本發(fā)明涉及一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法，屬于醫(yī)藥保健品技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝癌是一類常見的癌癥，有極高的發(fā)病率和致死率。手術(shù)治療法和放化療法是目前治療肝癌的主要手段。然而手術(shù)治療預(yù)后差，易復(fù)發(fā)；化學(xué)藥物因其對正常細(xì)胞的殺傷作用會帶來較大的毒副作用，給病人帶來極大的痛苦。因此，科學(xué)家們努力從天然產(chǎn)物中尋找更加高效低毒的抗癌劑。研究表明，長期的免疫力低下也是癌癥產(chǎn)生的重要原因之一，提高機(jī)體的免疫水平是腫瘤治療的關(guān)鍵手段。因此尋找具有提高免疫力水平作用的抗癌藥物是非常必要的。

香菇的產(chǎn)量高，食用人群廣。香菇含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中香菇多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒等功能，香菇多糖作為一種重要的功能因子，具有非常廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。目前普遍認(rèn)為香菇多糖是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力間接發(fā)揮抗腫瘤作用，但由于香菇多糖分子量大，溶解度低，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如果前處理方法不當(dāng)，會導(dǎo)致香菇多糖的活性得不到充分發(fā)揮。目前香菇多糖常用的提取方法是水提取法，這種提取方法的缺點(diǎn)是時間長、效率低、破壞有效成分。超聲輔助提取法、微波輔助提取法作為近年來常用的提取方法，雖然提高了效率，但是所帶來的有效成分失活，輻射對人體健康所帶來的傷害不容忽視。高溫高壓提取法由于溫度較高會破壞有效成分。高壓均質(zhì)技術(shù)可以將液體中的固體顆粒進(jìn)行超微細(xì)化，將香菇內(nèi)的活性物質(zhì)釋放出來，缺點(diǎn)是一部分活性物質(zhì)會殘留在破碎的固料表面，不能完全進(jìn)入提取溶劑中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)酶解處理：取干燥香菇子實(shí)體，粉碎，加入10～40質(zhì)量倍的去離子水，加入纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶；在45～55℃，酶解2～5h；所述香菇子實(shí)體、纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為20～50：0.5～1：0.05～0.15：0.2～0.5：0.3～0.5；

(2)高壓均質(zhì)處理：將步驟(1)得到的香菇酶解液，用高壓均質(zhì)機(jī)，在50～100MPa壓力下處理1～3次，每次10～30min，得到均質(zhì)液；

(3)香菇多糖的提?。簩⒉襟E(2)獲得的均質(zhì)液過濾，濾液減壓濃縮至濾液體積的1/6～1/4，得濃縮液，向濃縮液中加濃縮液體積2.5～4倍的體積濃度為95～99.7％的乙醇水溶液，靜置12～24h，在3000～5000rpm，離心5～15min，將沉淀物干燥，得香菇多糖總糖含量為90％以上；分子量范圍是1.82×10²～4.46×10²KDa的香菇多糖。

上述方法制備的香菇多糖總糖含量為90％以上；分子量范圍是1.82×10²～4.46×10²KDa的香菇多糖。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明利用復(fù)合酶解技術(shù)對香菇預(yù)處理，水解細(xì)胞壁，改變香菇的質(zhì)地結(jié)構(gòu)，再利用高壓均質(zhì)機(jī)短時間處理，將有效成分與溶劑充分混勻，大大提高了提取效率，充分保留活性成分不被破壞，具有制備過程簡便、安全、無毒的特點(diǎn)，為活性化合物的工業(yè)化應(yīng)用提供新方法。

(2)制備獲得的香菇多糖總糖含量為90％以上；分子量范圍是1.82×10²～4.46×10²KDa的香菇多糖具有提高免疫，清除體內(nèi)自由基的作用，抗肝癌效果顯著，且用藥后不良反應(yīng)少，改善了荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制備的香菇多糖用藥后各組荷瘤小鼠腫瘤體積隨觀察天數(shù)的變化曲線；

圖2為實(shí)施例1制備的香菇多糖用藥后各組荷瘤小鼠的腫瘤照片；

圖3為實(shí)施例1制備的香菇多糖用藥后各組荷瘤小鼠的水食效率；

圖4為實(shí)施例1制備的香菇多糖用藥后各組荷瘤小鼠的腫瘤病理切片圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明并不受限于此，在不脫離本發(fā)明的思想和宗旨的情況下，對本發(fā)明的技術(shù)方案所做的任何變化都應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)酶解處理：取干燥香菇子實(shí)體，粉碎，加入20質(zhì)量倍的去離子水，加入纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶；在45℃，酶解時間為3h；所述香菇子實(shí)體、纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為40：0.6：0.12：0.4：0.5；

(2)高壓均質(zhì)處理：將步驟(1)得到的香菇酶解液，用高壓均質(zhì)機(jī)，在100MPa壓力下處理3次，每次20min，得到均質(zhì)液；

(3)香菇多糖的提取：將步驟(2)獲得的均質(zhì)液過濾，濾液減壓濃縮至濾液體積的1/6，得濃縮液，向濃縮液中加濃縮液體積3倍的體積濃度為95％的乙醇水溶液，靜置24h，在4000rpm，離心15min，將沉淀物干燥，得香菇多糖。

實(shí)施例2

一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)酶解處理：取干燥香菇子實(shí)體，粉碎，加入40質(zhì)量倍的去離子水，加入纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶；在55℃，酶解4h；所述香菇子實(shí)體、纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為20：0.5：0.05：0.2：0.3；

(2)高壓均質(zhì)處理：將步驟(1)得到的香菇酶解液，用高壓均質(zhì)機(jī)，在50MPa壓力下處理1次，每次30min，得到均質(zhì)液；

(3)香菇多糖的提?。簩⒉襟E(2)獲得的均質(zhì)液過濾，濾液減壓濃縮至濾液體積的1/4，得濃縮液，向濃縮液中加濃縮液體積2.5的體積濃度為99.7％的乙醇水溶液，靜置12h，在5000rpm，離心10min，將沉淀物干燥，得香菇多糖。

實(shí)施例3

一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)酶解處理：取干燥香菇子實(shí)體，粉碎，加入10質(zhì)量倍的去離子水，加入纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶；在55℃，酶解2h；所述香菇子實(shí)體、纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為50：1：0.15：0.5：0.4；

(2)高壓均質(zhì)處理：將步驟(1)得到的香菇酶解液，用高壓均質(zhì)機(jī)，在80MPa壓力下處理3次，每次10min，得到均質(zhì)液；

(3)香菇多糖的提取：將步驟(2)獲得的均質(zhì)液過濾，濾液減壓濃縮至濾液體積的1/5，得濃縮液，向濃縮液中加濃縮液體積4倍的體積濃度為95的乙醇水溶液，靜置12h，在3000rpm，離心5min，將沉淀物干燥，得香菇多糖。

實(shí)施例4

一種具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)酶解處理：取干燥香菇子實(shí)體，粉碎，加入30質(zhì)量倍的去離子水，加入纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶；在50℃，酶解5h；所述香菇子實(shí)體、纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為30：0.8：0.08：0.3：0.3；

(2)高壓均質(zhì)處理：將步驟(1)得到的香菇酶解液，用高壓均質(zhì)機(jī)，在60MPa壓力下處理2次，每次25min，得到均質(zhì)液；

(3)香菇多糖的提?。簩⒉襟E(2)獲得的均質(zhì)液過濾，濾液減壓濃縮至濾液體積的1/6，得濃縮液，向濃縮液中加濃縮液體積3倍的體積濃度為99.7％的乙醇水溶液，靜置24h，在5000rpm，離心5min，將沉淀物干燥，得香菇多糖。

表1各實(shí)施例制備得到香菇多糖的得率及理化性質(zhì)

實(shí)施例5

本發(fā)明的香菇多糖對小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用。

實(shí)驗?zāi)康模?/p>

檢測本發(fā)明的香菇多糖對小鼠移植性腫瘤生長的影響。

實(shí)驗材料：

1.受試物：實(shí)施例1獲得的香菇多糖。準(zhǔn)確稱量香菇多糖，用生理鹽水溶解，配成濃度為15mg/mL的貯存液，在-20℃下保存，使用時用生理鹽水將香菇多糖稀釋成3，6和12mg/mL的低中高三個劑量的溶液；環(huán)磷酰胺：江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司(批號15101225)；0.9％氯化鈉注射液(生理鹽水)：河北天成藥業(yè)股份有限公司(批號A15100801)；

2.試劑：DMEM培養(yǎng)基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS緩沖液：Solarbio(Beijing)；臺盼藍(lán)：Solarbio(Beijing)；其余試劑均為市售。

3.動物及瘤株：雄性昆明種小鼠，體重20±2g，共40只，動物合格證SCXK(京)2014-0004，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。鼠源性H22肝癌細(xì)胞：購自上海細(xì)胞庫。

4.儀器：CO₂培養(yǎng)箱(BPN-80CW)：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1FD)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡(BDS-200)：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。紫外分光光度計(UV-9200)：北京瑞利分析儀器廠。酶標(biāo)儀(DNM-9602)：北京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司。

實(shí)驗方法及結(jié)果：

1.受試物對H22實(shí)體瘤的抑制作用

取凍存的鼠源性H22肝癌細(xì)胞，置于37℃恒溫水浴中解凍，離心，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌兩次，再用PBS液重懸細(xì)胞，經(jīng)ICR小鼠腹腔傳3代以上，腹水長出后，在無菌條件下抽取瘤液，瘤液與生理鹽水按體積比1:1的比例稀釋并充分混合得到細(xì)胞懸液。用臺盼藍(lán)染色后，在血細(xì)胞計數(shù)器上計數(shù)，其中活細(xì)胞數(shù)大于95％，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為1×10⁷個瘤細(xì)胞/mL。然后將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液按0.2mL/只接種于小鼠右前肢腋窩皮下，構(gòu)建實(shí)體瘤動物模型，得到H22荷瘤小鼠。

接種后次日隨機(jī)分組，每組8只，受試物組(低中高三個劑量)，模型組(生理鹽水)和陽性對照藥組(25mg/kg)。小鼠灌胃給藥，每天一次，劑量0.01mL/g(給藥體積/小鼠體重)連續(xù)給藥給藥14天，給藥期間，每隔2到3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大直徑a、最小直徑b，按V＝1/2×a×b²計算瘤體積，繪制小鼠腫瘤生長曲線。實(shí)驗結(jié)果見表2、圖1；于第15天稱取各小鼠的體重，摘除眼球取血，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤、脾臟、胸腺并稱重，按以下各式計算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。腫瘤拍照。實(shí)驗結(jié)果見表3、表4、圖2。

腫瘤抑制率(％)＝(1－給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100％

脾臟指數(shù)(mg/g)＝脾臟重量/體重

胸腺指數(shù)(mg/g)＝胸腺重量/體重

表2實(shí)驗各組小鼠給藥期間腫瘤體積

實(shí)施例1各組小鼠給藥期間腫瘤體積如表2所示，圖1是實(shí)施例1各組小鼠的瘤體積隨觀察天數(shù)的變化曲線，結(jié)果表明，本發(fā)明的香菇多糖能減緩小鼠移植性腫瘤的生長速度，對腫瘤的生長有阻礙作用。

實(shí)驗證明，實(shí)施例2、3、4的香菇多糖能減緩小鼠移植性腫瘤的生長速度，對腫瘤的生長有阻礙作用。

表3實(shí)驗各組小鼠的瘤重及腫瘤的抑制率

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型組；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs陽性對照藥組

由表3所示的實(shí)驗數(shù)據(jù)及圖2的腫瘤照片可知，與模型組相比，實(shí)施例1的香菇多糖對小鼠H22實(shí)體瘤有明顯的抑制作用(P<0.001)，且具有濃度依賴性，隨著用藥劑量的增加，抑瘤作用增強(qiáng)。高劑量組的抑瘤效果接近于陽性對照藥，無顯著性差異，P>0.05。

實(shí)驗證明，實(shí)施例2、3、4的香菇多糖對小鼠H22實(shí)體瘤有明顯的抑制作用。

表4實(shí)驗各組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型組；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs陽性對照藥組

由表4的實(shí)驗結(jié)果可知，實(shí)施例1的高劑量的香菇多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高了小鼠的固有免疫力。

實(shí)驗證明，實(shí)施例2、3、4的香菇多糖，高劑量可以顯著提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高了小鼠的固有免疫力。

本發(fā)明的香菇多糖對荷瘤小鼠生存質(zhì)量的影響

實(shí)驗方法及結(jié)果：

每日測定小鼠的體重，攝食量及攝水量。計算小鼠的水食效率。攝食效率＝(增長的體重/攝食量)×100％；攝水效率＝(增長的體重/攝水量)×100％。實(shí)驗結(jié)果見圖3。

由圖3可知，與陽性對照藥相比，實(shí)施例1的香菇多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的水食效率(P<0.001)，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。

實(shí)驗證明，實(shí)施例2、3、4的香菇多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的水食效率，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。

本發(fā)明的香菇多糖對荷瘤小鼠肝臟中相關(guān)酶的影響

實(shí)驗方法及結(jié)果：

測肝組織勻漿中過氧化氫(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活力及丙二醛(MDA)的含量。測定試劑盒購買于南京建成生物工程研究所(貨號依次為：A007-1；A005；A001-3；C009-2；C010-2；A003-1)。各組小鼠肝臟中相關(guān)酶的含量如表5所示。

表5實(shí)驗各組小鼠肝臟中相關(guān)酶的含量

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型組；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs陽性對照藥組

由表5的結(jié)果可知，本發(fā)明實(shí)施例1的香菇多糖可以提高肝臟中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝臟MDA的水平，且有濃度依賴性。另外，實(shí)施例1的香菇多糖可以顯著降低肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力，降低肝毒性，減少肝臟炎癥的產(chǎn)生。與模型組相比，陽性藥組小鼠肝臟中轉(zhuǎn)氨酶升高，這表明化療藥環(huán)磷酰胺對肝臟有較大的毒性。

實(shí)驗證明，實(shí)施例2、3、4的香菇多糖提高肝臟中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝臟MDA的水平，且有濃度依賴性。可以顯著降低肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力，降低肝毒性，減少肝臟炎癥的產(chǎn)生。與模型組相比，陽性藥組小鼠肝臟中轉(zhuǎn)氨酶升高，這表明化療藥環(huán)磷酰胺對肝臟有較大的毒性。

本發(fā)明的香菇多糖對荷瘤小鼠血清中免疫因子含量的影響

實(shí)驗方法及結(jié)果：

各組小鼠停藥后次日采用眼球摘除法取血，靜置后離心分離血清，ELISA法檢測荷瘤小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素(IL-2)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量，結(jié)果見表6。

表6實(shí)驗各組小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子、白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子α的含量

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型組；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs陽性對照藥組

由表6可知，實(shí)施例1的香菇多糖可以降低腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，提高白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子α的表達(dá)，提高機(jī)體免疫力。

實(shí)驗證明，實(shí)施例2、3、4的香菇多糖可以降低腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，提高白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子α的表達(dá)，提高機(jī)體免疫力。

實(shí)施例1荷瘤小鼠的腫瘤病理切片見圖4(A-E分別代表：模型組、陽性對照藥組、香菇多糖低劑量組、香菇多糖中劑量組、香菇多糖高劑量組)

給藥組細(xì)胞生長不如模型組活躍，部分緊密排列，部分較松散，大片狀腫瘤組織壞死，高劑量組可見較大部分凝固性壞死，腫瘤周邊可見血管、出血及纖維組織；少量炎細(xì)胞浸潤。