本發(fā)明涉及的是植物分子生物學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種棕色棉GhTT19基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

棉花是錦葵科棉屬植物，它既是重要的纖維作物，又是重要的油料作物，還是紡織、精細(xì)化工原料和重要的戰(zhàn)略物資。棕色棉是一種纖維呈現(xiàn)天然棕色的彩色棉,由于其本身帶有天然的顏色,在棉花紡織生產(chǎn)過(guò)程中,可以免去漂白、消毒、染色等過(guò)程,污染少、環(huán)保健康。隨著環(huán)保理念深入人心，棕色棉迎合了市場(chǎng)的需求，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

但是,棕色棉與白色棉相比，其品質(zhì)不夠理想,存在纖維顏色單一、著色不均勻、色牢度和色飽和度低等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了棕色棉的生產(chǎn)與應(yīng)用。因此，必須解析棕色棉纖維色素合成的分子機(jī)理，為培育纖維色素穩(wěn)定的棕色棉新品種奠定基礎(chǔ)，同時(shí)能增加棉農(nóng)收入和滿足國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展多方面的需要。前人從棕色棉纖維中克隆了原花色素合途徑中的結(jié)構(gòu)基因(F3H,DFR,CHI等),結(jié)合棕色棉纖維色素化學(xué)性質(zhì)的鑒定結(jié)果,初步推斷棕色棉纖維色素的合成前體為縮合單寧,即原花色素(proanthocyanidins，PA)。

TRANSPARENT TESTA19是一種參與原花青素、花青素轉(zhuǎn)運(yùn)的游離蛋白，歸屬于GST家族。擬南芥TT19基因(AtTT19)編碼一種類黃酮代謝途徑必需的GST家族的Phi類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其生物學(xué)功能是將胞漿內(nèi)合成的花青素、原花青素等多酚類色素的單體物轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡等亞細(xì)胞器官中，然后花青素在酸性條件下顯色或原花青素進(jìn)一步聚合后形成有色色素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因及其應(yīng)用，以提供一種新的與色素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的棉花基因，為培育纖維色素穩(wěn)定的棕色棉新品種奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，命名為GhTT19，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了上述棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因在培育棕色棉新品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體含有上述棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因。

進(jìn)一步地，所述植物表達(dá)載體為含有上述基因的pCambia1301a載體。

本發(fā)明還提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有上述植物表達(dá)載體，或其基因組中整合有外源的所述棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因。

進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞為含有上述植物表達(dá)載體或整合有所述基因的農(nóng)桿菌細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述植物為擬南芥，所述方法包括以下步驟：

(1)制備侵染液：將所述宿主細(xì)胞活化后，用緩沖液重懸，獲得侵染液，所述緩沖液為含有質(zhì)量比為5％的蔗糖和0.02％的Silwet L-77的1/2MS液體培養(yǎng)基，所述侵染液的OD₆₀₀值為0.8；

(2)將預(yù)轉(zhuǎn)化的擬南芥苗的果莢和已開放的花朵全部剪掉，只留花蕾，將全部花蕾倒置浸在步驟(1)的侵染液中45s，再置于黑暗處培養(yǎng)一天，然后置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并控制光照時(shí)間為16h/天；

(3)每隔1周重復(fù)步驟(2)一次，直至種子成熟，獲得T0代種子；

(4)將T0代種子消毒后接種指含有50mg/L潮霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并控制光照時(shí)間為16h/天，至幼苗長(zhǎng)出4-6片蓮座后，移入營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)并收獲T1代種子，只有含有所述植物表達(dá)載體的種子能夠在含有50mg/L潮霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由此可篩選出陽(yáng)性植株；

(5)重復(fù)步驟(4)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株及其后代。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因及其應(yīng)用，通過(guò)對(duì)該基因編碼序列的分析和遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果表明，該基因能夠控制纖維色素的形成，提高植物色澤，為利用基因工程技術(shù)對(duì)棕色棉色彩性狀進(jìn)行遺傳改良提供了參考依據(jù)，為培育纖維色素穩(wěn)定的棕色棉新品種提供了新的途徑。

附圖說(shuō)明

圖1為pCambia1301a-GhTT19載體構(gòu)建圖譜；

圖2為擬南芥陽(yáng)性苗PCR驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖3為轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥T₂代植株組織化學(xué)染色結(jié)果圖；

圖4為擬南芥各組織中GhTT19相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，其中：r：轉(zhuǎn)基因擬南芥根；s：轉(zhuǎn)基因擬南芥莖；l：轉(zhuǎn)基因擬南芥葉；t:轉(zhuǎn)基因擬南芥種皮；w：野生型擬南芥種皮；

圖5為擬南芥種皮原花青素含量檢測(cè)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料

下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行，PMD-18T、限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI、T₄連接酶。RNAprep Pure Plant Kit、FastQuant RT Kit均購(gòu)自TIANGEN公司。DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)、X-Gluc均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，方法均照說(shuō)明書進(jìn)行。

2、方法

2.1GhTT19的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1GhTT19基因克隆

提取棕色棉葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物GhTT19-F和GhTT19-R，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，連接PMD-18T載體。

所述特異性擴(kuò)增引物GhTT19-F和GhTT19-R為：

SEQ ID NO.3：GhTT19-F：ATGGTAGTGAAAGTGTATGG

SEQ ID NO.4：GhTT19-R：TCAATAATTAGCGAGCTTCA

具體反應(yīng)步驟包括：取1μg(2μL)的總RNA，加入2μL 5×gDNA Buffer，2μL 10×Fast RT Buffer，1μL RT Enzyme Mix，2μL FQ-RT Primer Mix，11μL RNase-Free ddH2O，小心混勻，42℃孵育15min，然后95℃孵育3min，冰上放置5min，即獲得相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用引物GhTT19F和GhTT19R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收，并連接到載體PMD-18T上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆鑒定后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序完成后利用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，確保所獲序列為目的序列。結(jié)果表明，所獲基因大小為645bp，其核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.1.2植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)目的基因GhTT19的序列設(shè)計(jì)帶有BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)的引物GhTT19-BamHI-F和GhTT19-XbaI-R，以cDNA為模板擴(kuò)增GhTT19基因的ORF，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收，并連接到載體PMD-18T上，獲得PMD-18T-GhTT19質(zhì)粒。

所述帶有BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)的引物GhTT19-BamHI-F和GhTT19-XbaI-R為：

SEQ ID NO.5：GhTT19-BamHI-F：ATGGTAGTGAAAGTGTATGG

SEQ ID NO.6：GhTT19-XbaI-R：TCAATAATTAGCGAGCTTCA

如圖1所示，用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xba I分別對(duì)PMD-18T-GhTT19質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCambia1301a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段GhTT19和植物表達(dá)載體pCambia1301a。用T4連接酶將2個(gè)酶切后的目的片段連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證后并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得植物表達(dá)載體pCambia1301a-GhTT19。

2.1.3宿主細(xì)胞的構(gòu)建

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCambia1301a-GhTT19通過(guò)電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)卡那霉素和鏈霉素篩選出陽(yáng)性菌株，獲得宿主細(xì)胞。

同時(shí)，將未連接GhTT19基因的空載體pCambia1301a按上述同樣的方法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)卡那霉素和鏈霉素篩選出陽(yáng)性菌株，獲得對(duì)照細(xì)胞。

2.2擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

2.2.1制備侵染液：將所述宿主細(xì)胞活化后，用緩沖液重懸，獲得侵染液，所述緩沖液為含有質(zhì)量比為5％的蔗糖和0.02％的Silwet L-77的1/2MS液體培養(yǎng)基，所述侵染液的OD₆₀₀值為0.8。

2.2.2將預(yù)轉(zhuǎn)化的擬南芥苗的果莢和已開放的花朵全部剪掉，只留花蕾，將全部花蕾倒置浸在步驟2.2.1的侵染液中45s，再置于黑暗處培養(yǎng)一天，然后置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并控制光照時(shí)間為16h/天。

2.2.3每隔1周重復(fù)步驟2.2.2一次，直至種子成熟，獲得T₀代種子，共1200粒。

2.2.4將1200粒T₀代種子消毒后接種至含有50mg/L潮霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基接種200粒，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并控制光照時(shí)間為16h/天，結(jié)果如下表1所示，大部分植株黃化并停止生長(zhǎng)，只有6株長(zhǎng)出真葉，為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.50％。

表1擬南芥抗性植株的篩選

待6株幼苗長(zhǎng)出2-3片真葉后，取其中一株進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體為：取少部分葉片，利用EasyPure Plant Genomic DNA Kit提取葉片的DNA，PCR鑒定時(shí)，利用目的基因的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為DNA 2μL，Easytaq buffer 2.5μL，dNTPs2.0μL，上下游引物各1.5μL，Easytaq 0.25μL，水補(bǔ)齊至25μL。反應(yīng)條件為94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min。

結(jié)果如圖2所示，圖中，在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥中擴(kuò)增出預(yù)期大小645bp的產(chǎn)物。

待這6株陽(yáng)性株長(zhǎng)出4-6片蓮座后，移入營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)并收獲T₁代種子。

2.2.5將T₁代種子重復(fù)步驟2.2.4進(jìn)行復(fù)篩，獲得遺傳穩(wěn)定的擬南芥陽(yáng)性株。

2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的GUS染色

取擬南芥陽(yáng)性株T₂代植株的幼苗，按照GUS染色試劑盒對(duì)其進(jìn)行GUS染色，觀察GhTT19的組織表達(dá)情況，步驟如下：

(1)預(yù)處理：將擬南芥放于1.5mL離心管中，加入預(yù)冷的90％丙酮完全覆蓋材料，常溫處理20-30min。

(2)染色：用蒸餾水將材料漂洗干凈后置于1.5mL離心管中，加入適量配置好的GUS染色工作液至完全覆蓋材料，錫箔紙包好37℃過(guò)夜放置。

(3)洗脫：用95％乙醇進(jìn)行洗脫，搖床輕搖。

(4)觀察：肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍(lán)色部分即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化空載體pCambia1301a的擬南芥細(xì)胞中的各個(gè)部位都未有藍(lán)色，而轉(zhuǎn)化pCambia1301a-GhTT19的擬南芥幼苗的根、莖、葉都出現(xiàn)藍(lán)色，表明GhTT19在轉(zhuǎn)基因擬南芥的各部位都表達(dá)。擬南芥陽(yáng)性株T₂代植株GUS染色結(jié)果如圖3所示，圖中可看出：在擬南芥的根、莖和葉等部位都出現(xiàn)藍(lán)色，表明GhTT19在轉(zhuǎn)基因擬南芥的各部位都表達(dá)。

2.4轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥的表型觀察、qRT-PCR分析和原花青素含量檢測(cè)

2.4.1表型觀察

分別取轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥陽(yáng)性株和野生型擬南芥種子若干，利用DMACA染色法進(jìn)行染色處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥陽(yáng)性株的種皮染色較野生型擬南芥的種皮染色深，說(shuō)明轉(zhuǎn)GhTT19能適當(dāng)增加擬南芥種皮中的原花青素含量。

2.4.2qRT-PCR分析

分別從轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥T₂的種皮及其植株組織器官、野生型擬南芥的種皮中提取RNA并進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥中，GhTT19在種皮中表達(dá)量更高，且轉(zhuǎn)基因擬南芥種皮中GhTT19的表達(dá)量高于野生型擬南芥。

2.4.3種皮原花青素含量檢測(cè)

取轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥T₂種子和野生型擬南芥種子的種皮，根據(jù)Ikegami等人提供的方法(Ikegami A,Akagi T,Potter D,et al.Molecular identification of 1-Cys peroxiredoxin and anthocyanidin/flavonol 3-O-galactosyltransferase from proanthocyanidin-rich young fruits of persimmon(Diospyros kaki Thunb.)[J].Planta,2009,230(4):841-855.)提取擬南芥種皮原花青素(PA)，獲得PAs提取液，利用正丁醇-鹽酸法，取400μL PAs提取液，加入1.5mL正丁醇(含5％鹽酸)，沸水浴20min，在550nm處測(cè)定吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥T₂種子和野生型擬南芥種子的種皮中PA含量。結(jié)果如圖4所示，圖中可以看出，轉(zhuǎn)GhTT19基因擬南芥種皮中的總PA含量是野生型的1.32倍。這些結(jié)果說(shuō)明GhTT19在原花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)或積累中起著一定的作用。

以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種棕色棉纖維原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的GST蛋白基因及其應(yīng)用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 棕色棉

<400> 1

atggtagtga aagtgtatgg tccaatcaag gcagcttgcc ctcaaagggt attggcatgc 60

cttcttgaga aagaggttga atttcagatc gtcgacgtcg atctcgaagc cggcgatcat 120

aaaaaacccg atttcctcct ccgtcaaccg tttggacaag tcccagctat agaggatggc 180

gacttcaaac tttttgagtc tagggcaatc ataaggtact atgcagccaa atatgaaaag 240

caaggtacaa acctacttgg aaactcattg gaagaacgag caatggtgga tcaatggcta 300

gaagtagaag cccacaactt caacgatttg gcctacactt tggtgtttca actgttgatc 360

ctcccacgaa tgggcaagca gggtgatacg gccttagtgc tcagctgcca acaaaagctg 420

gaaaaagtgt tggacatcta cgagcaacgc ttgtccacca ccgcctatct tgctggagat 480

tcattcacct tggccgacct tagccatcta cccgctcttc gatacttggt cgacgatgtt 540

gggatgtggc acatggtgtc tcaacggaag catgtaaatg catggcggga gaccatttct 600

aaccgagctg cttggaagaa actcatgaag ctcgctaatt attga 645

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 棕色棉

<400> 2

Met Val Val Lys Val Tyr Gly Pro Ile Lys Ala Ala Cys Pro Gln Arg

1 5 10 15

Val Leu Ala Cys Leu Leu Glu Lys Glu Val Glu Phe Gln Ile Val Asp

20 25 30

Val Asp Leu Glu Ala Gly Asp His Lys Lys Pro Asp Phe Leu Leu Arg

35 40 45

Gln Pro Phe Gly Gln Val Pro Ala Ile Glu Asp Gly Asp Phe Lys Leu

50 55 60

Phe Glu Ser Arg Ala Ile Ile Arg Tyr Tyr Ala Ala Lys Tyr Glu Lys

65 70 75 80

Gln Gly Thr Asn Leu Leu Gly Asn Ser Leu Glu Glu Arg Ala Met Val

85 90 95

Asp Gln Trp Leu Glu Val Glu Ala His Asn Phe Asn Asp Leu Ala Tyr

100 105 110

Thr Leu Val Phe Gln Leu Leu Ile Leu Pro Arg Met Gly Lys Gln Gly

115 120 125

Asp Thr Ala Leu Val Leu Ser Cys Gln Gln Lys Leu Glu Lys Val Leu

130 135 140

Asp Ile Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Thr Thr Ala Tyr Leu Ala Gly Asp

145 150 155 160

Ser Phe Thr Leu Ala Asp Leu Ser His Leu Pro Ala Leu Arg Tyr Leu

165 170 175

Val Asp Asp Val Gly Met Trp His Met Val Ser Gln Arg Lys His Val

180 185 190

Asn Ala Trp Arg Glu Thr Ile Ser Asn Arg Ala Ala Trp Lys Lys Leu

195 200 205

Met Lys Leu Ala Asn Tyr

210

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggtagtga aagtgtatgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaataatta gcgagcttca 20

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgggatccat ggtagtgaaa gtgtatggtc caatc 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagaat aattagcgag cttcatgagt ttctt 35