本發(fā)明涉及一種蠶絲蛋白的制備方法，具體涉及一種用于護膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，屬于生物高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蠶絲是高分子動物蛋白(絲素蛋白)，富含18種氨基酸，具有保濕、透氣、抗菌、防靜電、防紫外線等優(yōu)良特性。早在明代，李時珍在其醫(yī)學巨著《本草綱目》中就記載了蠶絲的美容護膚作用。隨著科技的進步與發(fā)展，人們對蠶絲蛋白的認識越來越深入，蠶絲新用途的研究與開發(fā)受到人們的高度關(guān)注。

天然蠶絲素蛋白分子量較大，約350000da(道爾頓)，以纖維狀存在，不適合直接用于護膚品或化妝品的原料。目前常規(guī)的方法，是將生絲原料(蠶繭或廢絲)通過精煉除膠后置于溴化鋰、硝酸鎂和氯化鈣之類的高濃度溶解性鹽中加熱溶解，然后進行過濾和透析脫鹽等處理過程，使得絲纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到破壞，成為絲蛋白水溶液。所得的絲素蛋白分子量在100000da以上，而且重金屬含量較高，直接用于護膚品原料，一方面絲素蛋白分子量較大，肌膚的吸收效率低，影響美容護膚效果；另一方面，由于重金屬含量較高影響到產(chǎn)品的使用安全，如中國專利cn201510071886.3公開的“一種家蠶絲素蛋白溶液制備及鑒定方法”，中國專利cn201410352789.7公開了的“一種陽離子化絲素蛋白及其制備方法”等。

有報道利用蛋白酶水解蠶絲蛋白，主要有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等對蠶絲蛋白進行酶解，如，徐瑩、何國慶“bacillussp.el31410產(chǎn)彈性蛋白水解絲素蛋白特性的研究”(食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，6:28-29)報道，彈性蛋白酶水解絲素蛋白的最適作用溫度是45-55℃，最適ph是9.0，水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量主要在1000d以上，以大分子的多肽物質(zhì)為主，技術(shù)工藝要求高，流程復雜，可控程度低。代君君等“木瓜蛋白酶的降解作用研究”(北方蠶業(yè)，2015，09：11-13)表明ph8-9、溫度60-70℃，木瓜蛋白酶的活性為20-25u時絲素蛋白水解效果較好，酶的作用時間越長效果越好，但所得產(chǎn)物為混合物，有氨基酸、小肽、多肽及部分大分子蛋白質(zhì)。張桂征等“一株放線菌對絲素纖維的降解作用”(蠶業(yè)科學，2007，33:241-245)，培養(yǎng)42d時，絲素纖維已完全降解，所得產(chǎn)物以小分子的氨基酸為主，寡肽含量比例在10％以下。研究表明，小分子或氨基酸類物質(zhì)有利于胃腸道的吸收，低聚肽(分子量800-500da)分子有利于肌膚的吸收。為開發(fā)蠶絲美容護膚品，蠶絲低聚肽制備技術(shù)尤為關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于護膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，運用堿性蛋白酶和放線菌酶雙酶解，并結(jié)合膜分離技術(shù)，通過嚴格控制用酶量和酶解條件制備蠶絲素低聚肽。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的用于護膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，包括以下制備步驟：

(1)脫膠：取蠶繭用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠30-40min，然后用清水洗滌，重復浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或烘干，得到脫膠蠶絲，所述蠶繭與na2co3溶液的固液質(zhì)量比為1:200，；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解20-30min，冷卻后離心20-30min，得到鹽解液，所述脫膠蠶絲與cacl2溶液的固液質(zhì)量比為1:20；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比(100-110):1將復合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解60-70min，得到絲素酶解液，所述復合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比堿性蛋白酶:放線菌酶＝(2.0-2.5):1混合而成；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進行濃縮，用雙蒸水進行梯度洗脫，然后用膜分離柱進行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

步驟(1)所述烘干溫度為60-70℃。步驟(2)所述離心轉(zhuǎn)速為3500-4000r/min。步驟(4)所述堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u。步驟(6)所述膜分離柱為葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15。

有益效果：(1)提取物產(chǎn)出率高，1g蠶絲可以提取0.513g蠶絲素低聚肽粉末。

(2)絲素低聚肽分子量集中，93％以上集中在800-500da之間。

(3)絲素低聚肽生物學活性高，易被肌膚吸收，體現(xiàn)出良好的保濕、抗菌、抗氧化、抗紫外損傷等功能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；

圖2為脫膠蠶絲電子顯微鏡掃描圖；

圖3為雙酶解蠶絲電子顯微鏡掃描圖。

具體實施方式

下面通過實施例的方式對本發(fā)明進行進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不因此局限于下述實施例，而是由本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書限定。

實施例1

一種用于護膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，制備步驟如下：

(1)脫膠：將蠶繭剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠30min，固液質(zhì)量比為1:200，然后用清水洗滌，重復浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或60℃烘干，得到脫膠蠶絲；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解20min，固液質(zhì)量比為1:20，冷卻后以轉(zhuǎn)速3500r/min離心20min，得到鹽解液；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比100:1將復合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解60min，得到絲素酶解液，所述復合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比2:1混合而成，堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進行濃縮，用雙蒸水進行梯度洗脫，然后用葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15進行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

實施例2

一種用于護膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，制備步驟如下：

(1)脫膠：將蠶繭剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠35min，固液質(zhì)量比為1:200，然后用清水洗滌，重復浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或65℃烘干，得到脫膠蠶絲；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解25min，固液質(zhì)量比為1:20，冷卻后以轉(zhuǎn)速3800r/min離心25min，得到鹽解液；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比105:1將復合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解65min，得到絲素酶解液，所述復合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比2:1混合而成，堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進行濃縮，用雙蒸水進行梯度洗脫，然后用葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15進行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

實施例3

一種用于護膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，制備步驟如下：

(1)脫膠：將蠶繭剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠40min，固液質(zhì)量比為1:200，然后用清水洗滌，重復浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或70℃烘干，得到脫膠蠶絲；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解30min，固液質(zhì)量比為1:20，冷卻后以轉(zhuǎn)速4000r/min離心30min，得到鹽解液；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比110:1將復合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解70min，得到絲素酶解液，所述復合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比2.5:1混合而成，堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進行濃縮，用雙蒸水進行梯度洗脫，然后用葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15進行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

實施例中蠶絲素低聚肽的分子量分布的測定方法采用高效凝膠過濾色譜法，測試結(jié)果表明本發(fā)明提供的蠶絲素低聚肽的相對分子質(zhì)量主要集中在800-500da，低聚肽含量超過93％。

實施例1獲得的蠶絲素低聚肽經(jīng)sem電鏡掃描；圖2為脫膠后蠶絲的電鏡掃描結(jié)果，蠶絲結(jié)構(gòu)完整，分子量大；圖3為脫膠蠶絲經(jīng)雙酶解處理后的蠶絲結(jié)構(gòu)，蠶絲被分解成細碎的顆粒狀，大小相對均勻。