本發(fā)明屬于微生物基因資源和基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種創(chuàng)新霉素生物合成基因簇、包含其的載體、宿主及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

創(chuàng)新霉素(chuangxinmycin，CXM)與色氨酸(tryptophan)有結(jié)構(gòu)上的相似性(見式(I))，是一種高效的細(xì)菌色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)的選擇性抑制劑。

比如創(chuàng)新霉素對(duì)大腸桿菌的TrpRS的IC50為30nM，但是其在30μM濃度下對(duì)綿羊的TrpRS沒有抑制作用，顯示了創(chuàng)新霉素是一種特異性的抑制劑(Brown et al,2002)。最近的研究表明色氨酰tRNA合成酶抑制劑(吲哚霉素和創(chuàng)新霉素)能夠擾亂與氯霉素、紅霉素和萬古霉素抗性相關(guān)的富含色氨酸的蛋白的生物合成，從而減弱細(xì)菌對(duì)氯霉素、紅霉素和萬古霉素的抗性，因此色氨酰tRNA合成酶抑制劑與另外的抗生素聯(lián)用可以降低細(xì)菌的多重抗藥性。創(chuàng)新霉素是中國發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)全新結(jié)構(gòu)的新抗生素，由濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)產(chǎn)生，其分子的主核為罕見的吲哚并噻喃三環(huán)結(jié)構(gòu)，這在化學(xué)上是一個(gè)新的含硫的雜環(huán)體系。最初報(bào)道該抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和痢疾志賀菌有較強(qiáng)的抗菌活性，并對(duì)感染了痢疾志賀菌和大腸桿菌的小鼠模型顯示出體內(nèi)抗菌活性。初步臨床試驗(yàn)表明它對(duì)于大腸桿菌引起的敗血癥、膽囊炎和尿路感染有顯著的療效(有效率達(dá)77.86％)。體外和體內(nèi)的聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)表明，創(chuàng)新霉素與慶大霉素、新霉素、巴龍霉素、卡那霉素B、多黏霉素、氨芐青霉素、青霉素和頭孢菌素I等8種抗生素有不同程度的協(xié)同作用，提高創(chuàng)新霉素抗菌作用4～32倍，有可能提高臨床療效，防止或延緩耐藥性的產(chǎn)生。但是由于其發(fā)酵單位太低導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，抗菌譜較窄，僅能口服，且抗菌活性低于目前臨床上其他抗菌藥物，致使其仍未廣泛用于臨床。

關(guān)于創(chuàng)新霉素的生物合成機(jī)理及其相關(guān)重要的酶學(xué)研究還沒有得到驗(yàn)證。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來說，創(chuàng)新霉素屬于吲哚類生物堿，很有可能是利用色氨酸作為起始單元進(jìn)行生物合成的，但是它的具體的生物合成途徑依然未知。我國學(xué)者曾對(duì)創(chuàng)新霉素的生物合成進(jìn)行了初步的研究，利用同位素標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新霉素分子中噻喃環(huán)的硫直接來自半胱氨酸的巰基，應(yīng)用標(biāo)記甲基供體S-腺苷-L-[甲基-¹⁴C]甲硫氨酸(SAM)測(cè)定創(chuàng)新霉素產(chǎn)生菌無細(xì)胞提取物對(duì)吲哚丙酮酸的甲基化作用，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新霉素產(chǎn)生菌中存在吲哚丙酮酸碳甲基轉(zhuǎn)移酶(indolepyruvate C-methyltransferase)可能負(fù)責(zé)C-2的甲基化，其分子量是55000±5000道爾頓。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)創(chuàng)新霉素生物合成基因簇、包含其的載體及宿主和利用基因表達(dá)編碼蛋白用于催化合成抗生素創(chuàng)新霉素或其類似物應(yīng)用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇、包含其的載體、宿主及其應(yīng)用。利用本發(fā)明的基因簇可實(shí)施發(fā)酵生產(chǎn)創(chuàng)新霉素，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新霉素的生物合成。

本發(fā)明所述的創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇，其特征在于，該基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，命名為cxm；其包含編碼創(chuàng)新霉素生物合成所涉及的10個(gè)基因，其中7個(gè)是與生物合成相關(guān)基因，1個(gè)是調(diào)控基因，1個(gè)抗性基因，1個(gè)是轉(zhuǎn)運(yùn)基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.11所示，具體是：

(1)抗性蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，命名為cxm0，其位于基因簇核苷酸序列第1-966個(gè)堿基處，長度為966個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)色氨酰tRNA合成酶，321個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.12所示；

(2)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，命名為Cxm1，其位于基因簇核苷酸序列第1177-2199個(gè)堿基處，長度為1023個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，340個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.13所示；

(3)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，命名為Cxm2，其位于基因簇核苷酸序列第2415-3905個(gè)堿基處，長度為1491個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，496個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.14所示；

(4)巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sulfur carrier protein)激活蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，命名為cxm3，其位于基因簇核苷酸序列第3974-4690個(gè)堿基處，長度為717個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)功能未知蛋白，238個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.15所示；

(5)巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sulfur carrier protein)基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，命名為cxm4，其位于基因簇核苷酸序列第4694-4996個(gè)堿基處，長度為303個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，100個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.16所示；

(6)細(xì)胞色素P450酶基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，命名為cxm5，其位于基因簇核苷酸序列第4993-6207個(gè)堿基處，長度為1215個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)細(xì)胞色素P450酶，404個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.17所示；

(7)酮泛解酸還原酶基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，命名為cxm6，其位于基因簇核苷酸序列第6204-7160個(gè)堿基處，長度為957個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)細(xì)胞色素P450酶，318個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.18所示；

(8)5-磷酸吡哆醛(PLP)依賴型氨基轉(zhuǎn)移酶基因，該基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示，命名為cxm7，其位于基因簇核苷酸序列第7157-8245個(gè)堿基處，長度為1089個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)PLP依賴型氨基轉(zhuǎn)移酶，362個(gè)氨基酸，如SEQ ID No.19所示；

(9)自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，命名為cxm8，其位于基因簇核苷酸序列第8318-10189個(gè)堿基處，長度為1872個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，623個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.20所示；

(10)自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，命名為cxm9，其位于基因簇核苷酸序列第10186-10917個(gè)堿基處，長度為732個(gè)堿基對(duì)，編碼一個(gè)自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白，243個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.21所示。

本發(fā)明所述創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇核苷酸序列cxm的互補(bǔ)序列可根據(jù)DNA堿基互補(bǔ)原則隨時(shí)得到。序列SEQ ID No.1的核苷酸序列或者部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用合適的限制性內(nèi)切酶酶切相應(yīng)的DNA或使用Red/ET同源重組技術(shù)的線性重組LLHR得到。

本發(fā)明所述創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇表達(dá)的編碼蛋白。

其中，所述編碼蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID No.12～SEQ ID No.21所示。

本發(fā)明所述創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇或其表達(dá)的編碼蛋白在催化合成創(chuàng)新霉素或其類似物中的應(yīng)用。

創(chuàng)新霉素生物合成基因簇的直接克隆、異源表達(dá)和遺傳操作證實(shí)，利用本發(fā)明所述創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇通過生物技術(shù)表達(dá)編碼蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.12～SEQ ID No.21所示)可用于催化合成抗生素創(chuàng)新霉素或其類似物、或者催化合成含噻喃或者吲哚并噻喃三環(huán)結(jié)構(gòu)單元的化合物。

創(chuàng)新霉素為色氨酸結(jié)構(gòu)類似物，根據(jù)基因單敲除實(shí)驗(yàn)推測(cè)其生物合成是以色氨酸起始，經(jīng)氨基轉(zhuǎn)移酶Cxm7的脫氨基作用，形成吲哚丙酮酸，吲哚丙酮酸在硫載體蛋白Cxm4及硫載體蛋白激活蛋白的共同催化加上硫原子形成不穩(wěn)定的吲哚硫碳酸化合物，之后在細(xì)胞色素P450Cxm5和還原酶Cxm6的共同催化下含硫六元環(huán)閉合形成去甲基創(chuàng)新霉素，去甲基創(chuàng)新霉素在甲基轉(zhuǎn)移酶Cxm8及其蛋白Cxm9的催化下加上甲基，形成創(chuàng)新霉素。

本發(fā)明所述的一種重組載體，其特征在于，該重組載體包含本發(fā)明所述的創(chuàng)新霉素生物合成基因簇。而且該載體中的創(chuàng)新霉素生物合成基因被中斷、被置換或同框缺失，至少其中之一的基因包含有序列SEQ ID No.1中的核苷酸序列。

其中，上述重組載體優(yōu)選是p15A-cm-apra-cxm。

本發(fā)明所述的一種宿主，其特征在于，該宿主包含上述的重組載體。

其中，所述宿主優(yōu)選為鏈霉菌、假單胞菌、伯克氏菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、植物或動(dòng)物。最優(yōu)選為天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)、白色鏈霉菌J1074或變鉛青鏈霉菌K4-114。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

利用本發(fā)明的基因簇可發(fā)酵生產(chǎn)創(chuàng)新霉素，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新霉素的生物合成；同時(shí)，本發(fā)明所提供的包含創(chuàng)新霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息有助于闡明與理解創(chuàng)新霉素類抗生素的生物合成的分子機(jī)理，為利用基因工程手段改造提供理論基礎(chǔ)與材料。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。

附圖說明

圖1為創(chuàng)新霉素生物合成基因簇的基因組成。

其中：Resistance：抗性基因；Regulator:調(diào)控基因：Transporter:轉(zhuǎn)運(yùn)基因；Biosynthesis：合成基因。

圖2為帶有創(chuàng)新霉素生物合成基因簇的重組載體。

其中：Apra：安普霉素抗性基因；Cm：氯霉素抗性基因；Int：位點(diǎn)特異性重組酶integrase；P15A：P15A復(fù)制子。

圖3為創(chuàng)新霉素生物合成基因簇的異源表達(dá)及與創(chuàng)新霉素生物合成相關(guān)的10個(gè)基因的同框缺失突變分析。

其中：CXM：創(chuàng)新霉素；Dem-CXM：去甲基創(chuàng)新霉素；A3(2)：天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)；J1074：白色鏈霉菌J1074；K4-114：變鉛青鏈霉菌K4-114；A3(2)/cxm：重組有cxm基因簇的天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)；J1074/cxm：重組有cxm基因簇的白色鏈霉菌J1074；K4-114/cxm：重組有cxm基因簇的天變鉛青鏈霉菌K4-114；

A3(2)/cxm△cxm0：為將cxm中的cxm0同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm1：為將cxm中的cxm1同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm2：為將cxm中的cxm2同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm3：為將cxm中的cxm3同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm4：為將cxm中的cxm4同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm5：為將cxm中的cxm5同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm6：為將cxm中的cxm6同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm7：為將cxm中的cxm7同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm8：為將cxm中的cxm8同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中；

A3(2)/cxm△cxm9：為將cxm中的cxm9同框敲除后，轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容作進(jìn)一步闡述。實(shí)施例中所描述的內(nèi)容僅用于解釋和說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制本發(fā)明權(quán)利要求所界定的保護(hù)范圍。

一般性說明：如下實(shí)施例所涉及的限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司，DNA聚合酶、T4連接酶均購自Takara公司，質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒購自Qiangen公司，操作完全按照相應(yīng)說明書進(jìn)行。質(zhì)粒構(gòu)建中基因測(cè)序及引物合成由上海生工公司完成。質(zhì)粒p15A-cm-ccdB見文獻(xiàn)(Wang H,et al.Improved seamless mutagenesis by recombineering using ccdB for counterselection.Nucleic Acids Research,2014,42(5):e37)、菌株GB05，GB05dir，GB05Red見文獻(xiàn)(Fu J.et al.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.Nature Biotechnolgy,2012,30:440-446)，天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)見文獻(xiàn)(Bentley SD,et al.Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Nature,2002,417:141-147)、白色鏈霉菌J1074見文獻(xiàn)(Zaburannyi N,et al.Insights into naturally minimised Streptomyces albus J1074genome.BMC Genomics,2014,15:97)，變鉛青鏈霉菌K4-114見文獻(xiàn)(Ziermann R,etal.Recombinant Polyketide Synthesis in Streptomyces:Engineering of Improved Host Strains.BioTechniques,1999,26:106-110)。上述菌株均為科研實(shí)驗(yàn)常用宿主，均可通過公開的保藏機(jī)構(gòu)購買或?qū)嶒?yàn)室分享等方式獲得。濟(jì)南游動(dòng)放線菌購于中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所(CPCC240351)。實(shí)施例中的其他實(shí)驗(yàn)方法及試劑如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。

實(shí)施例1：創(chuàng)新霉素產(chǎn)生菌濟(jì)南游動(dòng)放線菌基因組DNA的提取及測(cè)序

將濟(jì)南游動(dòng)放線菌菌株從-80℃接種至高氏固體平板中，30℃培養(yǎng)4天，刮取菌體接種至168G(葡萄糖22g，牛肉膏4g，蛋白胨5g，酵母提取物0.5g，酪胨3g，食鹽1.5g，加水900mL高溫滅菌，甘氨酸10g加入100mL水單獨(dú)滅菌，使用時(shí)向培養(yǎng)基中添加十分之一體積的10％甘氨酸)培養(yǎng)基中50mL/250mL三角瓶，30℃，150rpm培養(yǎng)4天，菌體成乳白色小團(tuán)狀，分裝1.8mL至2mL離心管中，13000rpm離心5分鐘，倒掉上清后用1.6mL的水洗滌，13000rpm離心5分鐘倒掉上清，用450μL pH8.0的10mM Tris-HCl重懸菌體，加入30μL 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，加入40μL 10％SDS，旋轉(zhuǎn)混勻，40℃水浴2小時(shí)，管內(nèi)液體變?yōu)橥该?，加?00μL酚氯仿異戊醇(25:24:1)，將離心管旋轉(zhuǎn)30次混勻，液體完全變?yōu)榘咨?4600rpm離心10分鐘，用剪過的槍尖吸取上清，不要吸到白色層，轉(zhuǎn)移至另一新的2mL離心管，加入500μL酚氯仿異戊醇(25:24:1)，將離心管旋轉(zhuǎn)30次混勻，液體完全變?yōu)榘咨?4600rpm離心10分鐘，用剪過的槍尖吸取上清300μL，不要吸到白色層，轉(zhuǎn)移至另一新的2mL離心管，加入30μL pH7.5的3M醋酸鈉，混勻后加入900μL的無水乙醇，混勻，有大團(tuán)的DNA出現(xiàn)，將其鉤出置于新的離心管，加1.8mL70％乙醇洗滌，10000rpm離心1分鐘，加入200μl水溶解，加RNaseA使終濃度為10μg/mL，37℃溫育1小時(shí)。依次用等體積的酚氯仿異戊醇抽提兩次，向水相中加入0.1體積的3M醋酸，2體積的無水乙醇,輕輕的混合充分,有絮狀DNA出現(xiàn)。將四管DNA合并到1管(每管中有1.8mL70％乙醇用于洗滌),將液體吸出，再加1mL無水乙醇洗滌，吸出乙醇,自然晾干，溶于200μL的水中。

基因組提取后構(gòu)建10kb SMRTbell DNA文庫，使用PacBio RS II單分子測(cè)序，獲得50X的數(shù)據(jù)量，開發(fā)適用于細(xì)菌基因組分析的軟件，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除接頭、引物及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行de novo組裝和分析，基因功能注釋采用BLAST軟件與NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NR)及SwissProt、KEGG、GO等4個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。利用生物信息學(xué)工具antiSAMSH菌株中所有的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行分析。

濟(jì)南游動(dòng)放線菌的基因組大小為8,397,261bp，GC含量為70.81％，其中包含7,673個(gè)基因，基因總長度為7,170,756，基因平均長度為935bp，共預(yù)測(cè)得到19個(gè)基因簇，其中PKS/NRPS類型基因簇有6個(gè)，細(xì)菌素基因簇3個(gè)。

通過抗性基因cxm0(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)尋找創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇。

由于創(chuàng)新霉素的結(jié)構(gòu)與色氨酸類似，推斷其是由色氨酸作為底物合成，可能與創(chuàng)新霉素的結(jié)構(gòu)類似物吲哚霉素的基因簇一樣，基因簇內(nèi)部包含tryptophanyl-tRNAsynthetase，通過對(duì)基因組進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)2個(gè)tryptophanyl-tRNA synthetase的編碼基因，其中第二個(gè)編碼基因cxm0與吲哚霉素生物合成的抗性基因蛋白Ind0高度同源，相似度達(dá)74.4％，它位于一個(gè)基因簇中，這個(gè)基因簇包括10個(gè)基因，1個(gè)抗性基因cxm0(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白cxm1(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，1個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cxm2(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)，7個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別為cxm3可能為SCP(硫載體蛋白)激活蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)，cxm4為SCP(硫載體蛋白)基因(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)，cxm5為P450(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)，cxm6為還原酶(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)，cxm7氨基轉(zhuǎn)移酶(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)，cxm8為自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)，cxm9可能為蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)，綜上推斷cxm0～9這一11Kb的序列為創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇。(見圖1)

實(shí)施例2：創(chuàng)新霉素生物合成基因簇的直接克隆

濟(jì)南游動(dòng)放線菌提取基因組DNA后，取200μl，約300μg/μl，用EcoRV和AscⅠ進(jìn)行雙酶切，400μl酶切體系，37℃溫育3小時(shí)后，酚氯仿抽提DNA一次，然后乙醇沉淀回收，用少量ddH₂O溶解。線性克隆載體p15A-cm-HA，HA為創(chuàng)新霉素基因簇的同源臂，用質(zhì)粒p15A-cm-tetR-ccdB-hgy擴(kuò)增獲得。5μg的基因組DNA與0.5μg的線性克隆載體共同電轉(zhuǎn)至經(jīng)過誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的GB05dir中，37℃復(fù)蘇1小時(shí)，涂布至含有cm的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取克隆用含有cm的LB培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，含有cxm基因簇的重組質(zhì)粒p15A-cm-cxm進(jìn)行酶切鑒定，挑取正確的克隆對(duì)整個(gè)基因簇進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示11Kb的基因序列無突變。

實(shí)施例3：創(chuàng)新霉素生物合成基因簇的異源表達(dá)

以pSET152為模板，擴(kuò)增攜帶同源臂的intgrase-attP-oriT-apra，得到的PCR產(chǎn)物與基因簇直接克隆后的質(zhì)粒p15A-cm-cxm共同轉(zhuǎn)化至經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)重組酶的菌株GB05red中進(jìn)行線環(huán)重組，挑取克隆酶切鑒定，得到整合有創(chuàng)新霉素基因簇的結(jié)合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p15A-cm-apra-cxm，將此質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至結(jié)合轉(zhuǎn)移供體菌ET12567/pUZ8002，質(zhì)粒p15A-cm-apra-cxm通過結(jié)合轉(zhuǎn)移移至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中并整合到其染色體的attB位點(diǎn)，37℃培養(yǎng)17h-18h后用l ml無菌水含適量抗生素和萘啶酮酸(用來抑制大腸桿菌的生長)來覆蓋，倒置30℃培養(yǎng)7天后即可看到接合子生長，挑取克隆PCR驗(yàn)證，將正確的克隆接種至添加安普霉素(50μg/mL)和萘啶酮酸(25μg/mL)的M1(可溶性淀粉10g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L)液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，50mL/250mL，200rpm，30℃培養(yǎng)7天。

創(chuàng)新霉素的分離純化

用6M HCl將發(fā)酵液pH調(diào)至2～3，用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液萃取三次，合并乙酸乙酯，減壓蒸干，用1mL甲醇溶解，0.22μm膜過濾，-80℃保存。

創(chuàng)新霉素的分析

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物使用的是布魯克公司的impact HDmicroTOF-Q III系統(tǒng)。

LC條件：色譜柱為YMC-PACK ODS-A(C18,250×4.6mm,5μm,12nm)，流動(dòng)相為(水：A；Merck HPLC級(jí)乙睛：B，分別添加0.1％甲酸，(0-5min 5％B，5-45min 5％-95％，45-60min 95％B，60-65min 5％B))流速為0.75ml/min，檢測(cè)器DAD，柱溫為25℃，質(zhì)譜檢測(cè)是在離子阱的負(fù)離子模式下進(jìn)行，掃描范圍m/z＝100-1000，autoMS2，進(jìn)樣量3μL。

實(shí)施例4：與創(chuàng)新霉素生物合成相關(guān)的10個(gè)基因的同框缺失

以兩側(cè)攜帶PacI酶切位點(diǎn)的amp抗性基因?yàn)榇虬休d體，分別設(shè)計(jì)10對(duì)含有對(duì)應(yīng)同源臂的引物，擴(kuò)增后得到含有amp抗性基因、PacⅠ酶切位點(diǎn)及同源臂的PCR產(chǎn)物，與質(zhì)粒p15A-cm-apra-cxm共同電轉(zhuǎn)化至經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)重組酶的GB05red中，37℃復(fù)蘇1小時(shí)，涂布至含有amp和apra的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取克隆培養(yǎng)后酶切鑒定，選取正確的克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用PacⅠ酶切，將酶切體系用0.22μm濾膜除鹽40min，用T4連接酶自身連接，4℃過夜，將T4連接體系用0.22μm濾膜除鹽40min，全部涂布至含有apra的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，長出的克隆經(jīng)過雙劃線篩選后得到除去amp抗性基因的克隆，酶切鑒定并測(cè)序，得到基因單敲除的質(zhì)粒，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中，PCR鑒定，用M1培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，提取粗產(chǎn)物，進(jìn)行LC-MS分析。

結(jié)果見圖3。

序列表

<110>山東大學(xué)蘇州研究院 山東大學(xué)

<120>創(chuàng)新霉素生物合成基因簇及其應(yīng)用

<141> 2017-02-16

<160> 21

<210> 1

<211> 10917

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>創(chuàng)新霉素的生物合成基因簇cxm

<222>（1）…（10917）

<400> 1

ctacttcaga ccggcaaggc tgagcgcacg atccaagcgg tctcgtgacc gcgcccgagc 60

acggtcggcc ccctcagccc ggatcttcgc cagctccgat cgctcttcga ggagctgcag 120

tgcccgctca cgcaccggtg cgatcaggga gatcactgcc tctgcggctg cttccttgag 180

gtcacggtag gaatcgatac ccttcgccgc atcgctcggg agcgtgtcag tgcaggcagc 240

cctgatctcc aggaggttgg caacgcccgg ctgttcgtcc ggggcgtagc ggacggtgtt 300

ttctccgtct gtcactgcgc gttggaactt ccggcgtacg gcctccgggc tgtccaggac 360

gtagacgatg ccgctgccgt ccgaggacga cttcgacatc ttccgcgtag gggcagcgag 420

atcacgtacc cgggctgcgg ctacgggcag gacggcttgc ggaaccgtga acacctcgcc 480

gtagtccgtg ttgaaccgcc gcgccaaggt ccgggccagc tccacatgct ggttctgatc 540

gtgaccgacg ggcacctctg aagcgccatg aagcaggatg tccgccgcca tgaggacggg 600

gtaggtgagc agaccaaggc gtacggagtt gctcccctgg gacttctcct tgaactgcac 660

catccttcga gcctccccga aggtgcaggt gcactcgaga agccacgtca acgccatgtg 720

ctcctggatg aggtccgact gcacgaagag acgttcctgg ggtacgcccg ccgcgatgag 780

taaagcgagt tggtggtcgg tcagttcctg gagacgttcg gggtcgtgct tggtcgtcat 840

ggcgtgcagg ttgctgacga aatacaggtc ttcggggccc gactgtgctg cccaacgacg 900

cactgcccca aggtagttac ccaggtgcgc cttacctgaa ggcgtgatcc cggaaagact 960

gaacattggc cctgatcctc tcgtcttgac cgcatcgacg aggcgggccg accaagttca 1020

gcagcccgtc cctcggagcg gctggctggc tcggtcgagc gcaggttctt gggccgccct 1080

aggcggccca ccaacaaaga ttcctgcgca acatgatcgc gaacgtacca caactggcag 1140

gggccatcag gaagttcctg acagcccctg ctctcatcag gccggagcgg ttccggttgg 1200

tcgaggttct ccgaagagcg tcctgacggc tggatcctgg gctgcggcct gagcgcacct 1260

gacggcgagg cgtaccagtt cggagtcgga accctcacgc caggcaaggg acaaccgggc 1320

ggcaggcaca tccgtcacag ggatgaagac gacgtcctga cggtgctgga ctgccatgac 1380

agagacgggg acgagcgcgg ctgcgttctc gagggccacg aggtcgatgg cctcgtcgag 1440

gcgcgtcgct gtgggaggtt ccttccaggt gcgcttgccg gggcacacct caccacccca 1500

gaagtcggac cactcgggcg acccgccggt ggggcgaatg atcggaacct cgctcaggtc 1560

gtcgatcgac acggagtcac gactggccag ctcgtgagcc gatggcagac agacgacccg 1620

gggtaacagg gccacggtgg ccctctcgag gcccacgtag tccgcgggct ccagcacgaa 1680

ggacacgtca gcgtcccctg cctccaggca tgctgtctgt tcggtccacg gtacgtaccg 1740

gggcactacc tgatactcag ggtgcttttc gcggatgagt tcaatggtcc ggtgtgccag 1800

agggcggctg acggccgggc ggaacgcgac gacgagccgt tcgacatcct gcgaccccgc 1860

ctgccgcatc ctctcgaccg tgacctgcca ctgctgcaac aagttcctcg cgtgagtcag 1920

gaagtcgcgc ccgaccgacg tgagttcgac tctgttgccc gttctgtcca aaagctggag 1980

acccagctct ctttcgagtt gacgaatcgc cacgctcaac ggcggctgtg tcatgtgcag 2040

gcgggccgcg gctcgcgtga acccgccttc ctcggctacg gcaacgaagt acctgaggtg 2100

ccgcaaatcc agttccatat gatcagtata tggccccata cgcaacgggt attggcgtgt 2160

atgtaggcgg ctacatacga tcacccatgc aaggtgcagc tatcgaatct cagccttgac 2220

tgcggggcct gtggaaaatt ccaccggagg tcttcttgtc tttgccgtac gaagtcgctt 2280

tcagcgggtg tatcgcccca aacacaattg acggattctt tgcgcaggca gtgtttaagc 2340

ctcagtgatg tggctccggc cagtggtctc gtgactcagt aaccgccccg accacatccc 2400

cacgggggtc ccccttgtcc tacaacggca cttcgccacg tccaccgtcg atcagcgcga 2460

cgatgacgct gatcgccacc ggcgtctccg tgctgtcgta cgcactcatg cagaccatgg 2520

tcgtcccggc cttgcacgta ctacaggtgc agttacacac ggcctcgacg tggtcggcgt 2580

ggatcctgag tgtgttcctg ctgaccagtg cggcgagcac gcccttgctg agccggctgg 2640

gggaccgcta cagcaagcgc aaagttttgc tgctggttct caccacctac ctgatcggca 2700

cggtcggttg tgctgtggca ggcaatatcg gggttctgat cgcatgccgt gccgtgcagg 2760

gagtcagcct cgcggccatc cccctgtcct tcggcatcct gcgcgacgta cttcctgagc 2820

agcggctgcg ttcgggcctc gggctggtgt cagggaccat cggtgtgggg gccggcatcg 2880

gcctggtcgt gggaggtctg gtcgtcgacc accagtcatg gcgctggctg ttcgccgtcg 2940

ccgcggtact gatcctgggc gcgatcgggc tcgttgcgaa gtacgttccg gaccagcggg 3000

gcgaagccgg cgaaccggtg gacgtgcccg gggcggtgct cctggccttg gtcctcgtcg 3060

cgctgttgct cgcgttgacc aagggcacct catgggggtg ggcgtccaca ggaacgctgg 3120

ctctgttcgg ggcctccgcg gttctcctgg gattgctggt cgtagtcgaa cgaaagtcgc 3180

ccgccccctt gatcgacccc gcggtcgtgg ccggtcgctc cttcgtctcg gtgcacggtg 3240

cggcgttcgt gttcggcgtg gtctcgttcg tgttctacgt cctgctgccg acgtacgccc 3300

agaccgcggc ggatcagcgg ctaccgggcg gagggaccat cggctacggg ctcggggccg 3360

atgtcaccat ggcgggtctg ctccttctgc ccggctcatt ggtgctgttg cctgcgggac 3420

cactagcagg tctgctgcag cgcctgacgt ccgtacgcgc gacgctcgca tcaggcttcg 3480

ccgtgatggc ggtcggggcg atctcgctct gggcgtggaa tgccaacggg tggcaagtgg 3540

cggtcggtta cctggtcgta ggtctcggtt ccggactggt gctgagcgga ctcccgtcgg 3600

tgatcagcga cttgacggag gcccgacgca ccgcaaccgc caatggcgtc aacacggtgg 3660

tgcgcacggc aggcggcgtc gtaggcagtc agctggctgt cgccttgctg gctgcctggc 3720

atatctccgg ttccgatacg ccggcgcgcg acggcttcac caccgccttc tggatcgctg 3780

ccgccgtagc ggcggccgga gggctgttgt gctgggtcgg catcaagacc tccacgctcc 3840

gcggccctcg tatgccaggg gtgactgacc tgcctcgcca gagcgcaggg ggcgtacgcc 3900

catgaacgct ccgcaattcc accgactgcc cagggcctaa ggatttcacc aggaaatctc 3960

agggagggtg taaatggcag gcgtgaaaga tgcccagtat gtgacagctg ctacggatga 4020

cggtctgggt ggcacagcag acagtgcagc cctgctcgac gatctgccgg tgaccgtccg 4080

atttgaaatc gaacccgtca ggcgtttcct gagcagcgca ctgggggagt accaaaaatg 4140

cctggacagc cgcgacgccg atggcgtccc gagccatctg ccgcgtgcat cgggtctgtt 4200

gttcgggcag gtgggcggcg ctgaaatagt gatcagcgat gtggaattcg tgccgaatgt 4260

ccgggacagt gacgagagtg tcatggccga attcgaagcg acgatcgccc cgcagttcgg 4320

cgacgtgtac aagaatccgg ggcgaggatt ctggtccgat gaacagggcg tcttgcaggc 4380

gatcaggcaa cagtcggcga acggcctgga gttgctgggc tccatacatt cacatccgaa 4440

ctggcatgaa atcggcccgc cgcacgaacg gcgccagcgc ctgagcgaac atccgacaca 4500

gatggatgaa taccttttcc ggcagtcatg ctggccagtg aacgtcatct ggtacgtgca 4560

tgagagtagt ggcggtatcg cacatcgggt agcggcctgg cggcccggtg ccgagcaatg 4620

cgacaggctt gacatacgga ttccggcggc gatccatgag cagttcgaag tcctactcga 4680

ggaggaataa gaaatgcccg atgtcaaact tcccgcagcc ttccacgtcc tgaccggcgg 4740

tcggcggcag ttgcctgtcg agggcgccaa tatccgggag gtccttgtcg gtctcgacca 4800

gacctgtccg ggggtcctcg agcgactcat ggaccaggaa gggtccgtga agcgctacgt 4860

caatgtctac cggaacgaca gcgacatcag gagcctcgac ggcctcgaaa cgaaagtgga 4920

gcaccacgac gtcatctgga tagtgccggc ggtagcaggt ggcagcgaag ccgcgcgagc 4980

cgaggagtca cgatgaccga cgtgattccc acggaattct tcaccgagcc cggttcgaat 5040

ccgcacgcga cagccgcgga gtacaggtcc aagtgtccgg tccatcggat caatgttccc 5100

cccggcgccg acgcgtacgc ggtcctcggg aacaaagtcg ttgaggaagc gctcggcgac 5160

tcgcgcctct ccaagcaagt cgagaacctg cccgcccgct atcgagacaa ggccgtggcc 5220

agcagtctcc tcgtggtcgg caacctggga ttcgccgacg cgcccaaaca cacccgcctg 5280

aagaagccca tcagccgggc attcctgccg gccacggtcg cccaactacg cccgcgcatc 5340

caggacatcg tcgacgatct catcgacacc tttccggaga acggcgaaat cgacctgctc 5400

agttccttcg ctctgccgat gccgctcacc gtcatctgcg aatacctggg gataccggtg 5460

gcggaccggc cgctgtttct ggagtggagc tacatcctca gccaggaccc gttgcagcac 5520

gacgaggcgg agctgaaagc cgcgagcgaa gagttcacgg actatttcac caagctcgtg 5580

gccgagcggc gcacggacct gcgggacgac ctgctgagcg agatcatcag ggccagggac 5640

gcaggcgtat acagcgaaac agagctcctt tcgacgctcc tcctgctgat catcgccggt 5700

cacaagacgg tcgccaacat gatcggcaac ggcacagcac tgttgctccg ccatccccag 5760

cagctcgaga tgctccgagc cacccccgag ctgatccctt cggcgatcga ggagatcctg 5820

cgctacgaag ggtcggccgc ctgggcctcg ctgcgggtcg cggcggagga catgcagctc 5880

gcgggagtgg acatacccaa ggggagcttc gtacacctgt cgctgtccag cgcgggtcgt 5940

gatcccgacg tgtacgacga cccggacggt ttcgacgtga cgcggtcacc gaaccgccat 6000

ctgtccttcg gccacggtcc ccacttctgc atcggcgctc cgctgggccg actccagggc 6060

gagatcgcct tctccacgct gttgcgccga ctgccgcgat tcgagctcgc cgtgcctccg 6120

gaagaggtcg cctggctctc cgacagttcg ctcagccggg gcctcgaggc cctcccgata 6180

cgagtgggag agaggttgcc gcgatgacgg aacaaggcgg tccgagcatt gctgtggtgg 6240

gagccggcgg agtaggcggc tatttcggcg gcctgctcgc cgccgccggg catgatgtgc 6300

ggttcctggc ccgcggcgag aacctcgccg cgctcaggcg acaggggctg cgcatcacca 6360

acggctcaag tgacttacgt gtgccggacg ttcgggcgtc ggccgacccg aaggacatcg 6420

gcgaggtcga cttcgtactg ctctgcgtca agacctcaca gctgccggcg gccctcgacg 6480

cgctgggccc gctggtcggc gagcacactg ccgtggtcac ggtgcagaac ggggtggaag 6540

cccctgagca ggtcgcagcc aggatcggcc gcggtcgggt actccccggc agcgtcaggg 6600

tcgtggcctc gacggccggt ccgggcgagt tgaggcacgt gggtcccccc ggcgctctgg 6660

ccttcaccga gtgggacagc actgtgtccg accgggtggc acgactgcgc gaggtgctgc 6720

gtgctgcctc ggtgtccgtg cccgagccga gcgacatctg ggccggcctt tgggcgaagt 6780

tcctgttggt ggtcccgatc ggcagccttg gagccgccac cggcggggcg accatcggcg 6840

agctccggtc gcgcaccggc acccgcaaca ttctgatcgc cggcatgcgg gagatctacg 6900

agaccgggat caagctcgga atcgcgctgc cggcagctgc cgtggacacc gcgacagagc 6960

tcatggacca gcagtcgccc gacgtcacct cctcgctgca acgggacatc ctggcgggac 7020

ggccgtcaga gctcgaagcg tggaccgggg ccgtggtccg cctcgcccgc ggggcgggcc 7080

tgaccgcgcc ggtccacgaa atgctctacg agctgctcgc cacccgcgaa tcacgcacgg 7140

cgaggagtct gcaggcgtga acgtgagatt cgcagaacgc agcaccctgc gggacatgcg 7200

ggcctaccgg gacaaggagt cgtcgaacgc cgaaggcagc tcgcggttca ccttcgacct 7260

gtccagcaac gagctggttc tccccccgct gcctaccgtg cttgccggta tcgaaaaagg 7320

cttgccgcga cttgctcgtt accccgaccc cacagcacgg gacctgaccg aggacattgc 7380

cgggcacttg tgcgtctccc cggatgaggt cgcggtcggc cccggaagcg cgggcgtgct 7440

ccagcagatc cttctcgcac tgtgcggcaa gggcgacgaa gtcgtccatg gctggccggg 7500

attcgatgcc tatccgctgt tggtcgccat ttcaggtgcc accggagtcc acgtgcccct 7560

gactgcgtcc ggcggccacg atctcgatga gatccgcacc cgggtgaatg cgcggaccag 7620

ggtggtgatc ctgtgctccc cgcacaatcc gaccggaacc gtgattgacc aagacgagct 7680

gcacggtttc ctgcgttcgc tgccggctca tgtggtcgcg gtcctcgacg aggcgtacgt 7740

ggagttcgac cggggcgcca atcctccggg tctgccggtg ttgctgagcg agcacagcaa 7800

caccgtggta cttcgaacgt tctccaaggc ctatggcctt gccggcctac gggtcggtta 7860

cgcggccggg ccacggcagg tcatggccac cgtccgcaag acggcaatcc ctttcggagt 7920

gacgcgcttc gcggaacaag ccgcaatgct ctcgctgcgc agcgaggacg aactgtgtga 7980

acgtctggca gcagtggctg cggcacgcga agaactgacc gcggaactca gggaactgag 8040

gctgcccgtc ctgctttccc gagccaactt cgtctggctc ccgctcgctt cggccgccga 8100

gtctttcgcc cggactgcgg ctaccgcagg ggtcaaggtc cgagcctttc cggggcacgg 8160

tgtacggatc tcagtgggag aggccgaggc acatcggacg ctgttggcgg cgctcggccg 8220

ggcggaccgt gggaactggt tctgagaact ctctgcggac aattcttttg cccgtcctca 8280

tacaactcat cgacagcaac tctggggtgg gaagtctgtg aaactcctga tgatcgccat 8340

gccgtggcaa gggctcgaca cgccgtccag cgcgctgggc gtactggggc catgcgtccg 8400

caagaacgcc gccgactgga ccgtcgatga gctgtacgcc aacctccgct gggccgaata 8460

cctgatgcgg gagagcaacg gctccgtcac ctgcgaggac tacgggaaca tcgcggatca 8520

agtcttccac ggcgtagggg actgggtgtt caccccagcg ctgtacgacg tcgacagtta 8580

tcaggtcgac gagtacgcga agttcctcga gcagcgggac atggacccga cacttcccgt 8640

tgagatgcac aagtacgccc ggggattcat ccgggatctc gcggccgaga tcgctgccga 8700

tcctcccgac gtggtcgggt tcacgagcac cttcatgcag aacgtcccgt cgctcgcact 8760

ggccagggag ctgaagaaac tcgcgccggg catccgcacg gtccttggcg gcagcaactg 8820

cgacggagca caaggtcccg cgttgcaccg gaatttcgag caactcgact tcgtgatcag 8880

cggtgagggc gaacgtgcgc tgcccgcgtt gctgaatcgc atcatccggg gcgagagcct 8940

cgccgacgtg ccggggctca gctggagggg ggatgacggg catccggtgg tgaatccacc 9000

ggccacggcg gcgctgccgt tcgccatggt gcccgcgccc ggttacgaca gctactttca 9060

ggccctcgaa aggtcacccg tccgtcacca cgtccgtccg atgctggtcc ttgagacctc 9120

ccgtggttgc tggtggggag aggctcacca atgcacgttc tgcggcctga acggatcgaa 9180

tatcgacttc cggagcaagg cccctgagcg catcgcccag gaagtccggg aactggccga 9240

gcgacaccag atcctcgacc tggtcatggt ggacaacatc ctcgacatga agtatctcaa 9300

tacggccatg cccgagatag ctgccctcga ctgcgatctg cgaattcact acgagatcaa 9360

gtccaatatg aaccgggagc agttgagtag gctgaaagag gcgaacgtcc tcttcgtgca 9420

gcccggtatc gagagcctga gcagccatgt gctgcgcctc atggacaagg gcgtcagtgc 9480

cgcgcacaac gtacggatgc tgcgtgacgg acaggatctc gggctcaacg tgacatggag 9540

catcctctac ggcttcccgg gcgagaccga ggacgactac cgcgggctgc tcaagaaatt 9600

ggccacgctc gagcacctgg agccgccaac cggggcttgg cgcatagccc ttgagcggtt 9660

cagtccctac ttcgaggacc ccacccaggg gttcatgttc cgccgcccct cggaaatata 9720

cgacttcatc taccagatcc cgcaggatca gctgtacgac atggtgttct tcttcgacac 9780

cagcgtccgg ggaatctcag ggcccatcga ggacgagatg aagcaggcct gcgaggaatg 9840

ggccaaggcc tatccgcagg gcaccctttc ctactggacc gatgaccgag gccgggtcgt 9900

catcgaagac cgccgtgcca gctggccgac ggaagtgatc gagctggacg aggtccgcag 9960

caatgtgtac ctcggcatgt tccagtgcgc cgcccgcgag ggcatacgcc ggcggcttgc 10020

cgacagcggg cacgtcgtcg gggaagcgga actcgaggaa atgctccgct acttcgtcga 10080

tcgcggcctg gcattcgagg acgaggggcg ctacgtaagc gtcgccctcg gggttgaccc 10140

gtatcgccga aagctggtcg gcggcaagga ggtggcggct tcgctatgag cgctttgctg 10200

gacatcgatg aactcaaggc ccgagattcg gacgagggac gggtaccggc cggtggccgt 10260

cccgcgaccg agacgctgac cctcggactc gaccgggccg aacttcccgt cgccaccgaa 10320

ctggcggcgc tactgcaccg ggtgcccgtc gccggggtac ggctgccgga gcccgccgac 10380

ttctcggcac tccccagtca cgtgatcgtg cggatcatcg cgttgattcg cgaatgttcc 10440

tcgatcggca ccagagtcac ctggtcactg accctgggcg ccgaacagct cgacctggtc 10500

ccccgtctcg atcaccttcc tgcccccgac agcatcacgg tgctggagac agggcatccg 10560

tccgtcggtg agtggcggtc ctccagcaat ttcggcctcc tctacttccg taagggcccg 10620

aagttcctgt ccgtcgtcga tcagcgcccc gaatccagcc gcgaaatcat cgtggacgat 10680

cccacccaga tggccgtctt cctcctgggc ctggagggat gcgcgtgggc cgaggtgacc 10740

cgaaactcgc aattcgccgc cgccgcacgc gatttggtga acaagggcct tgtgatgcgc 10800

gtcggggatc actgcgtgac cctccccgtg cacatgcgtt catggcccct gggcgcggcc 10860

ctattgggag gaaccttggc cgcagccggc aagaaatcgg acggtgctac ggagtag 10917

<210> 2

<211>840

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>抗性蛋白基因cxm0

<222>（1）…（840）

<400> 2

ctacttcaga ccggcaaggc tgagcgcacg atccaagcgg tctcgtgacc gcgcccgagc 60

acggtcggcc ccctcagccc ggatcttcgc cagctccgat cgctcttcga ggagctgcag 120

tgcccgctca cgcaccggtg cgatcaggga gatcactgcc tctgcggctg cttccttgag 180

gtcacggtag gaatcgatac ccttcgccgc atcgctcggg agcgtgtcag tgcaggcagc 240

cctgatctcc aggaggttgg caacgcccgg ctgttcgtcc ggggcgtagc ggacggtgtt 300

ttctccgtct gtcactgcgc gttggaactt ccggcgtacg gcctccgggc tgtccaggac 360

gtagacgatg ccgctgccgt ccgaggacga cttcgacatc ttccgcgtag gggcagcgag 420

atcacgtacc cgggctgcgg ctacgggcag gacggcttgc ggaaccgtga acacctcgcc 480

gtagtccgtg ttgaaccgcc gcgccaaggt ccgggccagc tccacatgct ggttctgatc 540

gtgaccgacg ggcacctctg aagcgccatg aagcaggatg tccgccgcca tgaggacggg 600

gtaggtgagc agaccaaggc gtacggagtt gctcccctgg gacttctcct tgaactgcac 660

catccttcga gcctccccga aggtgcaggt gcactcgaga agccacgtca acgccatgtg 720

ctcctggatg aggtccgact gcacgaagag acgttcctgg ggtacgcccg ccgcgatgag 780

taaagcgagt tggtggtcgg tcagttcctg gagacgttcg gggtcgtgct tggtcgtcat 840

<210> 3

<211> 942

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因cxm1

<222>（1）…（942）

<400> 3

tcaggccgga gcggttccgg ttggtcgagg ttctccgaag agcgtcctga cggctggatc 60

ctgggctgcg gcctgagcgc acctgacggc gaggcgtacc agttcggagt cggaaccctc 120

acgccaggca agggacaacc gggcggcagg cacatccgtc acagggatga agacgacgtc 180

ctgacggtgc tggactgcca tgacagagac ggggacgagc gcggctgcgt tctcgagggc 240

cacgaggtcg atggcctcgt cgaggcgcgt cgctgtggga ggttccttcc aggtgcgctt 300

gccggggcac acctcaccac cccagaagtc ggaccactcg ggcgacccgc cggtggggcg 360

aatgatcgga acctcgctca ggtcgtcgat cgacacggag tcacgactgg ccagctcgtg 420

agccgatggc agacagacga cccggggtaa cagggccacg gtggccctct cgaggcccac 480

gtagtccgcg ggctccagca cgaaggacac gtcagcgtcc cctgcctcca ggcatgctgt 540

ctgttcggtc cacggtacgt accggggcac tacctgatac tcagggtgct tttcgcggat 600

gagttcaatg gtccggtgtg ccagagggcg gctgacggcc gggcggaacg cgacgacgag 660

ccgttcgaca tcctgcgacc ccgcctgccg catcctctcg accgtgacct gccactgctg 720

caacaagttc ctcgcgtgag tcaggaagtc gcgcccgacc gacgtgagtt cgactctgtt 780

gcccgttctg tccaaaagct ggagacccag ctctctttcg agttgacgaa tcgccacgct 840

caacggcggc tgtgtcatgt gcaggcgggc cgcggctcgc gtgaacccgc cttcctcggc 900

tacggcaacg aagtacctga ggtgccgcaa atccagttcc at 942

<210> 4

<211> 1443

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cxm2

<222>（1）…（1443）

<400> 4

atgacgctga tcgccaccgg cgtctccgtg ctgtcgtacg cactcatgca gaccatggtc 60

gtcccggcct tgcacgtact acaggtgcag ttacacacgg cctcgacgtg gtcggcgtgg 120

atcctgagtg tgttcctgct gaccagtgcg gcgagcacgc ccttgctgag ccggctgggg 180

gaccgctaca gcaagcgcaa agttttgctg ctggttctca ccacctacct gatcggcacg 240

gtcggttgtg ctgtggcagg caatatcggg gttctgatcg catgccgtgc cgtgcaggga 300

gtcagcctcg cggccatccc cctgtccttc ggcatcctgc gcgacgtact tcctgagcag 360

cggctgcgtt cgggcctcgg gctggtgtca gggaccatcg gtgtgggggc cggcatcggc 420

ctggtcgtgg gaggtctggt cgtcgaccac cagtcatggc gctggctgtt cgccgtcgcc 480

gcggtactga tcctgggcgc gatcgggctc gttgcgaagt acgttccgga ccagcggggc 540

gaagccggcg aaccggtgga cgtgcccggg gcggtgctcc tggccttggt cctcgtcgcg 600

ctgttgctcg cgttgaccaa gggcacctca tgggggtggg cgtccacagg aacgctggct 660

ctgttcgggg cctccgcggt tctcctggga ttgctggtcg tagtcgaacg aaagtcgccc 720

gcccccttga tcgaccccgc ggtcgtggcc ggtcgctcct tcgtctcggt gcacggtgcg 780

gcgttcgtgt tcggcgtggt ctcgttcgtg ttctacgtcc tgctgccgac gtacgcccag 840

accgcggcgg atcagcggct accgggcgga gggaccatcg gctacgggct cggggccgat 900

gtcaccatgg cgggtctgct ccttctgccc ggctcattgg tgctgttgcc tgcgggacca 960

ctagcaggtc tgctgcagcg cctgacgtcc gtacgcgcga cgctcgcatc aggcttcgcc 1020

gtgatggcgg tcggggcgat ctcgctctgg gcgtggaatg ccaacgggtg gcaagtggcg 1080

gtcggttacc tggtcgtagg tctcggttcc ggactggtgc tgagcggact cccgtcggtg 1140

atcagcgact tgacggaggc ccgacgcacc gcaaccgcca atggcgtcaa cacggtggtg 1200

cgcacggcag gcggcgtcgt aggcagtcag ctggctgtcg ccttgctggc tgcctggcat 1260

atctccggtt ccgatacgcc ggcgcgcgac ggcttcacca ccgccttctg gatcgctgcc 1320

gccgtagcgg cggccggagg gctgttgtgc tgggtcggca tcaagacctc cacgctccgc 1380

ggccctcgta tgccaggggt gactgacctg cctcgccaga gcgcaggggg cgtacgccca 1440

tga 1443

<210> 5

<211> 621

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sulfur carrier protein）激活蛋白基因cxm3

<222>（1）…（621）

<400> 5

gtgaccgtcc gatttgaaat cgaacccgtc aggcgtttcc tgagcagcgc actgggggag 60

taccaaaaat gcctggacag ccgcgacgcc gatggcgtcc cgagccatct gccgcgtgca 120

tcgggtctgt tgttcgggca ggtgggcggc gctgaaatag tgatcagcga tgtggaattc 180

gtgccgaatg tccgggacag tgacgagagt gtcatggccg aattcgaagc gacgatcgcc 240

ccgcagttcg gcgacgtgta caagaatccg gggcgaggat tctggtccga tgaacagggc 300

gtcttgcagg cgatcaggca acagtcggcg aacggcctgg agttgctggg ctccatacat 360

tcacatccga actggcatga aatcggcccg ccgcacgaac ggcgccagcg cctgagcgaa 420

catccgacac agatggatga ataccttttc cggcagtcat gctggccagt gaacgtcatc 480

tggtacgtgc atgagagtag tggcggtatc gcacatcggg tagcggcctg gcggcccggt 540

gccgagcaat gcgacaggct tgacatacgg attccggcgg cgatccatga gcagttcgaa 600

gtcctactcg aggaggaata a 621

<210> 6

<211> 303

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sulfur carrier protein）基因cxm4

<222>（1）…（303）

<400> 6

atgcccgatg tcaaacttcc cgcagccttc cacgtcctga ccggcggtcg gcggcagttg 60

cctgtcgagg gcgccaatat ccgggaggtc cttgtcggtc tcgaccagac ctgtccgggg 120

gtcctcgagc gactcatgga ccaggaaggg tccgtgaagc gctacgtcaa tgtctaccgg 180

aacgacagcg acatcaggag cctcgacggc ctcgaaacga aagtggagca ccacgacgtc 240

atctggatag tgccggcggt agcaggtggc agcgaagccg cgcgagccga ggagtcacga 300

tga 303

<210> 7

<211> 1215

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>細(xì)胞色素P450酶基因cxm5

<222>（1）…（1215）

<400> 7

atgaccgacg tgattcccac ggaattcttc accgagcccg gttcgaatcc gcacgcgaca 60

gccgcggagt acaggtccaa gtgtccggtc catcggatca atgttccccc cggcgccgac 120

gcgtacgcgg tcctcgggaa caaagtcgtt gaggaagcgc tcggcgactc gcgcctctcc 180

aagcaagtcg agaacctgcc cgcccgctat cgagacaagg ccgtggccag cagtctcctc 240

gtggtcggca acctgggatt cgccgacgcg cccaaacaca cccgcctgaa gaagcccatc 300

agccgggcat tcctgccggc cacggtcgcc caactacgcc cgcgcatcca ggacatcgtc 360

gacgatctca tcgacacctt tccggagaac ggcgaaatcg acctgctcag ttccttcgct 420

ctgccgatgc cgctcaccgt catctgcgaa tacctgggga taccggtggc ggaccggccg 480

ctgtttctgg agtggagcta catcctcagc caggacccgt tgcagcacga cgaggcggag 540

ctgaaagccg cgagcgaaga gttcacggac tatttcacca agctcgtggc cgagcggcgc 600

acggacctgc gggacgacct gctgagcgag atcatcaggg ccagggacgc aggcgtatac 660

agcgaaacag agctcctttc gacgctcctc ctgctgatca tcgccggtca caagacggtc 720

gccaacatga tcggcaacgg cacagcactg ttgctccgcc atccccagca gctcgagatg 780

ctccgagcca cccccgagct gatcccttcg gcgatcgagg agatcctgcg ctacgaaggg 840

tcggccgcct gggcctcgct gcgggtcgcg gcggaggaca tgcagctcgc gggagtggac 900

atacccaagg ggagcttcgt acacctgtcg ctgtccagcg cgggtcgtga tcccgacgtg 960

tacgacgacc cggacggttt cgacgtgacg cggtcaccga accgccatct gtccttcggc 1020

cacggtcccc acttctgcat cggcgctccg ctgggccgac tccagggcga gatcgccttc 1080

tccacgctgt tgcgccgact gccgcgattc gagctcgccg tgcctccgga agaggtcgcc 1140

tggctctccg acagttcgct cagccggggc ctcgaggccc tcccgatacg agtgggagag 1200

aggttgccgc gatga 1215

<210> 8

<211> 927

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>酮泛解酸還原酶基因cxm6

<222>（1）…（927）

<400> 8

gtggtgggag ccggcggagt aggcggctat ttcggcggcc tgctcgccgc cgccgggcat 60

gatgtgcggt tcctggcccg cggcgagaac ctcgccgcgc tcaggcgaca ggggctgcgc 120

atcaccaacg gctcaagtga cttacgtgtg ccggacgttc gggcgtcggc cgacccgaag 180

gacatcggcg aggtcgactt cgtactgctc tgcgtcaaga cctcacagct gccggcggcc 240

ctcgacgcgc tgggcccgct ggtcggcgag cacactgccg tggtcacggt gcagaacggg 300

gtggaagccc ctgagcaggt cgcagccagg atcggccgcg gtcgggtact ccccggcagc 360

gtcagggtcg tggcctcgac ggccggtccg ggcgagttga ggcacgtggg tccccccggc 420

gctctggcct tcaccgagtg ggacagcact gtgtccgacc gggtggcacg actgcgcgag 480

gtgctgcgtg ctgcctcggt gtccgtgccc gagccgagcg acatctgggc cggcctttgg 540

gcgaagttcc tgttggtggt cccgatcggc agccttggag ccgccaccgg cggggcgacc 600

atcggcgagc tccggtcgcg caccggcacc cgcaacattc tgatcgccgg catgcgggag 660

atctacgaga ccgggatcaa gctcggaatc gcgctgccgg cagctgccgt ggacaccgcg 720

acagagctca tggaccagca gtcgcccgac gtcacctcct cgctgcaacg ggacatcctg 780

gcgggacggc cgtcagagct cgaagcgtgg accggggccg tggtccgcct cgcccgcggg 840

gcgggcctga ccgcgccggt ccacgaaatg ctctacgagc tgctcgccac ccgcgaatca 900

cgcacggcga ggagtctgca ggcgtga 927

<210> 9

<211> 1089

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221> 5-磷酸吡哆醛（PLP）依賴型氨基轉(zhuǎn)移酶基因cxm7

<222>（1）…（1089）

<400> 9

gtgaacgtga gattcgcaga acgcagcacc ctgcgggaca tgcgggccta ccgggacaag 60

gagtcgtcga acgccgaagg cagctcgcgg ttcaccttcg acctgtccag caacgagctg 120

gttctccccc cgctgcctac cgtgcttgcc ggtatcgaaa aaggcttgcc gcgacttgct 180

cgttaccccg accccacagc acgggacctg accgaggaca ttgccgggca cttgtgcgtc 240

tccccggatg aggtcgcggt cggccccgga agcgcgggcg tgctccagca gatccttctc 300

gcactgtgcg gcaagggcga cgaagtcgtc catggctggc cgggattcga tgcctatccg 360

ctgttggtcg ccatttcagg tgccaccgga gtccacgtgc ccctgactgc gtccggcggc 420

cacgatctcg atgagatccg cacccgggtg aatgcgcgga ccagggtggt gatcctgtgc 480

tccccgcaca atccgaccgg aaccgtgatt gaccaagacg agctgcacgg tttcctgcgt 540

tcgctgccgg ctcatgtggt cgcggtcctc gacgaggcgt acgtggagtt cgaccggggc 600

gccaatcctc cgggtctgcc ggtgttgctg agcgagcaca gcaacaccgt ggtacttcga 660

acgttctcca aggcctatgg ccttgccggc ctacgggtcg gttacgcggc cgggccacgg 720

caggtcatgg ccaccgtccg caagacggca atccctttcg gagtgacgcg cttcgcggaa 780

caagccgcaa tgctctcgct gcgcagcgag gacgaactgt gtgaacgtct ggcagcagtg 840

gctgcggcac gcgaagaact gaccgcggaa ctcagggaac tgaggctgcc cgtcctgctt 900

tcccgagcca acttcgtctg gctcccgctc gcttcggccg ccgagtcttt cgcccggact 960

gcggctaccg caggggtcaa ggtccgagcc tttccggggc acggtgtacg gatctcagtg 1020

ggagaggccg aggcacatcg gacgctgttg gcggcgctcg gccgggcgga ccgtgggaac 1080

tggttctga 1089

<210> 10

<211> 1872

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因cxm8

<222>（1）…（1872）

<400> 10

gtgaaactcc tgatgatcgc catgccgtgg caagggctcg acacgccgtc cagcgcgctg 60

ggcgtactgg ggccatgcgt ccgcaagaac gccgccgact ggaccgtcga tgagctgtac 120

gccaacctcc gctgggccga atacctgatg cgggagagca acggctccgt cacctgcgag 180

gactacggga acatcgcgga tcaagtcttc cacggcgtag gggactgggt gttcacccca 240

gcgctgtacg acgtcgacag ttatcaggtc gacgagtacg cgaagttcct cgagcagcgg 300

gacatggacc cgacacttcc cgttgagatg cacaagtacg cccggggatt catccgggat 360

ctcgcggccg agatcgctgc cgatcctccc gacgtggtcg ggttcacgag caccttcatg 420

cagaacgtcc cgtcgctcgc actggccagg gagctgaaga aactcgcgcc gggcatccgc 480

acggtccttg gcggcagcaa ctgcgacgga gcacaaggtc ccgcgttgca ccggaatttc 540

gagcaactcg acttcgtgat cagcggtgag ggcgaacgtg cgctgcccgc gttgctgaat 600

cgcatcatcc ggggcgagag cctcgccgac gtgccggggc tcagctggag gggggatgac 660

gggcatccgg tggtgaatcc accggccacg gcggcgctgc cgttcgccat ggtgcccgcg 720

cccggttacg acagctactt tcaggccctc gaaaggtcac ccgtccgtca ccacgtccgt 780

ccgatgctgg tccttgagac ctcccgtggt tgctggtggg gagaggctca ccaatgcacg 840

ttctgcggcc tgaacggatc gaatatcgac ttccggagca aggcccctga gcgcatcgcc 900

caggaagtcc gggaactggc cgagcgacac cagatcctcg acctggtcat ggtggacaac 960

atcctcgaca tgaagtatct caatacggcc atgcccgaga tagctgccct cgactgcgat 1020

ctgcgaattc actacgagat caagtccaat atgaaccggg agcagttgag taggctgaaa 1080

gaggcgaacg tcctcttcgt gcagcccggt atcgagagcc tgagcagcca tgtgctgcgc 1140

ctcatggaca agggcgtcag tgccgcgcac aacgtacgga tgctgcgtga cggacaggat 1200

ctcgggctca acgtgacatg gagcatcctc tacggcttcc cgggcgagac cgaggacgac 1260

taccgcgggc tgctcaagaa attggccacg ctcgagcacc tggagccgcc aaccggggct 1320

tggcgcatag cccttgagcg gttcagtccc tacttcgagg accccaccca ggggttcatg 1380

ttccgccgcc cctcggaaat atacgacttc atctaccaga tcccgcagga tcagctgtac 1440

gacatggtgt tcttcttcga caccagcgtc cggggaatct cagggcccat cgaggacgag 1500

atgaagcagg cctgcgagga atgggccaag gcctatccgc agggcaccct ttcctactgg 1560

accgatgacc gaggccgggt cgtcatcgaa gaccgccgtg ccagctggcc gacggaagtg 1620

atcgagctgg acgaggtccg cagcaatgtg tacctcggca tgttccagtg cgccgcccgc 1680

gagggcatac gccggcggct tgccgacagc gggcacgtcg tcggggaagc ggaactcgag 1740

gaaatgctcc gctacttcgt cgatcgcggc ctggcattcg aggacgaggg gcgctacgta 1800

agcgtcgccc tcggggttga cccgtatcgc cgaaagctgg tcggcggcaa ggaggtggcg 1860

gcttcgctat ga 1872

<210> 11

<211> 732

<212> DNA

<213>濟(jì)南游動(dòng)放線菌(Actinoplanes tsinanensis)

<221>自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白基因cxm9

<222>（1）…（732）

<400> 11

atgagcgctt tgctggacat cgatgaactc aaggcccgag attcggacga gggacgggta 60

ccggccggtg gccgtcccgc gaccgagacg ctgaccctcg gactcgaccg ggccgaactt 120

cccgtcgcca ccgaactggc ggcgctactg caccgggtgc ccgtcgccgg ggtacggctg 180

ccggagcccg ccgacttctc ggcactcccc agtcacgtga tcgtgcggat catcgcgttg 240

attcgcgaat gttcctcgat cggcaccaga gtcacctggt cactgaccct gggcgccgaa 300

cagctcgacc tggtcccccg tctcgatcac cttcctgccc ccgacagcat cacggtgctg 360

gagacagggc atccgtccgt cggtgagtgg cggtcctcca gcaatttcgg cctcctctac 420

ttccgtaagg gcccgaagtt cctgtccgtc gtcgatcagc gccccgaatc cagccgcgaa 480

atcatcgtgg acgatcccac ccagatggcc gtcttcctcc tgggcctgga gggatgcgcg 540

tgggccgagg tgacccgaaa ctcgcaattc gccgccgccg cacgcgattt ggtgaacaag 600

ggccttgtga tgcgcgtcgg ggatcactgc gtgaccctcc ccgtgcacat gcgttcatgg 660

cccctgggcg cggccctatt gggaggaacc ttggccgcag ccggcaagaa atcggacggt 720

gctacggagt ag 732

<210> 12

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>抗性蛋白Cxm0氨基酸序列

<222>（1）…（279）

<400> 12

MTTKHDPERL QELTDHQLAL LIAAGVPQER LFVQSDLIQE HMALTWLLEC TCTFGEARRM 60

VQFKEKSQGS NSVRLGLLTY PVLMAADILL HGASEVPVGH DQNQHVELAR TLARRFNTDY 120

GEVFTVPQAV LPVAAARVRD LAAPTRKMSK SSSDGSGIVY VLDSPEAVRR KFQRAVTDGE 180

NTVRYAPDEQ PGVANLLEIR AACTDTLPSD AAKGIDSYRD LKEAAAEAVI SLIAPVRERA 240

LQLLEERSEL AKIRAEGADR ARARSRDRLD RALSLAGLK 279

<210> 13

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Cxm1氨基酸序列

<222>（1）…（313）

<400> 13

MELDLRHLRY FVAVAEEGGF TRAAARLHMT QPPLSVAIRQ LERELGLQLL DRTGNRVELT 60

SVGRDFLTHA RNLLQQWQVT VERMRQAGSQ DVERLVVAFR PAVSRPLAHR TIELIREKHP 120

EYQVVPRYVP WTEQTACLEA GDADVSFVLE PADYVGLERA TVALLPRVVC LPSAHELASR 180

DSVSIDDLSE VPIIRPTGGS PEWSDFWGGE VCPGKRTWKE PPTATRLDEA IDLVALENAA 240

ALVPVSVMAV QHRQDVVFIP VTDVPAARLS LAWREGSDSE LVRLAVRCAQ AAAQDPAVRT 300

LFGEPRPTGT APA 313

<210> 14

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cxm2氨基酸序列

<222>（1）…（480）

<400> 14

MTLIATGVSV LSYALMQTMV VPALHVLQVQ LHTASTWSAW ILSVFLLTSA ASTPLLSRLG 60

DRYSKRKVLL LVLTTYLIGT VGCAVAGNIG VLIACRAVQG VSLAAIPLSF GILRDVLPEQ 120

RLRSGLGLVS GTIGVGAGIG LVVGGLVVDH QSWRWLFAVA AVLILGAIGL VAKYVPDQRG 180

EAGEPVDVPG AVLLALVLVA LLLALTKGTS WGWASTGTLA LFGASAVLLG LLVVVERKSP 240

APLIDPAVVA GRSFVSVHGA AFVFGVVSFV FYVLLPTYAQ TAADQRLPGG GTIGYGLGAD 300

VTMAGLLLLP GSLVLLPAGP LAGLLQRLTS VRATLASGFA VMAVGAISLW AWNANGWQVA 360

VGYLVVGLGS GLVLSGLPSV ISDLTEARRT ATANGVNTVV RTAGGVVGSQ LAVALLAAWH 420

ISGSDTPARD GFTTAFWIAA AVAAAGGLLC WVGIKTSTLR GPRMPGVTDL PRQSAGGVRP 480

<210> 15

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白激活蛋白Cxm3氨基酸序列

<222>（1）…（206）

<400> 15

VTVRFEIEPV RRFLSSALGE YQKCLDSRDA DGVPSHLPRA SGLLFGQVGG AEIVISDVEF 60

VPNVRDSDES VMAEFEATIA PQFGDVYKNP GRGFWSDEQG VLQAIRQQSA NGLELLGSIH 120

SHPNWHEIGP PHERRQRLSE HPTQMDEYLF RQSCWPVNVI WYVHESSGGI AHRVAAWRPG 180

AEQCDRLDIR IPAAIHEQFE VLLEEE 206

<210> 16

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>巰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cxm4氨基酸序列

<222>（1）…（100）

<400> 16

MPDVKLPAAF HVLTGGRRQL PVEGANIREV LVGLDQTCPG VLERLMDQEG SVKRYVNVYR 60

NDSDIRSLDG LETKVEHHDV IWIVPAVAGG SEAARAEESR 100

<210> 17

<211> 404

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>細(xì)胞色素P450 Cxm5氨基酸序列

<222>（1）…（404）

<400> 17

MTDVIPTEFF TEPGSNPHAT AAEYRSKCPV HRINVPPGAD AYAVLGNKVV EEALGDSRLS 60

KQVENLPARY RDKAVASSLL VVGNLGFADA PKHTRLKKPI SRAFLPATVA QLRPRIQDIV 120

DDLIDTFPEN GEIDLLSSFA LPMPLTVICE YLGIPVADRP LFLEWSYILS QDPLQHDEAE 180

LKAASEEFTD YFTKLVAERR TDLRDDLLSE IIRARDAGVY SETELLSTLL LLIIAGHKTV 240

ANMIGNGTAL LLRHPQQLEM LRATPELIPS AIEEILRYEG SAAWASLRVA AEDMQLAGVD 300

IPKGSFVHLS LSSAGRDPDV YDDPDGFDVT RSPNRHLSFG HGPHFCIGAP LGRLQGEIAF 360

STLLRRLPRF ELAVPPEEVA WLSDSSLSRG LEALPIRVGE RLPR 404

<210> 18

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>酮泛解酸還原酶Cxm6氨基酸序列

<222>（1）…（308）

<400> 18

VVGAGGVGGY FGGLLAAAGH DVRFLARGEN LAALRRQGLR ITNGSSDLRV PDVRASADPK 60

DIGEVDFVLL CVKTSQLPAA LDALGPLVGE HTAVVTVQNG VEAPEQVAAR IGRGRVLPGS 120

VRVVASTAGP GELRHVGPPG ALAFTEWDST VSDRVARLRE VLRAASVSVP EPSDIWAGLW 180

AKFLLVVPIG SLGAATGGAT IGELRSRTGT RNILIAGMRE IYETGIKLGI ALPAAAVDTA 240

TELMDQQSPD VTSSLQRDIL AGRPSELEAW TGAVVRLARG AGLTAPVHEM LYELLATRES 300

RTARSLQA 308

<210> 19

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>5-磷酸吡哆醛（PLP）依賴型氨基轉(zhuǎn)移酶Cxm7氨基酸序列

<222>（1）…（362）

<400> 19

VNVRFAERST LRDMRAYRDK ESSNAEGSSR FTFDLSSNEL VLPPLPTVLA GIEKGLPRLA 60

RYPDPTARDL TEDIAGHLCV SPDEVAVGPG SAGVLQQILL ALCGKGDEVV HGWPGFDAYP 120

LLVAISGATG VHVPLTASGG HDLDEIRTRV NARTRVVILC SPHNPTGTVI DQDELHGFLR 180

SLPAHVVAVL DEAYVEFDRG ANPPGLPVLL SEHSNTVVLR TFSKAYGLAG LRVGYAAGPR 240

QVMATVRKTA IPFGVTRFAE QAAMLSLRSE DELCERLAAV AAAREELTAE LRELRLPVLL 300

SRANFVWLPL ASAAESFART AATAGVKVRA FPGHGVRISV GEAEAHRTLL AALGRADRGN 360

WF 362

<210> 20

<211> 623

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Cxm8氨基酸序列

<222>（1）…（623）

<400> 20

VKLLMIAMPW QGLDTPSSAL GVLGPCVRKN AADWTVDELY ANLRWAEYLM RESNGSVTCE 60

DYGNIADQVF HGVGDWVFTP ALYDVDSYQV DEYAKFLEQR DMDPTLPVEM HKYARGFIRD 120

LAAEIAADPP DVVGFTSTFM QNVPSLALAR ELKKLAPGIR TVLGGSNCDG AQGPALHRNF 180

EQLDFVISGE GERALPALLN RIIRGESLAD VPGLSWRGDD GHPVVNPPAT AALPFAMVPA 240

PGYDSYFQAL ERSPVRHHVR PMLVLETSRG CWWGEAHQCT FCGLNGSNID FRSKAPERIA 300

QEVRELAERH QILDLVMVDN ILDMKYLNTA MPEIAALDCD LRIHYEIKSN MNREQLSRLK 360

EANVLFVQPG IESLSSHVLR LMDKGVSAAH NVRMLRDGQD LGLNVTWSIL YGFPGETEDD 420

YRGLLKKLAT LEHLEPPTGA WRIALERFSP YFEDPTQGFM FRRPSEIYDF IYQIPQDQLY 480

DMVFFFDTSV RGISGPIEDE MKQACEEWAK AYPQGTLSYW TDDRGRVVIE DRRASWPTEV 540

IELDEVRSNV YLGMFQCAAR EGIRRRLADS GHVVGEAELE EMLRYFVDRG LAFEDEGRYV 600

SVALGVDPYR RKLVGGKEVA ASL 623

<210> 21

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白基因Cxm9氨基酸序列

<222>（1）…（243）

<400> 21

MSALLDIDEL KARDSDEGRV PAGGRPATET LTLGLDRAEL PVATELAALL HRVPVAGVRL 60

PEPADFSALP SHVIVRIIAL IRECSSIGTR VTWSLTLGAE QLDLVPRLDH LPAPDSITVL 120

ETGHPSVGEW RSSSNFGLLY FRKGPKFLSV VDQRPESSRE IIVDDPTQMA VFLLGLEGCA 180

WAEVTRNSQF AAAARDLVNK GLVMRVGDHC VTLPVHMRSW PLGAALLGGT LAAAGKKSDG 240

ATE 243

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