本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，包括972C＞A突變的CYP3A4基因片段、所編碼的蛋白質(zhì)片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：CYP3A4是細(xì)胞色素P450酶大家族CYP3A亞家族中最重要的一員，約占人肝微粒體CYP酶總量的60％，占到腸道微粒體的總量的70％。有大約40～50％的臨床常用藥物經(jīng)由CYP3A4氧化代謝，其中主要包括大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，抗真菌藥，H1受體拮抗藥，HMG-CoA還原酶抑制劑，苯二氮卓類，質(zhì)子泵抑制劑、鈣通道阻滯藥、抗腫瘤藥、抗精神病等藥物。CYP3A4基因具有高度多態(tài)性。目前為止，國際上已命名的等位基因共有26種(http：//www.cypalleles.ki.se)，除去野生型(CYP3A4*1)外，共有25種突變類型可引起CYP3A4蛋白氨基酸組成發(fā)生改變，另外還有多種新發(fā)現(xiàn)的突變已被命名，但還未在網(wǎng)站上公布。其中人種分布較廣、研究最多、中國人群研究資料相對最豐富的突變型是CYP3A4*4(352A＞G)、CYP3A4*5(653C＞G)、及CYP3A4*18(878T＞C)。根據(jù)目前臨床研究顯示，CYP3A4基因的多態(tài)性是造成CYP3A4酶活性在個體之間極大不同的主要原因，因此在攜帶不同CYP3A4基因型的個體間可引起藥物療效的極大差異，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的藥物毒副作用或治療不充分。因此，研究CYP3A4基因多態(tài)性對藥物療效的影響將對臨床合理用藥提供重要的科學(xué)依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供CYP3A4基因的新的單堿基突變位點(diǎn)，包含該突變位點(diǎn)的核酸片段、其編碼的蛋白質(zhì)片段及鑒定該突變位點(diǎn)在用藥指導(dǎo)中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明的內(nèi)容是基于CYP3A4基因的新的單堿基突變位點(diǎn)。所述突變位點(diǎn)是位于CYP3A4基因的編碼區(qū)內(nèi)，對應(yīng)于SEQIDNO：2的第972位，該位點(diǎn)由野生型的T突變?yōu)镃(972T＞C)；此外，由該突變的CYP3A4基因編碼的蛋白的第324位由組氨酸突變?yōu)楣劝滨０?H324Q)。一種核酸片段，所述核酸片段包含對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位的突變位點(diǎn)，且是SEQIDNO：1所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第1080位的核苷酸是A；或者所述核酸片段包含對應(yīng)于SEQIDNO：2的第972位的突變位點(diǎn)，且是SEQIDNO：2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第972位的核苷酸是A；或者為所述核酸片段的互補(bǔ)序列。所述核酸片段的長度是10-100、100-200、200-500或500-1000個核苷酸；優(yōu)選地，所述核酸片段的長度是10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-100或100-300個核苷酸；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述核酸片段是SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：33～SEQIDNO：40所示的序列。所述突變位點(diǎn)可以位于所述核酸片段的任何位置。在另一種實(shí)施方式中，所述核酸片段是序列表SEQIDNO：1所示的序列。在另一種實(shí)施方式中，所述核酸片段是序列表SEQIDNO：2所示的序列。在其它實(shí)施方式中，所述核酸片段可以是序列表SEQIDNO：33～SEQIDNO：40所示的序列。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了等位基因特異性寡核苷酸，所述寡核苷酸與含有對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位或?qū)?yīng)于SEQIDNO：2的第972位的突變位點(diǎn)的等位基因片段或其互補(bǔ)序列全部或部分雜交，其中SEQIDNO：1的第1080位或SEQIDNO：2的第972位的突變位點(diǎn)的核苷酸是A；所述等位基因片段是SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。所述寡核苷酸引物；優(yōu)選地，當(dāng)所述寡核苷酸是引物時，所述寡核苷酸的長度是15-40個核苷酸；當(dāng)所述寡核苷酸是引物時并且突變位點(diǎn)位于引物的3’末端。在一種實(shí)施方式中，所述的寡核苷酸用作探針。所述探針能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含突變位點(diǎn)的靶序列特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述探針不需要與靶序列完全互補(bǔ)，只要能與靶序列特異雜交即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雜交條件可以滿足使探針僅與靶序列特異性雜交。所述探針的長度可以是5-100個核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。所述突變位點(diǎn)可以出現(xiàn)在探針的任何位置。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述突變位點(diǎn)出現(xiàn)在探針序列的中心或大約中心處。在另一種實(shí)施方式中，所述寡核苷酸用作指導(dǎo)DNA合成的引物，如本領(lǐng)域公知的測序引物或合成引物等。所述引物不需要與模板完全互補(bǔ)，但應(yīng)當(dāng)與模板互補(bǔ)雜交以指導(dǎo)DNA合成。所述引物的長度可以是15-40個核苷酸長度，優(yōu)選地為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。所述突變位點(diǎn)可以出現(xiàn)在所述引物的任何位置；優(yōu)選地，所述突變位點(diǎn)出現(xiàn)在所述引物的3’末端。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種用于檢測和/或分析單堿基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或者包含SEQIDNO：14和/或SEQIDNO：15和/或SEQIDNO：29所示的序列片段。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述的等位基因特異性寡核苷酸在檢測CYP3A4基因突變中的應(yīng)用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種用藥指導(dǎo)，包括檢測待測樣品中CYP3A4基因的對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位或SEQIDNO：2的第972位的單堿基突變；根據(jù)檢測到的突變，調(diào)整經(jīng)CYP3A4代謝的藥物的給藥量。當(dāng)檢測到的CYP3A4基因在對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位或SEQIDNO：2的第972位的位點(diǎn)為C時，相對應(yīng)地調(diào)整經(jīng)CYP3A4代謝的藥物的給藥量。在具體的實(shí)施例中，當(dāng)CYP3A4基因在SEQIDNO：2的第972位的位點(diǎn)為A時，該基因編碼的CYP3A4蛋白酶活性上升，故需要適當(dāng)增加經(jīng)CYP3A4代謝的藥物的給藥量。本發(fā)明中所述的經(jīng)CYP3A4代謝的藥物包括：環(huán)孢素，他克莫司，雷帕霉素，多西他賽，艾洛替尼，環(huán)磷酰胺，他莫昔芬，替尼泊苷，長春花堿，吉非替尼，維羅非尼，舒尼替尼，索拉菲尼，伊立替康，伊馬替尼，酮康唑，伊曲康唑，克拉霉素，西酞普蘭，阿米替林，氯丙咪嗪，文拉法辛，利培酮，齊拉西酮，阿普唑侖，咪達(dá)唑侖，地西泮，佐匹克隆，洛伐他汀，辛伐他汀，地爾硫桌，硝苯地平，氨氯地平，尼群地平，雌二醇，睪酮，孕酮，特非那丁，氯苯那敏，地塞米松，氫化可的松，氯吡格雷，華法林等藥物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種分析核酸的方法，包括分析待測樣品中的包含對應(yīng)于SEQIDNO：1的序列的核酸中對應(yīng)于第1080位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應(yīng)于SEQIDNO：2的序列的核酸中對應(yīng)于第972位的核苷酸；優(yōu)選地，所述方法是測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析。在一種實(shí)施方式中，所述方法可以是限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本
發(fā)明內(nèi)容設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以分析SEQIDNO：1的序列的核酸中的第1080位的核苷酸或SEQIDNO：2的序列的核酸中的第972位的核苷酸是否為A。在另一種實(shí)施方式中，所述方法可以是測序法，包括分離并測定來自基因組DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含對應(yīng)于SEQIDNO：1的序列的核酸中的對應(yīng)于第1080位的核苷酸或包含對應(yīng)于SEQIDNO：2的序列的核酸中的對應(yīng)于第972位的核苷酸是否為A。測序法可以是本領(lǐng)域已知的任何可用的測序方法。測序引物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識進(jìn)行設(shè)計(jì)，如在待檢測位點(diǎn)的上下游適當(dāng)位置處設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)展包含該待測位點(diǎn)的片段，從而判斷該位點(diǎn)的核苷酸。也可以采用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物序列。數(shù)據(jù)分析：分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)樣本兩種熒光的強(qiáng)弱判定待測樣本CYP3A4基因是否存在972C＞A突變。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了CYP3A4蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQIDNO：3所示的序列；所述片段或變異體包含對應(yīng)于SEQIDNO：3的第324位的脯氨酸，并且為SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸，如10-20、20-50或50-100個氨基酸。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了CYP3A4基因的對應(yīng)于序列表SEQIDNO：1的第1080位或序列表SEQIDNO：2的第972位單堿基突變用于制備基因面板(genepanel)的用途。本發(fā)明提供了包含新的單堿基突變的CYP3A4基因和編碼序列。該基因在對應(yīng)于SEQIDNO：2的第927位核苷酸由C突變?yōu)锳(972C＞A)，從而引起其編碼的氨基酸由組氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，即對?yīng)于SEQIDNO：3的第324位的谷氨酰胺。該突變的CYP3A4蛋白(命名為H324Q)對藥物的代謝活性比野生型上升。該單堿基突變對攜帶此突變位點(diǎn)的個體的用藥具有指導(dǎo)意義。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是：1.提供了一種寡核苷酸片段來快速擴(kuò)增目的基因的方法。2.快速分析生物樣本的等位基因并提示是否存在變異。3.對于存在并產(chǎn)生的變異蛋白質(zhì)，進(jìn)行活性研究，并可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推薦調(diào)整藥物使用量。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但以下具體的實(shí)施例僅出于示例性的目的，并非對本發(fā)明做出的限制。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。附圖說明圖1是實(shí)施例1中對應(yīng)于本發(fā)明的SEQIDNO：1的第1080位核苷酸測序圖譜圖2是昆蟲表達(dá)載體pFastBac-dual載體結(jié)構(gòu)圖圖3是實(shí)施例2中的各微粒體表達(dá)蛋白的Western結(jié)果圖圖4是實(shí)施例3中的各微粒體代謝睪酮的數(shù)據(jù)圖圖5是實(shí)施例4中的各微粒體代謝硝苯地平的數(shù)據(jù)圖具體實(shí)施方式如無其它說明，本發(fā)明的“核酸片段”由核苷酸或其類似物組成，可以是DNA、RNA或其類似物的片段；可以是單鏈或雙鏈；可以是天然的(如基因組的)或合成的。本發(fā)明中，“突變”指在檢測的基因，即CYP3A4基因中存在與野生型CYP3A4基因序列不同的核苷酸位點(diǎn)。“突變位點(diǎn)”指堿基發(fā)生突變的位置。在本發(fā)明中，所述突變位點(diǎn)是對應(yīng)于SEQIDNO：1所示序列的第1080位或SEQIDNO：2所示序列中的第972位。在本發(fā)明中，“等位基因特異性”指特異地與等位基因雜交，如在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交，使得鑒定對應(yīng)于SEQIDNO：1所示序列的第1080位或SEQIDNO：2所示序列的第972位核苷酸為A。本
發(fā)明內(nèi)容涉及CYP3A4基因的非同義突變。由于該突變位點(diǎn)位于基因的編碼序列中，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，所述突變位點(diǎn)既可以在基因組DNA中表現(xiàn)，也可以在編碼序列(即CDS，對應(yīng)于mRNA序列)中表現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待檢測樣品，可以在基因組DNA或mRNA水平上對該突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。本申請中，SEQIDNO：1是以本申請的突變位點(diǎn)為中心、前后各1kb的基因組DNA序列，即SEQIDNO：1的第1080位是本發(fā)明涉及的突變位點(diǎn)。SEQIDNO：2是具有所述突變位點(diǎn)的CYP3A4基因的cDNA序列，其中第927位是本發(fā)明涉及的突變位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文中，對應(yīng)于SEQIDNO：2的第972位位點(diǎn)和對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位位點(diǎn)同義互用。本發(fā)明中，核苷酸和氨基酸的縮寫采用本領(lǐng)域公知的縮寫方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鳥嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸，I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示賴氨酸，M表示蛋氨酸，F(xiàn)表示苯丙氨酸，P表示脯氨酸，S表示絲氨酸，T表示蘇氨酸，W表示色氨酸，Y表示酪氨酸，V表示纈氨酸。本發(fā)明中，所述樣品可以是任何包含核酸的樣品，如血液；優(yōu)選所述樣品來自于人。所述核酸可以是DNA或編碼RNA，優(yōu)選為基因組DNA。本發(fā)明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA為目標(biāo)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，當(dāng)以DNA為檢測目標(biāo)物時，分析待測樣品中的包含對應(yīng)于SEQIDNO：1的序列的核酸中對應(yīng)于第1080位的核苷酸，所使用引物根據(jù)SEQIDNO：1的序列設(shè)計(jì)；當(dāng)以RNA為檢測目標(biāo)物時，分析待測樣品中的包含對應(yīng)于SEQIDNO：2的序列的核酸中對應(yīng)于第972位的核苷酸，所使用的引物根據(jù)SEQIDNO：2的序列設(shè)計(jì)。實(shí)施例1：人CYP3A4基因新的突變位點(diǎn)的鑒定本實(shí)施例中，采集健康志愿者的血液標(biāo)本1114份，提取血液中的基因組DNA，設(shè)計(jì)測序引物對CYP3A4基因的13個外顯子進(jìn)行序列擴(kuò)增、測序，分析其CYP3A4基因是否存在突變位點(diǎn)。1、提取DNA：從被測者采取5ml靜脈EDTA抗凝血液樣本；然后按照普通鹽析法和/或采用專門的DNA提取試劑盒(購自美國Omega公司的DNA提取試劑盒)提取待測血樣的基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增：設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，對獲得的基因組DNA樣品中的CYP3A4基因的13個外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增。所述擴(kuò)增引物對序列見表1。采用50μlPCR反應(yīng)體系，包括：1×PCR緩沖液、1.5mMMgCl2、100～150ng的基因組DNA、上下游引物均為0.2μM、dNTP為0.4mM、TaKaRa公司的LATaqDNA聚合酶1.5U。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸2分30秒，30個循環(huán)后再延伸5分鐘。退火溫度與引物長度相關(guān)，具體溫度見表1。使用美國ABI公司的GeneAmpPCRSystem9700擴(kuò)增儀擴(kuò)增。表1：測序引物對及退火溫度3、純化擴(kuò)增產(chǎn)物：取50μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，刀片切取目的條帶。按照E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒(Omega公司)要求進(jìn)行目的條帶的DNA回收純化。4、測序：以回收后的產(chǎn)物為模板，使用測序引物按照CEQTMDTCS-QuickStartKit測序試劑盒(美國Beckman公司)要求進(jìn)行測序PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束并純化后，用美國Beckman公司的CEQ8000型基因測序儀進(jìn)行分離以判讀擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。測序引物見表2。表2：測序引物區(qū)域測序引物(5’-3’)啟動子ATCTTTACCTATGCCTGGAGTG(SEQIDNO：20)外顯子1GGCCTGATTAGCACCCCAAG(SEQIDNO：21)外顯子2TTCTTGCCTTAATGTTACCTCG(SEQIDNO：22)外顯子3TTCCCTGGTGTCTGTAACTT(SEQIDNO：23)外顯子4AACAGAAATGAGGGCACA(SEQIDNO：24)外顯子5&6GCCCATCACCCAGTAGACAG(SEQIDNO：25)外顯子7TGGCACCTGATAACACCT(SEQIDNO：26)外顯子8GGGGCTGCTGATCTCACT(SEQIDNO：27)外顯子9GTCGTTCTGCTATGTGGC(SEQIDNO：28)外顯子10TCTGCCAGTAGCAACCATT(SEQIDNO：29)外顯子11AGCAATGGGCATGACAGT(SEQIDNO：30)外顯子12TTCAATGACCAGCCCACAA(SEQIDNO：31)外顯子13CAGTTTGCCATCATACCTAA(SEQIDNO：32)5)數(shù)據(jù)分析：將測得的序列與野生型CYP3A4*1序列(GenBank注冊號NM_017460.5)進(jìn)行比對。通過比對分析，發(fā)現(xiàn)CYP3A4基因編碼區(qū)的第972位的核苷酸由C變?yōu)锳(如圖1所示，其中W表示A或T)，該突變位于CYP3A4基因的第10外顯子內(nèi)。據(jù)此推斷該CYP3A4基因編碼的蛋白質(zhì)中，第324位氨基酸由組氨酸(H)突變?yōu)楣劝滨０?Q)。該突變已被P450命名委員會命名為新等位基因CYP3A4*31，但尚未對外公布。本實(shí)施例中示例性地給出了鑒定新突變位點(diǎn)的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述內(nèi)容可以清楚地得知特異性地檢測待測樣品中包含對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位核苷酸的方法：分離樣品中的核酸，在本實(shí)施例中對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，引物使用引物對SEQIDNO：14和15；用測序引物SEQIDNO：29對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測序；將測序結(jié)果與野生型結(jié)果比對，分析對應(yīng)于SEQIDNO：1的第1080位位點(diǎn)的核苷酸。實(shí)施例2：目標(biāo)基因的表達(dá)以連接有野生型CYP3A4*1的開放閱讀框的質(zhì)粒載體(由美國南佛羅里達(dá)大學(xué)的周樹峰教授饋贈)為模板，利用定點(diǎn)誘變技術(shù)分別獲得CYP3A4*4、CYP3A4*18和本發(fā)明的H324Q突變體的開放閱讀框(ORF)。定點(diǎn)誘變技術(shù)是本領(lǐng)域公知技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)確定的模板和目標(biāo)，可以毫無疑義地知道如何完成該步驟。然后將CYP3A4*1基因和定點(diǎn)誘變的四個突變體基因的ORF克隆至連接有細(xì)胞色素P450氧化還原酶(OR)的載體pFastBac-dual中，使得CYP3A4基因及OR分別置于PH和p10啟動子后，構(gòu)建同時表達(dá)OR和CYP3A4(或其突變體)的雙表達(dá)載體。pFastBac-dual載體結(jié)構(gòu)圖以及CYP3A4基因和OR的插入位點(diǎn)參見圖2。以不包含CYP3A4基因、僅包含有OR基因的載體作為陰性對照載體(pOR)。按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)試劑盒(購自美國Invitrogen公司，用于昆蟲細(xì)胞中大量表達(dá)外源目的基因)的使用說明，利用構(gòu)建好的雙表達(dá)載體和對照載體分別包裝P1代和P2代昆蟲病毒，所獲P2代病毒測定滴度后按照MOI(multiplicity-of-infection)為4的侵染量侵染sf21昆蟲細(xì)胞。侵染72小時后離心收集細(xì)胞，使用超聲破碎儀(美國SONIC公司)按照25％的能量超生破碎細(xì)胞，利用差速離心法提取昆蟲細(xì)胞微粒體。用Western方法檢測各微粒體中CYP3A4和OR的表達(dá)量；以CYP3A4標(biāo)準(zhǔn)品(簡稱STD，購自美國BDGentest公司)對所獲微粒體使用CO示差法進(jìn)行定量。Western結(jié)果如圖3所示。第一行顯示的是CYP3A4表達(dá)量，第二行顯示的是OR表達(dá)量。由圖看見，對照載體pOR僅表達(dá)OR蛋白，5個雙表達(dá)載體均表達(dá)OR蛋白，并分別表達(dá)*1、*4、*18型CYP3A4和本發(fā)明的H324Q蛋白。酶代謝活性分析根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，野生型(*1型)對各種藥物的代謝活性均比較高，而*4型的代謝活性比野生型的代謝活性有明顯下降，*18型的代謝活性比*1型更高。因此，在本領(lǐng)域中已有這樣一種共識：同一個基因型所表達(dá)的酶對特異性底物的代謝活性可以代表對其它底物藥的代謝活性。從而，根據(jù)某一基因型所表達(dá)的酶對特異性底物代謝活性數(shù)據(jù)可以類推該基因型所表達(dá)的酶對其它底物藥的代謝活性(如，可以將該基因型所表達(dá)的酶的代謝活性與野生型所表達(dá)的酶的代謝活性進(jìn)行比較)。實(shí)施例3：利用獲得的昆蟲微粒體體外分析對睪酮的代謝特性1、色譜條件：色譜柱為ZORBAXSB-C18柱(2.1*150mm，5-Micron，Agilent，美國)；流動相為0.05％TFA：乙腈＝55：45；柱溫為35℃；檢測波長為：240nm。2、孵育條件：反應(yīng)總體積200μL，其中包括：100mMTris-HCl(pH7.4)，1×NADPH輔酶生成系統(tǒng)(美國Promega公司)，2pmol細(xì)胞色素b5及睪酮(購自美國Sigma公司，反應(yīng)終濃度為1-100μM)。37℃預(yù)孵育5min后，加入2-5pmol的實(shí)施例2構(gòu)建的重組微粒體(分別表達(dá)*1、*4、*5、*18型CYP3A4、本發(fā)明的H324Q)以啟動反應(yīng)。37℃孵育30min后，加入50μL0.1MHCl和20μL25ng/μL內(nèi)標(biāo)地昔帕明(購自美國Sigma公司)并渦旋震蕩2min。加入800μL冰乙酸乙酯后渦旋震蕩2min，4℃下10,000×g離心5min。小心轉(zhuǎn)移有機(jī)層，氮吹儀下吹干，加入100μL流動相復(fù)溶并取20μL于Agilent1260型高效液相色譜儀檢測。本實(shí)施例的Michaelis-Menten數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖4所示。進(jìn)一步進(jìn)行藥物動力學(xué)分析。3、結(jié)果如表3所示：表3：各微粒體代謝睪酮的藥物動力學(xué)分析結(jié)果其中，Vmax代表最大反應(yīng)速率(數(shù)值越大，表明催化效率越高)，Km為米氏常數(shù)(數(shù)值越大，表明催化效率越低)，Vmax/Km則反映了整體的藥物清除速率，為綜合考核指標(biāo)，數(shù)值越高，表明突變體的整體酶學(xué)活性越強(qiáng)，藥物代謝速率越快，攜帶這種突變型的個體對藥物的需要量相對越大，否則容易出現(xiàn)藥效不明顯等現(xiàn)象。由圖4及表3可見，本發(fā)明的H324Q的整體酶學(xué)活性高于野生型*1型，也高于突變型*4型，但低于突變型*18型。實(shí)施例4：利用獲得的昆蟲微粒體體外分析對硝苯地平的代謝特性1、色譜條件：色譜柱為ZORBAXSB-C18柱(2.1*150mm，5-Micron，Agilent，美國)；流動相為0.05％TFA：乙腈＝55：45；柱溫為35℃；檢測波長為：220nm。2、孵育條件：反應(yīng)總體積200μL，其中包括：100mMTris-HCl(pH7.4)，1×NADPH輔酶生成系統(tǒng)，10pmol細(xì)胞色素b5及硝苯地平(購自美國Sigma公司，反應(yīng)終濃度為1-200μM)。37℃預(yù)孵育5min后，加入10-20pmol的實(shí)施例2構(gòu)建的重組微粒體啟動反應(yīng)。37℃孵育30min后，加入40μL0.1MHCl和20μL25ng/μL內(nèi)標(biāo)氯吡格雷(購自美國Sigma公司)并渦旋震蕩2min。加入800μL冰乙酸乙酯后渦旋震蕩2min，4℃下10,000×g離心5min。小心轉(zhuǎn)移有機(jī)層，氮吹儀下吹干，加入100μL流動相復(fù)溶并取20μL于Agilient1260型高效液相色譜儀檢測。本實(shí)施例的Michaelis-Menten數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖5所示。進(jìn)一步進(jìn)行藥物動力學(xué)分析。3、結(jié)果如表4所示：表4：各微粒體代謝硝苯地平的藥物動力學(xué)分析結(jié)果由圖5及表4可知，本發(fā)明的H324Q的整體酶學(xué)活性較高于野生型*1型和突變型*4型，但低于突變型*18型。根據(jù)上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的H324Q突變酶代謝活性高于野生型*1型，*4和*5型，同*18型相比代謝活性較低。因此，在實(shí)踐中，需要考慮對攜帶該基因型的個體在用藥劑量上進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，如增加藥物的使用量，使藥物可以維持再穩(wěn)態(tài)血藥濃度，以維持最佳的治療效果。這種通過基因?qū)虻乃幬镎{(diào)整對于治療窗狹窄的藥物(如氯吡格雷等)更為重要。序列表<110>溫州醫(yī)科大學(xué)<120>包括972C>A突變的CYP3A4基因片段、所編碼的蛋白質(zhì)片段及其應(yīng)用<130><160>40<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2240<212>DNA<213>人屬，人種<400>1gcaggcattatatttatttctatgttccaggtctctaaaggtcctaatccagtcctgatc60aaacagaccagtgatggaccatcctgagcttctctcaggagaaaaatcaagaggggccca120acttgtaatcataggagcttatgctattttaatgccatccatcagactacaatcaattac180cactcatctagctttttgtccatctctcattcttgtacatcctgagatagtcaattctga240gaactgtagcctagatctatcacctgatgcctctcaaagatataatccgtgcttctcaag300ctaggctatgcacacaaatcactgcatcttgtgaaagttcagattttgaatcagtagttc360aagggtggggtttgagattttgcatttctaatgagctctcagatgcttctgacccatgga420ccacactttgaataccaagaagtggtctgtagaccaatattggtcccttaagttccctca480aacatatcttcgggaaacgtcctttgattttccctacatttaaccattagtgttgcaaat540tctctcaaagtttgtcaagatatattgtagctaaaataaattacatttttcttgggggag600agtactacctcatattaacttacaataaagtacttttaggatcattcaaggaacacaccc660ataacactgagtatgttatgcggaaatgctctctctggaaattacacagctgtgcaggtg720gcgggggtggcatgaggaggagtggatggcccacattctcgaagaccttggggaaaactg780gattaaaatgatttgccttattctggttctgtaagatacacatcagaatgaaaccacccc840cagtgtacctctgaattgcttttctattcttttcccttagggatttgagggcttcactta900gatttctcttcatctaaactgtgatgccctacattgatctgatttacctaaaatgtcttt960cctctcctttcagctctgtccgatctggagctcgtggcccaatcaattatctttattttt1020gctggctatgaaaccacgagcagtgttctctccttcattatgtatgaactggccactcaa1080cctgatgtccagcagaaactgcaggaggaaattgatgcagttttacccaataaggtgagt1140ggatggtacatggagaaggagggaggaggtgaaaccttagcaaaaatgcctcctcaccac1200ttcccaggagaatttttataaaaagcataatcactgattctttcactgactctatgtagg1260aaggctctgaaaagaaaaagaaagaaacatagcaaatggttgctactggcagaagcgtaa1320gatctttgtaaaacgtgctggctctggttcatctgctttctattactacaataatgctaa1380gtaaaaaacctccaaaaacctcagtggcatctaacaataagcatttgttgctcacactca1440tttcacattggttttggttgtgaattacatgtttgcagcaggcaccatagtggtgtgtga1500tgtccccttagctgtatccacatatggacacaggaatttgctctttttatctctttttat1560tttcttggttacagacatgtgacttttttttttgaaaggtaacaatcactttctcatatg1620ttatttgatgctagtggtcatagcctattagtcacatttgtttcaatgagaaagaaaaac1680cagtacacggttatgctaaggatttcagtccctggggtgagagccgtctcgaatgtctcc1740ccacttcataactcctccacacatcatagttggatagtgagctctgctgatattggcagg1800acttgctctggtctggctgtagtctgacggagcctggccctgggtgtgctgtgcaggctg1860actcagctctccccacacctatctcatgttccagtcaggcagtaactggtgaagaagcca1920agctaggaaccaggatatctggctcctgagctaaagtcttaaaacactatcatattgcct1980tccaaatataacaccaaatactaggtgcatatcacccacactgttttcagacctctgcca2040aaattgggattctttgtggtatgaagagacacggctttggggctggcccggctgtggcag2100tgaggtgaacacaaagggatgttcttcagagattacagtccagccctgaagcaacaacta2160ggagactgtttcagcaagtgaggacagggctgtgtggggttctatcctctttataacttc2220cactagcactgaaatcgtgt2240<210>2<211>1512<212>DNA<213>人屬，人種<400>2atggctctcatcccagacttggccatggaaacctggcttctcctggctgtcagcctggtg60ctcctctatctatatggaacccattcacatggactttttaagaagcttggaattccaggg120cccacacctctgccttttttgggaaatattttgtcctaccataagggcttttgtatgttt180gacatggaatgtcataaaaagtatggaaaagtgtggggcttttatgatggtcaacagcct240gtgctggctatcacagatcctgacatgatcaaaacagtgctagtgaaagaatgttattct300gtcttcacaaaccggaggccttttggtccagtgggatttatgaaaagtgccatctctata360gctgaggatgaagaatggaagagattacgatcattgctgtctccaaccttcaccagtgga420aaactcaaggagatggtccctatcattgcccagtatggagatgtgttggtgagaaatctg480aggcgggaagcagagacaggcaagcctgtcaccttgaaagacgtctttggggcctacagc540atggatgtgatcactagcacatcatttggagtgaacatcgactctctcaacaatccacaa600gacccctttgtggaaaacaccaagaagcttttaagatttgattttttggatccattcttt660ctctcaataacagtctttccattcctcatcccaattcttgaagtattaaatatctgtgtg720tttccaagagaagttacaaattttttaagaaaatctgtaaaaaggatgaaagaaagtcgc780ctcgaagatacacaaaagcaccgagtggatttccttcagctgatgattgactctcagaat840tcaaaagaaactgagtcccacaaagctctgtccgatctggagctcgtggcccaatcaatt900atctttatttttgctggctatgaaaccacgagcagtgttctctccttcattatgtatgaa960ctggccactcaacctgatgtccagcagaaactgcaggaggaaattgatgcagttttaccc1020aataaggcaccacccacctatgatactgtgctacagatggagtatcttgacatggtggtg1080aatgaaacgctcagattattcccaattgctatgagacttgagagggtctgcaaaaaagat1140gttgag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