包括1735g>c突變的cyp2d6基因片段、所編碼的蛋白質(zhì)片段及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物學領(lǐng)域，涉及CYP2D6等位基因第1735位的單堿基突變，所述位點由G突變?yōu)镃。具體地，本發(fā)明涉及包含該突變位點的核酸片段及其相應編碼的蛋白質(zhì)片段、鑒定所述突變位點的試劑、檢測方法和該位點的應用，特別是鑒定該位點在指導用藥中的應用。
【專利說明】包括1 735G>C突變的CYP2D6基因片段、所編碼的蛋白質(zhì)片段及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物學領(lǐng)域，涉及CYP2D6等位基因第1735位的單堿基突變。更具體地，本發(fā)明涉及包含該突變位點的核酸片段及其相應編碼的蛋白質(zhì)片段、鑒定所述突變位點的試劑、檢測方法和鑒定該位點在指導用藥中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞色素P4502D6 (CYP2D6)是CYP酶家族重要的成員之一。其基因位于第22號染色體上，包括9個外顯子，基因全長9432bp (GenBank注冊號M33388，外顯子區(qū)位于第1620-5909位)。人體內(nèi)該細胞色素的量只占肝臟酶總量的2%~4%，卻參與臨床上20%~30%藥物的代謝，這樣藥物包括抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥、鎮(zhèn)痛藥、止咳藥、止吐藥、抗糖尿病藥及β受體阻滯藥等，研究其代謝多態(tài)性具有十分重要的臨床應用價值(參見參考文獻I)。
[0003]CYP2D6基因具有高度多態(tài)性。目前為止，NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)收錄了超過300個突變位點。由CYP450國際命名委員命名的等位基因也已有150多個，另外還有多種新發(fā)現(xiàn)的突變型尚未被命名(http://www.cypalleles.k1.se/cyp2d6.htm)。每個等位基因都不同程度涉及點突變、缺失、插入、重排等，從而影響CYP2D6的活性，進而影響對藥物的代謝活性，產(chǎn)生不同程度的藥物效應。除去野生型CYP2D6*1外，目前研究較多且臨床意義較大的突變型主要包括以下7種:CYP2D6*2、*3、*4、*5、*10、*17、*41，其中人種分布最廣、研究最多、中國人群研究資料相對最豐富的突變型是CYP2D6*2 (28500T ;4180G>C)和CYP2D6*10 (1000T ；4180G>C)(參見參考文獻 1、2、3)。
[0004]根據(jù)目前的臨床研究顯示，CYP2D6基因的這種多態(tài)性是造成CYP2D6酶活性在個體之間差異顯著的主要原因，攜帶不同`CYP2D6基因型的個體間可引起藥物療效的極大差異，甚至產(chǎn)生嚴重的藥物毒副作用或治療不充分。因此，研究CYP2D6基因多態(tài)性對藥物療效的影響將對臨床合理用藥提供重要的科學依據(jù)(參見參考文獻3、4)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供CYP2D6基因的新的單堿基突變位點，包含該突變位點的核酸片段、其編碼的蛋白質(zhì)片段及鑒定該突變位點在用藥指導中的應用。
[0006]本發(fā)明的第一個方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含對應于SEQ ID N0.1的第1735位的突變位點，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第1735位的核苷酸是C ;或者所述核酸片段包含對應于SEQ ID N0.2的第482位的突變位點，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第482位的核苷酸是C ;或者所述核酸片段為上述核酸片段的反向互補序列。
[0007]本發(fā)明的第二個方面是提供與含有對應于SEQ ID N0.1的第1735位或?qū)赟EQID N0.2的第482位的突變位點的等位基因片段或其反向互補序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的突變位點的核苷酸是C ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸或其反向互補序列。
[0008]本發(fā)明的第三個方面是提供用于檢測和/或分析本發(fā)明的單堿基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含能夠作為引物擴增所述單堿基突變但不包含該單堿基的核酸片段；所述單堿基對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位。
[0009]本發(fā)明的第四個方面是提供本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸在檢測CYP2D6基因突變中的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物；或者本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸用于制備檢測CYP2D6基因突變的藥物的應用；或者本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸用作檢測CYP2D6基因突變的檢驗標志物的應用。
[0010]本發(fā)明的第五個方面是提供一種用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2D6基因的對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的單堿基突變；根據(jù)檢測到的突變，調(diào)整由CYP2D6代謝的藥物的給藥量。
[0011 ] 本發(fā)明的第六個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應于第1735位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應于第482位的核苷酸。
[0012]本發(fā)明的第七個方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQID N0.3所示的序列；所述片段或變異體包含對應于SEQ ID N0.3的第161位的絲氨酸，并且為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸。
[0013]本發(fā)明提供了包含新的單堿基突變的CYP2D6基因和編碼序列。該基因在對應于SEQ ID N0.2的第482位核苷酸由G突變?yōu)镃(482G>C)，從而引起其編碼的氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，即對應于SEQ ID N0.3的第161位的絲氨酸。該突變的CYP2D6蛋白(命名為C161S)對藥物的代謝活性與野生型相比降低。該單堿基突變對攜帶此突變位點的個體的用藥具有指導意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是實施例1中的對應于本發(fā)明的SEQ ID N0.1序列的雜合子攜帶者測序圖譜，其中箭頭所指為CYP2D6基因第1735位核苷酸；
[0015]圖2是實施例2構(gòu)建的雙基因表達載體pIRES-Gluc-2D6的結(jié)構(gòu)示意圖譜；
[0016]圖3是實施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突變體)、CYP2D6.10(缺陷型突變體)和本發(fā)明的C161S蛋白針對右美沙芬及丁呋洛爾的代謝能力檢測結(jié)果，其中*表示P值〈0.05 ；
[0017]圖4是實施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突變體)、CYP2D6.10(缺陷型突變體)和本發(fā)明的C161S蛋白針對右美沙芬代謝的典型LC-MS/MS檢測圖譜；箭頭所指處分別為底物右美沙芬(右)及其代謝產(chǎn)物去甲基右美沙芬(左)的信號峰；其中橫坐標表示保留時間，右美沙芬和去甲基右美沙芬的保留時間分別為7.5和4.8分鐘，縱坐標表示信號響應值cps ；
[0018]圖5是實施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突變體)、CYP2D6.10(缺陷型突變體)和本發(fā)明的C161S蛋白針對丁呋洛爾代謝的典型LC-MS/MS檢測圖譜；箭頭所指處分別為底物丁呋洛爾(右)及其代謝產(chǎn)物I’-羥基丁呋洛爾(左)的信號峰；其中橫坐標表示保留時間，丁呋洛爾和1‘-羥基丁呋洛爾的保留時間分別為6.9和5.1分鐘，縱坐標表不信號響應值cps。
【具體實施方式】
[0019]通過下述【具體實施方式】說明本發(fā)明，但本
【發(fā)明內(nèi)容】
不限于此。
[0020]如無其它說明，本發(fā)明的“核酸片段”由核苷酸或其類似物組成，可以是DNA、RNA或其類似物的片段；可以是單鏈或雙鏈；可以是天然的(如基因組的)或合成的。
[0021]本發(fā)明中，“突變”指在檢測的基因，即CYP2D6基因中存在與野生型CYP2D6基因序列不同的核苷酸位點?！巴蛔兾稽c”指堿基發(fā)生突變的位置。在本發(fā)明中，所述突變位點是對應于SEQ ID N0.1所示序列的第1735位或SEQ ID N0.2所示序列中的第482位。
[0022]國際P450等位基因命名委員會關(guān)于CYP2D6等位基因命名規(guī)則中規(guī)定:以CYP2D6基因組DNA參考序列(GenBank注冊號M33388)中起始密碼子ATG的第一個堿基A作為CYP2D6等位基因的第I位(起始密碼子的第一個堿基A位于M33388序列的第1620位)，則本發(fā)明確定的突變點位于CYP2D6等位基因的第1735位(SEQ ID N0.1)。
[0023]本
【發(fā)明內(nèi)容】
涉及CYP2D6基因的非同義突變。由于該突變位點位于基因的編碼序列中，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，所述突變位點既可以在基因組DNA中表現(xiàn)，也可以在編碼序列(即CDS)中表現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待檢測樣品，可以在基因組DNA或mRNA水平上對該突變位點進行檢測。本申請中，SEQ ID N0.1是根據(jù)國際P450等位基因命名委員會的規(guī)定定義的本發(fā)明的CYP2D6等位基因序列，其中第1735位是本發(fā)明涉及的突變位點。SEQ ID N0.2是具有所述突變位點的CYP2D6基因的cDNA序列，其中第482位是本發(fā)明涉及的突變位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文中，對應于SEQ ID N0.1的第1735位位點和對應于SEQ ID N0.2的第482位位點同義互用。
[0024]在本發(fā)明中，“等位基因特異性”指特異地與等位基因雜交，如在嚴謹條件下進行雜交，使得鑒定對應于SEQ ID N0.1所示序列的第1735位或SEQ ID N0.2所示序列的第482位核苷酸為C。
[0025]本發(fā)明中，核苷酸和氨基酸的縮寫采用本領(lǐng)域公知的縮寫方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鳥嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸，I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示賴氨酸，M表示蛋氨酸，F(xiàn)表不苯丙氨酸,P表不脯氨酸，S表不絲氨酸,T表不蘇氨酸，W表不色氨酸，Y表不酪氨酸，V表示纈氨酸。
[0026]本發(fā)明的內(nèi)容是基于CYP2D6基因的新的單堿基突變位點。所述突變位點是位于CYP2D6基因的編碼區(qū)內(nèi)，對應于SEQ ID N0.2的第482位，該位點由野生型的G突變?yōu)镃 ；此外，由該突變的CYP2D6基因編碼的蛋白的第161位由半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸(C161S)。
[0027]在第一個方面，本發(fā)明提供核酸片段，所述核酸片段包含對應于SEQ ID N0.1的第1735位的突變位點，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第1735位的核苷酸是C ;或者所述核酸片段包含對應于SEQ ID N0.2的第482位的突變位點，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第482位的核苷酸是C ;或者為上述核酸片段的反向互補序列。
[0028]在一種實施方式中，所述核酸片段的長度可以是如10-100、101-200、201-500或501-1000個核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸片段的長度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-100或101-300個核苷酸。
[0029]所述突變位點可以位于所述核酸片段的任何位置。
[0030]在另一種實施方式中，所述核酸片段是SEQ ID N0.1所示的序列。
[0031]在另一種實施方式中，所述核酸片段是SEQ ID N0.2所示的序列。
[0032]在其它實施方式中，所述核酸片段可以是SEQ ID N0.14-18所示的序列。
[0033]本發(fā)明的第二個方面是提供與含有對應于SEQ ID N0.1的第1735位或?qū)赟EQID N0.2的第482位的突變位點的等位基因片段或其反向互補序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的突變位點的核苷酸是C ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸或其反向互補序列。
[0034]在一種實施方式中，所述的寡核苷酸用作探針。所述探針能夠在嚴謹條件下與包含突變位點的靶序列特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述探針不需要與靶序列完全互補，只要能與靶序列特異雜交即可。在優(yōu)選的實施方案中，所述雜交條件可以滿足使探針僅與靶序列特異性雜交。所述探針的長度可以是5-100個核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。所述突變位點可以出現(xiàn)在探針的任何位置。在優(yōu)選的實施方式中，所述突變位點出現(xiàn)在探針序列的中心或大約中心處。
[0035]在另一種實施方式中，所述寡核苷酸用作指導DNA合成的引物，如本領(lǐng)域公知的測序引物或合成引物等。所述引物不需要與模板完全互補，但應當與模板互補雜交以指導DNA合成。所述引物的長度可以是15-40個核苷酸長度，優(yōu)選地為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。所述突變位點可以出現(xiàn)在所述引物的任何位置；優(yōu)選地，所述突變位點出現(xiàn)在所述引物的3’末端。
[0036]在一些優(yōu)選的實施方式中，所述寡核苷酸是如SEQ ID N0.19_23所示的序列。
[0037]基于此，本發(fā)明的第三個方面是提供用于檢測和/或分析單堿基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含能夠作為引物擴增所述單堿基突變但不包含該單堿基的核酸片段；所述單堿基對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位。優(yōu)選地，所述試劑盒包含SEQ ID N0.4和/或SEQ IDN0.5和/或SEQ ID N0.10所示的序列片段。
[0038]本發(fā)明的第四個方面是提供本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸用于檢測CYP2D6基因突變的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物；或者本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸用于制備檢測CYP2D6基因突變的藥物的應用；或者本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸用作檢測CYP2D6基因突變的檢驗標志物的應用。
[0039]本發(fā)明的第五個方面是提供用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2D6基因的對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的堿基。當檢測到的CYP2D6基因在對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的位點為C時，相對應地調(diào)整經(jīng)CYP2D6代謝的藥物的給藥量。在具體的實施例中，當CYP2D6基因在SEQ ID N0.2的第482位的位點為C時，該基因編碼的CYP2D6蛋白酶活性下降，故需要調(diào)整經(jīng)CYP2D6代謝的藥物的給藥量，如下調(diào)給藥量。
[0040]本發(fā)明中所述的經(jīng)CYP2D6代謝的藥物包括:β受體阻滯劑，普萘洛爾、美托洛爾、烯丙洛爾、丁呋洛爾、噻嗎洛爾、布尼洛爾、卡維地洛、阿普洛爾、奈必洛爾；抗心律失常藥，英卡胺、司巴丁、氟卡胺、普羅帕酮、阿普林定、美西律、恩卡胺、普魯卡因胺；抗高血壓藥，異喹胍、吲哚拉明；抗心絞痛，哌克昔林、特羅地林；鎮(zhèn)痛藥，曲馬多；抗精神藥，氯丙嗪、奮乃靜、氟哌啶醇、利培酮、硫利達嗪、珠氯噻醇、阿立哌唑；三環(huán)類抗抑郁藥，阿米替林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、地昔帕明、去甲替林；其他抗抑郁藥，氟西汀、帕羅西汀、文拉法辛、氟伏沙明、阿米夫胺、米安色林、溴法羅明、馬普替林、托莫西汀、苯丙胺、西酞普蘭、氟戊肟胺、米那普林、度洛西汀、嗎氯貝胺；止咳平喘藥，雙氫可待因、乙基嗎啡、可待因、右美沙芬；抗糖尿病藥，苯乙雙胍；其他，撲爾敏、甲氧氯普胺、阿托西汀、右旋芬氟拉明、昂丹司瓊、安非他命、利多卡因、奧坦西隆、非那西丁、三苯氯胺、右芬氟拉明、異丙嗪。
[0041 ] 本發(fā)明的第六個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.1的序列的核酸 中對應于第1735位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應于第482位的核苷酸。
[0042]在一種實施方式中，所述方法可以是限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
設計實驗以分析SEQ ID N0.1的序列的核酸中的第1735位的核苷酸或SEQ ID N0.2的序列的核酸中的第482位的核苷酸是否為C。
[0043]在另一種實施方式中，所述方法可以是測序法，包括分離并測定來自基因組DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含對應于SEQ ID N0.1的序列的核酸中的對應于第1735位的核苷酸或包含對應于SEQ ID N0.2的序列的核酸中的對應于第482位的核苷酸是否為C。測序法可以是本領(lǐng)域已知的任何可用的測序方法。測序引物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識進行設計，如在待檢測位點的上下游適當位置處設計引物，以擴展包含該待測位點的片段，從而判斷該位點的核苷酸。也可以采用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物序列。
[0044]在另一種實施方式中，所述方法是利用探針雜交的方法，特異性地鑒定檢測樣品中包含對應于SEQ ID N0.1的序列的核酸中的對應于第1735位的核苷酸或包含對應于SEQID N0.2的序列的核酸中對應于第482位的核苷酸是否為C ;所述方法中采用的探針是本發(fā)明的寡核苷酸。例如，從待測樣品中分離出核酸，在允許探針與核酸中可能存在的特異性靶序列雜交的條件下使探針與核酸接觸；可被檢測的雜交可以通過使用由可檢測的試劑標記過的探針來實現(xiàn)；例如，用放射性同位素、熒光染料或能催化形成可檢測產(chǎn)物的酶來標記探針。標記探針、用標記探針檢測樣品中是否存在靶序列的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0045]在一種具體的實施方式中，提供以Taqman探針SNP檢測法檢測對應于SEQ IDN0.1的第1735位的核苷酸的方法，包括:
[0046]I)設計引物用于特異性擴增包含對應于SEQ ID N0.1的第1735位的PCR產(chǎn)物，同時設計兩條Taqman-MGB探針，分別針對對應于SEQ ID N0.1的第1735位的G和C等位基因。
[0047]引物設計原則為:[0048](1)序列選取應在基因的保守區(qū)段；
[0049](2)避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
[0050](3)引物長度在18到24個核苷酸；
[0051](4) Tm 值在 55-65°C，GC 含量在 40%_60% ；
[0052](5 )引物之間的Tm值相差避免超過2 V ；
[0053](6)引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的喊基；
[0054](7) PCR 擴增片段長度在 50bp — 150bp ；
[0055](8)引物末端最后5個核苷酸不能有超過2個的G和C。
[0056]Taqman MGB探針設計原則為:
[0057](I)探針的5’端避免出現(xiàn)G ;
[0058](2) Tm 值應為 65-67O ；
[0059](3)盡量縮短Taqman MGB探針,但探針長度不少于13bp ；
[0060](4)盡量避免出現(xiàn)重復的堿基，尤其是G堿基，避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復出現(xiàn)；
[0061](5)將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。
[0062]熒光基團可以采用FAM、VIC等來標記兩個等位基因。
[0063]2)利用上述引物和探針，對待測樣本進行實時定量PCR。
[0064]PCR條件:95°C預變性10分鐘后進入30個擴增循環(huán):92°C變性12秒，60°C退火及延伸I分鐘(此階段檢測熒光信號)。
[0065]3)數(shù)據(jù)分析。
[0066]分析實驗結(jié)果，根據(jù)樣本兩種熒光的強弱判定待測樣本CYP2D6基因是否存在1735G>C 突變。
[0067]本發(fā)明中，所述樣品可以是任何包含核酸的樣品，如血液；優(yōu)選所述樣品來自于人。所述核酸可以是DNA或編碼RNA，優(yōu)選為基因組DNA。本發(fā)明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA為目標物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，當以DNA為檢測目標物時，分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應于第1735位的核苷酸，所使用的探針或引物根據(jù)SEQ ID N0.1的序列設計；當以RNA為檢測目標物時，分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應于第482位的核苷酸，所使用的探針或引物根據(jù)SEQ IDN0.2的序列設計。
[0068]本發(fā)明的第七個方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQID N0.3所示的序列；所述片段或變異體包含對應于SEQ ID N0.3的第161位的絲氨酸，且為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸，如10_20、21_50或51-100個
氨基酸。
[0069]下面將通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明，但以下具體的實施例僅出于示例性的目的。
[0070]實施例1:人CYP2D6基因新的突變位點的鑒定
[0071]本實施例中，采集漢族正常健康人群血液樣本，提取血液中的基因組DNA，設計測序引物對CYP2D6基因的9個外顯子進行序列擴增、測序，分析其CYP2D6基因是否存在突變位點。
[0072]I)提取 DNA:
[0073]從被測者采取5ml靜脈EDTA抗凝血液樣本；然后按照普通鹽析法和/或采用專門的DNA提取試劑盒(購自美國Omega公司的DNA提取試劑盒)提取待測血樣的基因組DNA。
[0074]2) PCR 擴增:
[0075]設計擴增引物，對獲得的基因組DNA樣品中CYP2D6基因的9個外顯子序列進行擴增。所述擴增引物對序列見表1。
[0076]采用30yL PCR反應體系，包括:I XGC PCR緩沖液、L5mM MgCl2、IOOng的基因組DNA、上下游引物均為0.2 μ M、dNTP為0.2mM、TaKaRa公司的LATaqDNA聚合酶1.5U。使用美國ABI公司的GeneAmp PCR System9700擴增儀擴增。PCR擴增循環(huán)參數(shù)如下:94°C預變性2分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，68°C延伸3分鐘，35個循環(huán)后再延伸3分鐘。引物序列信息見表1。
[0077]表1:擴增引物對序列信息
[0078]
【權(quán)利要求】
1.核酸片段，所述核酸片段包含對應于SEQID N0.1的第1735位的突變位點，且是SEQID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第1735位的核苷酸是C ;或者所述核酸片段包含對應于SEQ ID N0.2的第482位的突變位點，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第482位的核苷酸是C ;或者為上述核酸片段的反向互補序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的長度是10-100、101-200,201-500或501-1000個核苷酸；優(yōu)選地，所述核酸片段的長度是10_20、21_30、31-40,41-50,51-60,61-100或101-300個核苷酸；進一步優(yōu)選地，所述核酸片段是SEQ IDN0.1、2或14-18所示的序列。
3.等位基因特異性寡核苷酸，所述寡核苷酸與含有對應于SEQID N0.1的第1735位或?qū)赟EQ ID N0.2的第482位的突變位點的等位基因片段或其反向互補序列全部或部分雜交，其中SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的突變位點的核苷酸是C ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸或其反向互補序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的等位基因特異性寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是探針或引物；優(yōu)選地，當所述寡核苷酸是探針時，所述寡核苷酸的長度是5-100個核苷酸；當所述寡核苷酸是引物時，所述寡核苷酸的長度是15-40個核苷酸；優(yōu)選地，當所述寡核苷酸是探針時，所述突變位 點位于探針序列的中心或大約中心處；當所述寡核苷酸是引物時，所述突變位點位于引物的3’末端。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的等位基因特異性寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是如SEQ ID N0.19-23所示的序列。
6.一種用于檢測和/或分析單堿基突變的試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸片段或根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的等位基因特異性寡核苷酸，或包含能夠作為引物擴增所述單堿基突變但不包含該單堿基的核酸片段；所述單堿基對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位；優(yōu)選地，所述試劑盒包含SEQ ID N0.4和/或SEQ IDN0.5和/或SEQ ID N0.10所示的序列片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸片段或根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的等位基因特異性寡核苷酸在檢測CYP2D6基因突變中的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物；或者在制備檢測CYP2D6基因突變的藥物中的應用；或者用作檢測CYP2D6基因突變的檢驗標志物的應用。
8.一種用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2D6基因的對應于SEQ ID N0.1的第1735位或SEQ ID N0.2的第482位的堿基，當所述位點的堿基是C時，調(diào)整經(jīng)CYP2D6代謝的藥物的給藥量。
9.一種分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.1的序列的核酸中對應于第1735位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應于SEQ ID N0.2的序列的核酸中對應于第482位的核苷酸；優(yōu)選地，所述方法是測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析或探針雜交法。
10.CYP2D6蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQ ID N0.3所示的序列；所述片段或變異體包含對應于SEQ ID N0.3的第161位的絲氨酸，且為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的至少10 個連續(xù)氨基酸。
【文檔編號】C12N15/53GK103614388SQ201310398136
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】蔡劍平, 胡國新, 戴大鵬, 耿培武, 蔡杰 申請人:蔡劍平