本發(fā)明屬于藥物合成和藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及2-乳酰氨基苯甲酸的制備方法與應(yīng)用，具體涉及(R)-2-乳酰氨基苯甲酸(R-HPABA)和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(S-HPABA)的制備方法和新的醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

眾所周知，手性化合物雖然具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但它們的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)(吸收、分布、代謝和排泄)甚至毒理學(xué)特性可能會不同，尤其這些過程涉及到與一些生物大分子(酶、載體、受體等)發(fā)生相互作用時，手性化合物的不同對映體可能會表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。

目前已有很多抗血栓藥物被開發(fā)和應(yīng)用，根據(jù)作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制的不同分為抗血小板凝集藥、抗凝血藥和溶栓藥。其中阿司匹林和氯吡格雷是臨床公認(rèn)用于治療血小板凝集相關(guān)疾病的藥物，如在治療血栓和動脈粥樣硬化方面療效均較好。上述類似藥物在抗血栓方面已有大量研究且已在臨床上被長期應(yīng)用，但存在治療窗窄、出血風(fēng)險、藥物抵抗等副作用，同時其他意想不到的藥物相互作用也一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

2-乳酰氨基苯甲酸是從微生物的代謝產(chǎn)物中提取分離得到的新化合物，并可以通過化學(xué)合成的方法得到，卻沒有像阿司匹林一樣的胃腸道無刺激作用，有可喜的醫(yī)療用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的制備方法。

本發(fā)明的目的在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的一種新的醫(yī)療用途。

本發(fā)明的目的還在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸一對手性對映體新的藥理活性。

本發(fā)明的再一個目的在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸在制備抗血小板凝聚或抗血栓藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了具有如下通式的苯甲酸類化合物：

式中，R₁＝—H；—Na；—(CH₂)_n—CH₃(n＝0～3)

R₂＝—H；—CH₃；—(CH₂)_n—CH₃(n＝0～2)

R₃＝—H；—F；—Cl；—Br

R₄＝—H；—F；—Cl；—Br

R₅＝—H；—F；—Cl；—Br。

具體地，本發(fā)明提供了如下結(jié)構(gòu)的化合物(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸，英文名為R-/S-2-lactoylaminobenzoic acid：

所述(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸分別為：

本發(fā)明所提供的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸，其合成方法具體步驟如下：

(a)L-乳酸(IIa)或D-乳酸(IIb)與乙酰氯(III)在無水四氫呋喃或者乙酸酐中作用得到中間體(IV)，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間分別為10～40℃和2～15小時，L-乳酸(或D-乳酸)與乙酰氯物質(zhì)的量比為0.3～0.5:1；

(b)中間體(IVa，IVb)與氯化亞砜作用得到中間體(Va，Vb)，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為40～80℃和1～4小時；

(c)中間體(Va，Vb)與鄰氨基苯甲酸甲酯(VI)在無水乙醚條件下反應(yīng)生成中間體(VIIa，VIIb)，兩者物質(zhì)的量比為1～3:5，反應(yīng)溫度10～40℃，反應(yīng)時間1～24小時；

(d)中間體(VIIa，VIIb)與碳酸鉀溶液在甲醇中反應(yīng)得到中間體(VIIIa，VIIIb)，中間體(VIIIa，VIIIb)與氫氧化鈉溶液在四氫呋喃中反應(yīng)得到R-/S-HPABA(Ia，Ib)，反應(yīng)溫度15～35℃，反應(yīng)時間1～20小時；或者中間體(VIIa，VIIb)與氫氧化鈉溶液在四氫呋喃和甲醇中反應(yīng)直接得到R-/S-HPABA(Ia，Ib)，反應(yīng)溫度10～40℃，反應(yīng)時間1～24小時。

上述步驟(d)中，有兩種方法可以得到2-乳酰氨基苯甲酸；兩種方法所用有機(jī)溶劑均為四氫呋喃和甲醇，前者與碳酸鉀溶液反應(yīng)，物質(zhì)的量比為1～2:5；后者與氫氧化鈉溶液反應(yīng)，物質(zhì)的量比為1～2:5。

上述步驟(d)中，反應(yīng)完全后用二氯甲烷萃取并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～4。

上述合成方法中，所涉及的原料、中間體及反應(yīng)路線如下：

本發(fā)明中，所述的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有顯著的抗血小板凝集和抗血栓活性。且其制備原料來源廣泛，成本不高，對胃無刺激作用，和阿司匹林相比具有較強(qiáng)優(yōu)勢，有十分喜人的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為(R)-2-乳酰氨基苯甲酸、(S)-2-乳酰氨基苯甲酸血小板毒性圖。

圖2為(R)-2-乳酰氨基苯甲酸、(S)-2-乳酰氨基苯甲酸對環(huán)氧酶-1(COX-1)活性影響圖。

具體實(shí)施方式

以下以具體實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但并不意味著限制本發(fā)明。

實(shí)施例1.(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的化學(xué)合成制備

1.1試劑：L-乳酸、鄰氨基苯甲酸甲酯、乙酰氯、氯化亞砜、四氫呋喃、無水乙醚、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯

1.2合成方法：

1.2.1中間體(IVa)的合成

取L-乳酸12.0g(133.3mmol)于250ml三口反應(yīng)瓶中，加入無水四氫呋喃24ml，-10～0℃攪拌下滴加乙酰氯19.2ml(266.6mmol)后，室溫攪拌5h，35℃減壓濃縮得無色油狀液體14.6g，收率83.2％。

1.2.2中間體(Va)的合成

取中間體(IVa)14.6g(110.6mmol)于250ml反應(yīng)瓶中，加入氯化亞砜48ml，50℃反應(yīng)2h，40℃減壓濃縮得淡黃色油狀液體15.6g，收率93.7％。

1.2.3中間體(VIIa)的合成

取鄰氨基苯甲酸甲酯(VI)60.0g(395.8mmol)于500ml反應(yīng)瓶中，加入無水乙醚150ml，-10～0℃攪拌下加入中間體(Ⅴa)15.6g(103.7mmol)，室溫攪拌3h后，抽濾，濾液依次用鹽酸、水、飽和氯化鈉洗滌，減壓濃縮得淡黃色結(jié)晶24.7g，收率89.9％。

1.2.4(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(Ia)的合成

取中間體(VIIa)12.0g(45.28mmol)于250ml反應(yīng)瓶中，加入甲醇60ml，室溫滴加碳酸鉀溶液后攪拌2h，乙酸乙酯150ml萃取3次，合并有機(jī)相，減壓濃縮得中間體(VIIIa)，即2-乳酰胺基苯甲酸甲酯9.0g，收率89.1％，MS(ESI)：m/z＝223.0624；取中間體(VIIIa)9.0g(40.36mmol)于250ml反應(yīng)瓶中，加入四氫呋喃60ml，室溫滴加氫氧化鈉溶液后攪拌1.5h，二氯甲烷150ml萃取3次，棄去二氯甲烷萃取液，水相用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～4，靜置析出結(jié)晶，抽濾，干燥，得2-乳酸氨基苯甲酸7.51g，收率88.9％。

取中間體(VIIa)12.7g(47.92mmol)于500ml反應(yīng)瓶中，加入四氫呋喃60ml、甲醇40ml，室溫滴加氫氧化鈉溶液后攪拌3h，二氯甲烷200ml萃取3次，棄去二氯甲烷萃取液，水相用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～4，靜置析出結(jié)晶，抽濾，干燥，得S-2-乳酸氨基苯甲酸8.79g，收率87.8％。

表1.(S)-2-乳酰氨基苯甲酸¹H-NMR及¹³C-NMR譜

MS數(shù)據(jù)：對于該化合物來說，其高分辨質(zhì)譜給出分子離子峰ESI-MS(positive ion mode):232.0582[M+Na]⁺，分子式：C₁₀H₁₁O₄N。

實(shí)施例2.(R)-2-乳酰氨基苯甲酸的化學(xué)合成制備

方法除L-乳酸替換成D-乳酸外，其余與1.2合成方法相同，按照S-2-乳酸氨基苯甲酸的合成方法，得到R-2-乳酸氨基苯甲酸8.50g，總收率52.9％。

實(shí)施例3.(R)-2-乳酰氨基苯甲酸、(S)-2-乳酰氨基苯甲酸抗血小板凝聚活性研究

3.1試劑

阿司匹林(ASP，純度＞99.5％)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光學(xué)純度＞99.3％)，(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光學(xué)純度＞98.8％)，二甲基亞砜(DMSO),二磷酸腺苷(ADP)，膠原(COLL)，花生四烯酸(AA)，血栓素B₂(TXB₂)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，環(huán)氧酶-1(COX-1)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。

3.2實(shí)驗動物

日本大耳白兔，雄性，SPF級，體重2-3kg，SCXK2014-0002。

KM小鼠，雄性，SPF級，體重18-22g，SCXK2015-0001。

SD大鼠，雄性，體重220-250g，SCXK2015-0001。

3.3實(shí)驗方法

3.3.1抗血小板凝集

家兔耳緣靜脈取血，用3.8％的枸櫞酸鈉抗凝(全血與抗凝劑體積比9:1)，室溫下離心(500-800rpm/min,10min)制備富集血小板血漿(PRP)。分離出PRP后，再離心(3000rpm/min,10min)制備貧血小板血漿(PPP)，用PPP調(diào)0。取PRP200μL加入等摩爾濃度的R-/S-HPABA DMSO溶液5μL，空白對照組加等容積溶媒DMSO，溫育2min后，以ADP20μL、AA 20μL、COLL 20μL為誘導(dǎo)劑，測定血小板聚集反應(yīng)，對結(jié)果進(jìn)行方差分析。

3.3.2血小板毒性試驗

乳酸脫氫酶(LDH)被認(rèn)為是細(xì)胞活力的一個指標(biāo)，因此，本試驗以測定LDH的釋放量來評價(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸對血小板毒性。(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(150μg/mL)與PRP孵育不同時間，按照說明書的要求，用LDH毒性檢測試劑盒測定。LDH釋放量的程度是以占最大釋放量(0.3％的Triton X-100)的百分比表示的。

3.3.3出血時間測定

KM小鼠，隨機(jī)分為8組，每組8只。分組如下：阿司匹林100mg/kg(陽性對照組)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高劑量組(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白對照組)。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥后1h，烏拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。從老鼠的尾尖切斷約5mm的長度，并迅速插入37℃的生理鹽水中。觀察15min內(nèi)從開始出血到再次出血所用的時間，并記錄。

3.3.4凝血時間測定

實(shí)驗分組和給藥如1.3.3所示，于最后一次給藥1h后，烏拉坦麻醉。用毛細(xì)管眼眶采血，滴兩滴在干凈載玻片的兩端，開始計時，每隔30s用細(xì)針頭挑一下，直到出現(xiàn)血絲停止計時，所需的時間即為凝血時間。

3.3.5血漿血栓素B₂(TXB₂)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的測定

SD大鼠，隨機(jī)分為8組，每組5只。分組如下：阿司匹林100mg/kg(陽性對照組)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高劑量組(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白對照組)。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥后1h，烏拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。腹主動脈取血，制備PRP，分析前放置于-20℃條件下保存。按照說明書的要求TXB₂和6-keto-PGF1α酶聯(lián)免疫試劑盒測定其濃度。

3.3.6環(huán)氧酶-1(COX-1)活性的測定

SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組5只。分組如下：阿司匹林100mg/kg(陽性對照組)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(200mg/kg)，CMC-Na(空白對照組)。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥后1h，烏拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。腹主動脈取血，制備PRP，分析前放置于-20℃條件下保存。按照說明書的要求COX-1酶聯(lián)免疫試劑盒測定其濃度。

3.4實(shí)驗結(jié)果

3.4.1抗血小板凝集

實(shí)驗結(jié)果見表2-4。

表2.R-/S-HPABA對ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用

**P<0.01vs空白對照組

表3.R-/S-HPABA對COLL誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用

*P<0.05vs空白對照組

表4.R-/S-HPABA對AA誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用

*P<0.05vs空白對照組

從表2-4中可以看出，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸與對照組相比較有顯著性差異，作用與阿司匹林的抗血小板凝聚作用相當(dāng)，且兩個對映體之間的作用沒有顯著性差異。

該發(fā)明實(shí)驗結(jié)果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有一定的抗血小板凝聚作用。

3.4.2 R-/S-HPABA對血小板毒性測定

實(shí)驗結(jié)果見附圖1，從圖1中可知，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸與對照組相比較沒有顯著性差異，且兩個對映體之間的作用沒有顯著性差異。

該發(fā)明實(shí)驗結(jié)果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸對血小板沒有毒性，其抗血小板凝聚作用不是由于細(xì)胞毒性產(chǎn)生的。

3.4.3出血時間和凝血時間的測定

實(shí)驗結(jié)果見表5。

表5.R-/S-HPABA對出血時間和凝血時間的影響

^*p<0.05vs.空白對照組

從表5中可以看出，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸與對照組相比較有顯著性差異，作用與阿司匹林的作用相當(dāng)，且兩個對映體之間的作用沒有顯著性差異。

該發(fā)明實(shí)驗結(jié)果表明，R-/S-2-乳酰氨基苯甲酸可使凝血時間延長，出血時間有所延長，但沒有顯著延長，因此，不會發(fā)生出血風(fēng)險。

3.4.4血漿血栓素B₂(TXB₂)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的測定

實(shí)驗結(jié)果見表6。

表6.R-/S-HPABA對TXB₂和6-keto-PGF1α的影響

^*p<0.05vs.空白組.

從表6中可以看出，與空白組相比，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸顯著抑制血栓素B₂的生成，增加6-酮-前列腺素F1α的生成。

3.4.5環(huán)氧酶-1(COX-1)活性的測定

實(shí)驗結(jié)果見附圖2，從圖2中可知，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸和阿司匹林與對照組相比較能顯著抑制COX-1的活性，且S-2-乳酰氨基苯甲酸的作用與阿司匹林作用相當(dāng)，效果優(yōu)于R-2-乳酰氨基苯甲酸。

該發(fā)明實(shí)驗結(jié)果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的抗血小板凝聚作用可能是通過抑制環(huán)氧酶-1的活性，進(jìn)一步抑制血栓素A₂(TXB₂的前體化合物)的生成。

實(shí)施例4.(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸抗血栓活性研究

4.1試劑

阿司匹林(ASP，純度＞99.5％)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光學(xué)純度＞99.3％)，(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光學(xué)純度＞98.8％)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。

4.2實(shí)驗動物

KM小鼠，雄性，SPF級，體重18-22g，SCXK2015-0001。

SD大鼠，雄性，體重220-250g，SCXK2015-0001。

4.3實(shí)驗方法

4.3.1膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的肺血栓

KM小鼠，隨機(jī)分為8組，每組10只。分組如下：阿司匹林100mg/kg(陽性對照組)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高劑量組(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白對照組)。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥后1h，尾靜脈注射膠原(500μg/kg)和腎上腺素(50μg/kg)混合液，誘導(dǎo)肺血栓。觀察并記錄15min內(nèi)小鼠偏癱、死亡或者恢復(fù)的數(shù)量。抑制率(％)＝((空白組死亡數(shù)量–給藥組死亡數(shù)量)/空白組死亡數(shù)量)×100％。

4.3.2頸動脈血栓

SD大鼠，隨機(jī)分為8組，每組5只。分組如下：阿司匹林100mg/kg(陽性對照組)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高劑量組(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白對照組)。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥后1h，烏拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。頸動脈穿線法誘導(dǎo)動脈血栓，手術(shù)3h后，剪下動脈血栓(約1cm)，濾紙吸干并沉重。抑制率(％)＝(A-A₁)/A×100％，A空白組血栓的濕重，A₁表示給藥組血栓的濕重。

4.4實(shí)驗結(jié)果

4.4.1膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的肺血栓

實(shí)驗結(jié)果見表7。

表7.R-/S-HPABA對膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的肺血栓的影響

^*p<0.05vs.阿司匹林組。

^#p<0.05vs.相同濃度的S-HPABA。

從表7中可以看出，與空白組相比(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸能夠顯著提高肺血栓的恢復(fù)率。與阿司匹林相比，中、高劑量的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和高劑量的(S)-2-乳酰氨基苯甲酸作用優(yōu)于阿司匹林，且中、高劑量的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸作用大于相同濃度的S-2-乳酰氨基苯甲酸。

該發(fā)明實(shí)驗結(jié)果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有抗肺血栓的作用。其抗血栓作用可能是通過其抗血小板凝集作用產(chǎn)生的。

4.4.2頸動脈血栓

實(shí)驗結(jié)果見表8。

表8.R-/S-HPABA對頸動脈血栓的影響

^*p<0.01vs.空白組。

從表8中可以看出，與空白組相比(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸能夠顯著抑制動脈血栓的的重量。作用與阿司匹林相當(dāng)，且兩對映體之間沒有顯著性差異。

該發(fā)明實(shí)驗結(jié)果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有抗動脈血栓的作用。其抗血栓作用可能是通過其抗血小板凝集作用產(chǎn)生的。