟3)中，繪制標準曲線，并得到回歸方程，回歸方程為y＝0.0076x，線性相關系數(shù)r²＝0.968。

步驟4)中，建立的生長模型的曲線方程為：

式中，x代表培養(yǎng)的時間，y代表細胞液濃度。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的微量抽測植物懸浮培養(yǎng)細胞液濃度的方法具有以下優(yōu)點：

1)采用微量抽測的方式測量細胞液濃度，每次僅需吸取0.1ml的待測細胞液，控制無菌的條件下該細胞液仍可繼續(xù)培養(yǎng)增殖；本方法使用image-proplus進行計數(shù)，可批量數(shù)據(jù)處理節(jié)約時間和減少人工判斷誤差。

2)通過單位面積平皿中懸浮細胞所占的面積，換算出植物細胞液的濃度，每次僅需要抽測0.1ml的懸浮液，在無菌操作下其他的細胞液仍然能夠繼續(xù)培養(yǎng)，以供不同培養(yǎng)時間的測量，以及繼續(xù)生產(chǎn)。通過該方法制作的細胞濃度與image-proplus提取的面積數(shù)據(jù)線性相關，其相關性系數(shù)r²＝0.968，具有極高的相關性。

3)針對抗性赤松繼代懸浮細胞符合種群生長的特點，初期主要受種群數(shù)量影響，后期受到環(huán)境條件限制，穩(wěn)定于環(huán)境最大容納量；使用懸浮微測的方法，測量懸浮繼代培養(yǎng)22天的細胞生長曲線，并借助spss17.0進行曲線擬合，其中s型曲線的擬合度最高r²＝0.918，并得到相應的生長曲線方程；使用微量抽測的方法連續(xù)監(jiān)測懸浮細胞生長濃度的變化僅需要培養(yǎng)3瓶細胞液，而且能夠測量早期細胞較稀時的細胞濃度，節(jié)約了試驗成本提高了試驗研究效率。

附圖說明

圖1是拍攝抗性赤松13-1細胞染色照片圖；

圖2是抗性赤松懸浮細胞濃度與染色面積標準曲線圖；

圖3是抗性赤松懸浮細胞的生長曲線模型圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

以下實施例中，以2003年吳靜誘導出的抗性赤松胚性細胞團13-1懸浮培養(yǎng)多次的懸浮細胞為材料[吳靜，朱麗華，許建秀，吳小芹，葉建仁(2015).抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導及增殖.南京林業(yè)大學學報(自然科學版),39(01):17-21doi10.3969/j.issn.1000-2006.2015.01.004]；培養(yǎng)瓶為無菌封口的250ml錐形瓶，每瓶細胞液的量為60ml；細胞液在infors恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，設置培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速90rpm。

實施例1

一種微量抽測植物懸浮培養(yǎng)細胞液濃度的方法，步驟如下：

(1)收集13-1懸浮繼代的細胞，測量細胞鮮重并配制3g/30ml原始濃度細胞液，搖晃均勻，取0ml、2ml、4ml、6ml、8ml原始濃度液體，分別加無菌水至10ml，制成0g/ml、0.02g/ml、0.04g/ml、0.06g/ml、0.08g/ml、0.1g/ml的標準濃度細胞液。

(2)在超凈工作臺中對各濃度的細胞液各取0.1ml加到5ml的離心管中；使用0.2ml1％醋酸洋紅染色1-2個小時，加水洗去染色液，將洗后的細胞液倒入35mm直徑的培養(yǎng)皿中。在白色底板上放置一透明潔凈的60mm玻璃平皿蓋，將35mm培養(yǎng)皿中的細胞液置于平皿蓋上，每個標準濃度抽測6個樣，使用尼康相機對每個樣拍攝清晰的細胞染色照片。

圖1是拍攝抗性赤松13-1細胞染色照片，圖a為拍攝時為使染色細胞更好的顯色出來，將35mm平皿置于皿蓋與白底上；圖b為使用尼康相機拍攝的小平皿中染色細胞的照片。

(3)拍攝的照片中13-1懸浮細胞染成紅色，采用imageproplus6.0軟件[image-proplus(以下簡稱image-proplus)是image-pro系列中的一款商業(yè)軟件(http://www.mediacy.com)]打開拍攝的染色細胞照片；單擊measure>count/size>點選手動選色manul選項>點擊selectcolors>設置hsi取色模式改變s值范圍為88-255>單擊file保存命名取色設置數(shù)據(jù)；單擊measure>打開datacollector>設置輸出的選項為圖片名(name)、目標數(shù)目(objectcount)、目標總面積(arearangesum)；設置好選色和輸出數(shù)據(jù)后單擊count便可在datacollector中返回相應的數(shù)據(jù)。

(4)image-proplus可制作相應的宏，批量處理文件夾中的照片；設置datacollector參數(shù)同上>隨機打開一張圖片>單擊macro>單擊recordmacro>對macro命名>對打開的圖片加載保存命名的取色文件，單擊count>結束宏記錄>將記錄下的宏語句復制粘貼到預制的宏processdirectory的第121行后面并保存；當需要對文件夾中的圖片進行處理時，選中修改后的processdirectory并運行，按照提示選中文件夾中的第一張照片，就可以自動處理其他的照片并將數(shù)據(jù)返回到datacollector中。

(5)將獲得的image-proplus染色細胞面積數(shù)據(jù)與其標準濃度一一對應，繪制散點圖、標準曲線并得到回歸方程，并對標準曲線進行相關性評價。

(6)利用該方法建立抗性赤松13-1懸浮繼代培養(yǎng)的生長模型

取過篩后0.6g繼代過5次的13-1細胞團，放置在裝有60ml營養(yǎng)液的250ml錐形瓶中；測量培養(yǎng)2、4、6…18、22天的細胞團染色image-proplus面積，每次抽測6組細胞液樣品；采用上述拍攝細胞染色照片和提取面積數(shù)據(jù)的方法，得到個樣品的染色細胞面積；通過制作的標準曲線回歸方程，換算出細胞液的濃度；使用spss17.0進行線性、s型曲線和logistics曲線的模擬，并建立抗性赤松13-1胚性細胞的生長模型。

上述方法獲得的具體結果如下：

1)懸浮細胞濃度標準曲線的繪制

配制的標準濃度梯度的細胞液，各濃度梯度吸取0.1ml細胞液為一個重復，每個濃度梯度設置6個重復，通過image-proplus對每個濃度梯度的6個重復進行計算，提取該樣品中的細胞染色面積，通過excel2007做出染色面積與濃度的標準曲線，并求出回歸方程。

從圖2中可以看出，染色面積與細胞濃度的線性相關較高r²＝0.968，回歸方程為y＝0.0076x，該回歸方程具有較強的線性關系。

2)懸浮細胞的生長曲線繪制

圖3是抗性赤松懸浮細胞的生長曲線模型，橫坐標為培養(yǎng)的時間，縱坐標為相應的細胞濃度；使用線性(linear標志曲線，r²＝0.690)、s型曲線(s標志曲線，r²＝0.918)、邏輯斯特方程(logistics標志曲線，r²＝0.685)模擬懸浮細胞生長變化，其中s曲線的模擬效果最好r²＝0.918。

可見，繼代5次后細胞生物量隨培養(yǎng)時間的變化，使用image-proplus進行細胞微測，得到不同培養(yǎng)時間下初始接種濃度為0.6g/60ml的細胞濃度，在spss17.0中用線型、s型和logistics曲線模型擬合抗性赤松懸浮培養(yǎng)繼代第五次的生長數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)s型曲線的擬合效果最好r²＝0,918，相應的曲線方程為：

式中，x代表培養(yǎng)的時間，單位是天，y代表細胞液濃度，單位是gm/ml。

可見，本發(fā)明通過image-proplus對懸浮植物細胞生長量進行微量抽測。該方法通過單位面積平皿中懸浮細胞所占的面積，換算出植物細胞液的濃度，每次僅需要抽測0.1ml的懸浮液，在無菌操作下其他的細胞液仍然能夠繼續(xù)培養(yǎng)，以供不同培養(yǎng)時間的測量，以及繼續(xù)生產(chǎn)。通過該方法制作的細胞濃度與image-proplus提取的面積數(shù)據(jù)線性相關，其相關性系數(shù)r²＝0.968，具有極高的相關性。