本發(fā)明涉及從中草藥中提取多糖的技術領域，更具體而言，涉及一種β-1,3-葡聚糖、其制備方法及在治療阿爾茲海默癥中的應用。

背景技術：

赤靈芝(Ganoderma lucidum)，別名紅芝、木靈芝、萬年蕈、靈芝草等，屬于擔子菌綱(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyparaceae)，靈芝屬(Ganoderma)，是一種藥、食兩用高等真菌。赤靈芝主要含有三萜、多糖與多糖綴合物、甾醇及脂肪酸等成分，尤其是前兩類，一般被認為是赤靈芝的主要活性物質(zhì)，可作為赤靈芝的特征性化學成分?，F(xiàn)代藥理學研究表明，赤靈芝具有多種重要的功能，如抗腫瘤、抗炎、降血壓、降血糖和鎮(zhèn)靜作用等，同時它還有扶正固本、強身健體和延緩衰老等保健功效。對赤靈芝孢子粉的初步研究表明，其中的多糖類成分可能是孢子粉的免疫調(diào)節(jié)、提高機體耐缺氧能力、鎮(zhèn)靜和抗炎等藥理作用的物質(zhì)基礎。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)亦稱為早老性癡呆，是一種慢性進行性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進性的記憶能力下降，認知功能障礙以及失去生活獨立自理能力。隨著人口老齡化的不斷加劇，AD的發(fā)病率也逐年升高，已成為最重要的公眾關注健康問題之一。

研究表明靈芝來源多糖對阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型大鼠腦組織有保護作用。晏濤等人(晏濤,陳世保,徐蕾,楊麗,陳龍菊，“靈芝多糖對阿爾茨海默病大鼠學習記憶和氧化應激的影響”，《陜西醫(yī)學雜志》，第40卷第4期，第387-389頁，2011年)通過向大鼠雙側海馬注射Aβ1～40建立大鼠阿爾茲海默病模型，并研究靈芝多糖對AD大鼠的學習記憶能力和氧化應激的影響，結果顯示，與模型組大鼠相比，經(jīng)靈芝多糖治療后，大鼠的認知能力有所提高，其機理可能是通過減少氧自由基的損傷從而提高AD大鼠學習記憶能力。裴鋼等人之前也發(fā)現(xiàn)靈芝多糖粗糖給藥能顯著改善AD模型小鼠的學習記憶能力。然而由于靈芝多糖結構復雜且與分離手段相關，目前用于AD模型實驗中的靈芝多糖其發(fā)揮功效的結構基礎尚不明確，這在一定程度上影響了靈芝多糖進一步的開發(fā)利用。

因此，進一步闡明靈芝多糖治療AD的物質(zhì)基礎，將會使靈芝多糖在營養(yǎng)保健、藥物研發(fā)等方面得到更廣泛的應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種靈芝多糖，其可用于治療阿爾茨海默癥，并公開了其制備方法和用途。

一方面，本發(fā)明提供一種β-1,3-葡聚糖GPW1，其結構式如下：

其中，n＝5～100，所述β-1,3-葡聚糖GPW1的重均分子量范圍為5-100kDa，優(yōu)選為10-80kDa，更優(yōu)選為10-40kDa。

另一方面，本發(fā)明提供所述β-1,3-葡聚糖GPW1的制備方法，其包括以下步驟：

a.多糖提?。焊稍锏某囔`芝孢子粉經(jīng)乙醇脫脂、水提，過濾并將所得濾液濃縮，透析，濃縮，醇沉，離心，洗滌，真空干燥得水提赤靈芝孢子粉粗多糖；以及

b.多糖純化：將步驟a中制備的所述赤靈芝孢子粉粗多糖先用DEAE纖維素陰離子柱進行初步分級，水洗脫得中性多糖組分，進而用S300凝膠色譜柱純化，得到所述β-1,3-葡聚糖。

更具體地，本發(fā)明提供了一種從赤靈芝孢子粉中提取β-1,3-葡聚糖的方法，該方法包括以下步驟：

a.多糖提?。焊稍锏某囔`芝孢子粉經(jīng)乙醇(例如，95％乙醇)脫脂，風干，加入蒸餾水，加熱條件下提取，過濾，殘渣再次用去離子水提取，如此反復提取2～6次，濾液合并，加熱濃縮，加入3～4倍于濃縮液體積的乙醇，離心得沉淀，沉淀經(jīng)洗滌(例如，經(jīng)無水乙醇和丙酮洗滌)、真空干燥得水提赤靈芝孢子粉粗多糖；以及

b.多糖純化：取步驟a中制備的赤靈芝孢子粉粗多糖，水溶解，離心，上清液通過DEAE纖維素陰離子柱進行分離，以蒸餾水洗脫，硫酸-苯酚檢測，收取合并洗脫液，濃縮冷凍干燥得水洗脫組分，進而采用S300凝膠色譜柱分離，純化得GPW1組分。

對以上制備方法得到的GPW1組分進行結構鑒定，結果如下：

分子量

經(jīng)高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定，GPW1組分的相對分子質(zhì)量為15kDa。

組成和結構

對上述GPW1組分進行糖組成分析，即將多糖完全水解、還原、乙酰化、萃取、濃縮后進行GC分析。糖組成分析結果顯示，GPW1多糖只含葡萄糖。然后用碘甲烷進行反應至多糖完全甲基化，再完全酸水解、還原。乙?；?、萃取、濃縮后用GC-MS分析。結合紅外和核磁共振分析和甲基化結果，推測其一級結構為β構型的葡聚糖，其主鏈由1,3-連接的葡聚糖組成，側鏈內(nèi)部由1,6-連接的葡萄糖殘基組成，通過1→6糖苷鍵取代于分支點的O-6上。

再一方面，本發(fā)明公開了所述β-1,3-葡聚糖GPW1在制備用于促進神經(jīng)干細胞生長的藥物中的用途。

最后，本發(fā)明公開了所述β-1,3-葡聚糖GPW1在制備用于治療阿爾茲海默癥的藥物中的用途。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的β-1,3-葡聚糖GPW1的高效凝膠色譜圖。

圖2為本發(fā)明的β-1,3-葡聚糖GPW1的紅外譜圖。

圖3為灌注本發(fā)明的β-1,3-葡聚糖GPW1的阿爾茨海默癥模型小鼠的水迷宮實驗結果(其中，WT+Veh為給安慰劑的野生型陰性對照組，AD+Veh為給安慰劑的AD小鼠，AD+GPW1為給β-1,3-葡聚糖GPW1的AD小鼠)。

圖4顯示β-1,3-葡聚糖GPW1對神經(jīng)干細胞生長的影響。

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。

制備實施例：β-1,3-葡聚糖GPW1的制備

a.多糖提?。?/p>

取1.35kg破壁赤靈芝孢子粉，加20L 95％乙醇，浸泡一周。浸泡完畢，離心，固體物置于室溫通風處晾干。然后用沸水提取，每次加蒸餾水約30L，提取時間為5h，用苯酚-硫酸法檢測提取液的糖含量，直至糖顯色反應不明顯，共計提取6次。每次提取、離心得到的清液合并、濃縮至較小體積，加95％乙醇至溶液的乙醇終濃度為80％，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀物經(jīng)無水乙醇和丙酮洗滌，真空干燥得28.2g靈芝孢子粉水提粗多糖(GP)。

b.多糖純化：

取赤靈芝孢子粉水提粗多糖(GP)，加適量蒸餾水并加熱溶解，離心，上清液用DEAE-纖維素陰離子交換柱(美國GE公司)(5.0cm×50cm，Cl-型)進行初步分離。以蒸餾水作洗脫液，自動部分收集器分部收集流分，4mL/管，硫酸-苯酚法檢測，根據(jù)糖顯色反應結果合并相同流分，得到1個洗脫峰位，洗脫液分別減壓濃縮至適當體積，對蒸餾水透析，對透析袋內(nèi)液減壓濃縮并冷凍干燥，所得產(chǎn)物命名為GPW(12.9g)。GPW用EZ Purifier半制備型色譜系統(tǒng)和Hiprep Sephacryl S-300柱(美國GE公司)進一步純化，獲得一個均一的多糖GPW1。

實驗實施例1：多糖結構解析

經(jīng)高效凝膠色譜法析(HPGPC)分析表明GPW1的分子量為15kDa，其純度測定參見圖1。

糖組成分析表明GPW1為一葡聚糖。紅外圖譜(圖2)顯示，GPW1具有一般多糖在紅外光譜中的特征性結構：3405.7cm^-1處的強吸收峰是糖分子中O-H鍵的伸縮振動吸收，2923.6cm^-1處的峰是C-H鍵的伸縮振動吸收，1650.8cm^-1處的峰是糖分子中結合水的吸收，894.8cm^-1的峰是β-葡聚糖的特征吸收峰。另外，紅外光譜在1730cm^-1附近無糖醛酸對應的吸收峰，表明該多糖不含糖醛酸。該多糖經(jīng)硼氫化鈉還原、乙?；筠D(zhuǎn)變?yōu)椴糠旨谆奶谴家宜狨?PMAA)，進行GC-MS分析，結果如下表1所示。該多糖含有非還原末端、1,6-、1,3-及1,3,6-連接的葡萄糖的4種連接方式，其比例為1∶1∶3∶1。非還原末端及1,3,6-連接葡萄糖的存在說明該多糖具有分支，根據(jù)甲基化后各殘基摩爾比分析的結果，可以確定GPW1的主鏈由1,3-連接的葡萄糖組成，每6個單糖殘基組成的重復單元中含有一個分支，平均單位鏈長度約為6。側鏈由1,6-連接的葡萄糖殘基構成，連接在1,3-連接的葡萄糖殘基的O-6上。

表1

以上結果表明GPW1的結構為：

實驗實施例2：水迷宮實驗

選用5-6月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠20只(The Jackson Laboratory,美國)，按隨機數(shù)字表法分為模型組及多糖給藥組，靈芝多糖采用灌胃給藥方式，每天給藥，同時用非轉(zhuǎn)基因小鼠10只作為陰性對照組，連續(xù)給藥90天后，利用Morris水迷宮行為學實驗來檢測靈芝多糖對APP/PS1小鼠的學習，認知功能的影響。本實驗采用的是經(jīng)典Morris水迷宮測試程序，包括兩部分，即定位航行試驗和空間探索試驗實驗，共進行7天，第4天和第7天加入空間探索試驗。

從實驗結果(圖3)可知，此次定位航行實驗，3組動物經(jīng)過3天訓練，其逃避潛伏期均縮短，說明各小鼠均能順利完成水迷宮的空間學習任務。以逃避潛伏期作為檢測指標。經(jīng)過7天訓練后，結果顯示：對照組小鼠反應比較迅速，入水后能快速找到平臺，隨著訓練次數(shù)增加，尋找平臺的潛伏期時間縮短；而模型組小鼠反應遲鈍，入水后沿桶壁有畫圈行為，無逃避行為，人為將其引領平臺后，又跳入水中，經(jīng)多次訓練后，最終找到平臺，但尋找平臺潛伏期明顯延長；給藥組小鼠隨著訓練次數(shù)的增加，尋找平臺的能力不斷提高。以上3組都具有一定的空間記憶能力，模型組小鼠的潛伏期成績比對照組差，提示模型組小鼠學習記憶能力出現(xiàn)下降，模型鼠較好地模擬了AD的學習記憶障礙。給藥組小鼠潛伏期與模型組相比有顯著差異具有統(tǒng)計學意義，可見GPW1給藥后AD小鼠學習和記憶能力有明顯改善。

實驗實施例3：對神經(jīng)干細胞生長的影響

在含有20ng/ml表皮生長因子(EGF,美國Invitrogen公司)和20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,美國Invitrogen公司)的NeuroCult神經(jīng)干細胞(STEMCELL)培養(yǎng)基中培養(yǎng)成年小鼠神經(jīng)干細胞，采用不同濃度的GPW1處理細胞6天后，進行細胞計數(shù)。

實驗結果如圖4所示：GPW1在100ug/ml的濃度下，可顯著促進神經(jīng)干細胞的生長，且在10ug/ml-100ug/ml的濃度范圍內(nèi)，具有線性關系。

綜上，本發(fā)明人從赤靈芝孢子粉中分離純化得到均一的β-1,3-葡聚糖GPW1，其可顯著改善AD小鼠的學習和記憶能力，并且具有促進神經(jīng)干細胞生長作用，具有開發(fā)為治療AD的糖類藥物的應用價值。