本發(fā)明涉及分子生物學和生物技術領域，具體涉及中華蜜蜂AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因的克隆、重組載體的構建，并首次在中華蜜蜂中驗證了AccCDK5及其激活子AccCDK5r1的互作關系，提供了AccCDK5重組蛋白體外的抗氧化能力定性研究方法。

背景技術：

細胞周期蛋白依賴性激酶-5(cyclin-dependent kinase-5,CDK5)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,屬于細胞周期蛋白依賴性激酶家族CDKs。近年來的研究表明，在哺乳動物中，CDK5并不參與細胞周期的調控，而是主要在神經系統(tǒng)中發(fā)揮作用，參與神經元遷移、肌動蛋白的運動、微管運輸及其穩(wěn)定性、細胞粘附、軸突導向、突觸結構可塑性、肌細胞生成和膜運輸等多種細胞活動。CDK5的功能失調和異常分布會導致神經系統(tǒng)障礙，并有可能導致神經退行性疾病。

非周期蛋白素蛋白p35、p39是CDK5的兩個激活子，特異地分布在中樞神經系統(tǒng)中，因此CDK5的激酶活性的激活主要局限于神經系統(tǒng)中。p35具有膜錨定信號基序,從而使CDK5/p35錨定于膜上發(fā)揮作用。p35不穩(wěn)定，半衰期只有20-30min，可通過泛素化途徑被降解失活。此外，p35可在神經性毒性刺激的條件下裂解為p25，p25與p35都具有激活CDK5的能力，不同的是p25缺少膜錨定信號基序，從而導致CDK5/p25復合體定位發(fā)生改變，同時由于p25的半衰期要比p35長很多，致使CDK5/p25無節(jié)制地磷酸化其下游底物，最終導致一系列病理變化。此外，有文獻報道，H₂O₂誘導激活CDK5可以防止細胞在氧化脅迫中死亡。

目前對于CDK5及其激活子的研究大部分集中于哺乳動物的神經性病變、腫瘤發(fā)生等病理研究及其他基礎研究中，昆蟲中的相關研究少有報道，在中華蜜蜂中未見相關報道。

中華蜜蜂(Apis cerana cerana)屬于東方蜜蜂的一個亞種，有7000萬年進化史，是我國最具優(yōu)勢、分布最廣的本土蜂種。長期的進化過程中，中華蜜蜂對我國的氣候、蜜源分布等生態(tài)環(huán)境產生了極強的適應性，具有善于利用零星蜜源植物、采集力強、抗螨及抗病能力強等優(yōu)點。

中華蜜蜂具有良好的經濟效益和重要的生態(tài)作用，然而由于近年來西方蜜蜂的引入、病蟲害以及毀林造田、濫施農藥、環(huán)境污染等因素，使中華蜜蜂蜂群數量驟減，種群延續(xù)已經受到了極為嚴重的威脅。

技術實現要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現有技術的情況，提供了中華蜜蜂AccCDK5基因基因在抗氧化過程中的作用及其應用，提供了兩個中華蜜蜂基因AccCDK5與AccCDK5r1的克隆及重組載體構建方法，并提供AccCDK5蛋白與AccCDK5r1蛋白互作的證據及AccCDK5重組蛋白體外的抗氧化能力定性研究方法，為中華蜜蜂優(yōu)質新品種的選育提供一定的理論基礎，并為中華蜜蜂神經系統(tǒng)相關研究提供基礎。

本發(fā)明中，我們用常規(guī)方法從中華蜜蜂(Apis cerana cerana)中克隆得到AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因，分析了兩個基因的結構域并進行了進化樹分析，標出了其保守結構域；構建了酵母雙雜交實驗相關載體，驗證了其相互作用關系；構建了AccCDK5的原核表達載體，用于誘導蛋白并進行了紙片擴散實驗，發(fā)現AccCDK5重組蛋白具有一定的抗氧化功能。本發(fā)明初步中華蜜蜂中AccCDK5與其激活子AccCDK5r1的互作關系，驗證了AccCDK5重組蛋白的抗氧化功能。

與現有技術相比，本發(fā)明首次查找并克隆得到AccCDK5r1，并首次證明了AccCDK5r1是p35在中華蜜蜂中的同源基因，豐富了蜜蜂神經系統(tǒng)的研究，為研究蜜蜂神經系統(tǒng)發(fā)育及神經性病變提供理論基礎，同時為研發(fā)蜜蜂神經疾病相關藥物提供靶點。

本發(fā)明的具體技術方案是：

發(fā)明人首先提供了中華蜜蜂AccCDK5基因和AccCDK5r1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1與SEQ ID No.3所示，前述基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.2與SEQ ID No.4所示；上述序列均來源于中華蜜蜂(Apis cerana cerana)，其中AccCDK5r1蛋白為AccCDK5蛋白的激活子。

本發(fā)明提供前述基因的選擇及克隆方法。具體為：

以中華蜜蜂基因組中的CDK5序列為參考，設計特異性引物，該引物對序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，利用PCR技術擴增獲得AccCDK5基因。以哺乳動物CDK5激活子p35、p39的氨基酸序列作為參考序列，使用本地blast(blast-2.3.0+)軟件檢索中華蜜蜂基因組，查找到一個未注釋的蛋白，命名為AccCDK5r1，設計特異性引物，該引物對序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，利用PCR技術擴增獲得AccCDK5r1基因。

將前述基因編碼的氨基酸序列在GenBank進行檢索并進行了序列比對分析和進化樹分析，發(fā)現AccCDK5、AccCDK5r1具有高度保守性，AccCDK5r1具有CDK5激活子所特有的結構域。

獲得上述基因序列后，將AccCDK5和AccCDK5r1的CDS序列分別與pGBKT7、pGADT7 AD載體連接，用于酵母雙雜交實驗，實驗證明兩者具有互作關系。將AccCDK5的CDS序列插入pET-30a(+)，構建原核表達載體，表達AccCDK5重組蛋白，用于紙片擴散實驗，結果發(fā)現AccCDK5重組蛋白在體外具有一定的抗氧化作用。

之所以采取上述方法，主要是為了初步驗證AccCDK5r1是AccCDK5的激活子，這樣就豐富蜜蜂神經系統(tǒng)的研究，為研究蜜蜂神經系統(tǒng)發(fā)育及神經性病變提供理論基礎，同時為研發(fā)蜜蜂神經疾病相關藥物提供靶點。探究AccCDK5重組蛋白的體外抗氧化功能，為今后蜜蜂的轉基因育種工作提供供選基因，從分子生物學角度為中華蜜蜂優(yōu)質種群的選育提供基礎。

綜上所述，本發(fā)明提供了中華蜜蜂AccCDK5與AccCDK5r1基因，并初步證明兩者的相互作用關系，證明了AccCDK5重組蛋白的體外抗氧化功能，對研究中華蜜蜂抗逆分子生物學、蜜蜂神經系統(tǒng)的研究及中華蜜蜂優(yōu)質蜂群選育有重要意義。

附圖說明

圖1為AccCDK5及AccCDK5r1CDS的PCR擴增電泳圖；

圖中A：AccCDK5的CDS片段；B：AccCDK5r1的CDS片段；Marker為DL 2000 DNA Maker，各條帶分別為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；結果表明，擴增片段大小正確；

圖2為AccCDK5及AccCDK5r1的氨基酸序列與幾種其它CDK5及CDK5r1氨基酸序列的比較結果，其中相同的氨基酸用黑底表示，保守結構域用黑框標出；

圖中A:AccCDK5與其它CDK5的氨基酸序列比對結果；B:AccCDK5r1與其它幾種昆蟲CDK5r1的氨基酸序列比對結果；結果表明，AccCDK5在物種間具有較高保守性，AccCDK5r1在昆蟲中保守性很高，兩個基因均具有各自的保守結構域；

圖3為AccCDK5及AccCDK5r1的進化樹臨近法分析結果示意圖；

圖中AccCDK5及AccCDK5r1用方框標出，其中A:AccCDK5進化樹分析結果；B：AccCDK5r1與進化樹分析結果；結果表明，這兩個基因與意大利蜜蜂中的對應基因進化關系最近；

圖4為AccCDK5及AccCDK5r1的酵母雙雜交實驗結果；

圖中A：AccCDK5-BD自激活檢測；B:AccCDK5-BD毒性檢測；C:酵母雙雜交實驗。結果表明，AccCDK5-BD無毒性，無自激活現象，AccCDK5與AccCDK5r1互作。

圖5為紙片擴散實驗：過氧化氫異丙苯處理條件下的紙片擴散實驗結果示意圖；

圖中序號1為滅菌ddH₂O對照，序號2-5濃度依次增大；結果表明，AccCDK5重組蛋白具有抗氧化功能。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領域現有技術。

實施例1：華蜜蜂AccCDK5及AccCDK5r1基因的克隆

以中華蜜蜂cDNA為模板，用正向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示)和反向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示)擴增AccCDK5片段，反應程序如下:94℃預變性10min→(94℃40s，52℃40s)×35cycles→72℃1min→72℃10min。

以哺乳動物CDK5激活子p35、p39的氨基酸序列作為參考序列，設計AccCDK5r1特異性引物以中華蜜蜂cDNA為模板，用上述設計獲得的正向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示)和反向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示)擴增AccCDK5r1片段，反應程序如下:

94℃預變性10min→(94℃40s，55℃40s)×35cycles→72℃1min→72℃10min。

上述PCR反應結束后，1.0％瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測PCR產物并回收正確片段(如圖1所示)，與載體pEASY-T1 simple連接后測序驗證。

得到的中華蜜蜂AccCDK5基因和AccCDK5r1基因其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1與SEQ ID No.3所示，前述基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.2與SEQ ID No.4所示，將前述基因編碼的氨基酸序列在GenBank進行檢索并使用DNAman軟件進行了序列比對分析(如圖2所示)，利用MEGA軟件了進化樹分析(如圖3所示)，結果表明AccCDK5、AccCDK5r1具有較高的保守性，并與意大利蜜蜂的CDK5、CDK5r1進化關系最近。

實施例2：重組載體構建

得到AccCDK5及AccCDK5r1基因的核苷酸序列后，首先構建了酵母雙雜交實驗所需重組載體和AccCDK5原核表達載體：

首先構建了AccCDK5-BD重組載體：以上述測序正確的質粒為模板，用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示(5′-CATATGATGCAAAAATATGAGAAACTCGAG-3′，劃線部分為Nde I酶切位點)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示(5′-GGATCCCTGACAACGATCGTTTTTAATGG-3′，劃線部分為BamH I酶切位點)擴增AccCDK5片段。

反應結束后，對PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化目的片段，與載體pEASY-T1 simple連接后測序驗證。將測序正確的質粒用Nde I和BamH I進行酶切，與經相同酶切的載體pGBKT7連接，連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，選取陽性克隆提取質粒酶切驗證，至此AccCDK5-BD重組載體構建完成。

按照上述方法，用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示(5′-GGATCCATGCAAAAATATGAGAAACTCGAG-3′，劃線部分為BamH I酶切位點)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示(5′-GTCGACCTGACAACGATCGTTTTTAATGG-3′，劃線部分為Sal I酶切位點)擴增片段，pET-30a(+)連接與構建了AccCDK5原核表達載體；

用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示(5′-CATATGATGGGTACCGTGTTGTCGTTC-3′，劃線部分為Nde I酶切位點)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示(5′-GAGCTCAGCCGCCTTGGTGGGTAC-3′，劃線部分為Sac I酶切位點)擴增AccCDK5r1片段，與pGADT7 AD載體連接，構建了AccCDK5r1-AD重組載體。

實施例3：酵雙雜交實驗

本發(fā)明酵母雙雜交采用Matchmaker GoldYeast Two-Hybrid System，本實驗共分為三個部分。

首先進行了AccCDK5-BD重組載體自激活檢測。分別將轉入pGBKT7空載體，AccCDK5-BD重組載體的酵母菌共同涂布于SD/-Trp/-His固體培養(yǎng)基與SD/-Trp/-Ade固體培養(yǎng)基，結果表明都不生長，證明AccCDK5-BD重組載體無自激活現象(如圖4A所示)。

然后進行了AccCDK5-BD重組載體毒性檢測。將分別將轉入pGBKT7空載體，AccCDK5-BD重組載體的酵母感受態(tài)細胞共同涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基，結果表明兩者長勢相同，證明AccCDK5-BD重組載體無毒性(如圖4B所示)。

在確定AccCDK5-BD重組載體無毒性和自激活后，進行了AccCDK5與AccCDK5r1蛋白相互作用的檢測。結果表明轉化AccCDK5-BD與AccCDK5r1-AD重組載體的酵母感受態(tài)在SD/Leu/-Trp與SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上均可生長，將陽性菌落在含有X-α-gal的SD/Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基，進行第二次篩選，進一步確認了AccCDK5與AccCDK5r1互作(如圖4C所示)。

此過程中的陽性對照組合為pGBKT7-53+pGADT7-T，陰性對照為pGBKT7-lam+pGADT7-T。

實施例4：AcCDK5重組蛋白的原核表達

將實施例2中構建好的AccCDK5-pET-30a(+)原核表達載體轉化Trans BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞，鑒定出陽性克隆后在IPTG終濃度為75μg/mL、28℃條件下誘導蛋白，取未加IPTG的菌液作為對照。誘導完成后離心，將上清去除干凈后加入蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸10min，蛋白變性后用12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測。結果表明，在此誘導條件下，AccCDK5重組蛋白誘導成功，可以進行紙片擴散實驗。

實施例5：AccCDK5重組蛋白抗氧化能力分析

本研究利用紙片擴散實驗在大腸桿菌中表達AccCDK5重組蛋白來檢測AccCDK5蛋白在體外的功能，以轉化pET-30a(+)空載的大腸桿菌作為對照。

分別轉化有AccCDK5-pET-30a(+)重組載體與pET-30a(+)空載體的Trans BL21(DE3)細胞涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(細胞數約為5×10⁸)，37℃靜置1h后將濾紙片(直徑7mm)貼于培養(yǎng)基上，在濾紙片上分別滴加3μl不同濃度的過氧化氫異丙苯，以滅菌ddH₂O作為對照。37℃倒置培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈大小。

紙片擴散實驗實驗結果表明(如圖5所示)，AccCDK5重組蛋白提高了大腸桿菌抗氧化的能力。

<110>山東農業(yè)大學

<120>中華蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其應用

<160>14

<210>1

<211>900

<212>DNA

<213>中華蜜蜂

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<210>2

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<212>PRT

<213>中華蜜蜂

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<212>DNA

<213>中華蜜蜂

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65 70 75 80

Asn Ala Arg Ile Ile Ser Glu Lys Asn Ala Leu Glu Lys Asn Leu Lys

85 90 95

Lys His Ser Leu Phe Ile Asn Ala Leu Ser Trp Lys Arg Phe Ser Thr

100 105 110

Ser Asn Asn Asn Lys Lys Lys Leu Asp Asn Lys Asn Lys Asn Ile Gly

115 120 125

Phe Arg Gln Pro Leu Asp Asn Ile Pro Ile Val Asp Lys Asn Lys Asn

130 135 140

Ile Gln Thr Pro Gln Thr Lys Pro Pro Ala Ser Asn Asn Asn His Asn

145 150 155 160

Thr His Asn Pro Thr Cys Glu Lys Leu Val Gln Lys Pro Leu Pro Pro

165 170 175

Lys Pro Arg Lys Thr Val Ile Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Leu Lys

180 185 190

Cys Leu Gly Val Phe Leu His Arg Lys Cys Thr Arg Leu Arg Asp Phe

195 200 205

Gln Ala Gly Asp Ala Val Met Trp Leu Arg Thr Val Asp Arg Ser Leu

210 215 220

Leu Leu Gln Gly Trp Gln Asp Val Ala Phe Ile Asn Pro Ala Asn Val

225 230 235 240

Val Phe Ile Tyr Met Leu Val Arg Glu Leu Val Asp Gly Asp Glu Ala

245 250 255

Ser Glu Arg Glu Leu Gln Ala Thr Val Leu Thr Cys Leu Tyr Leu Ser

260 265 270

Tyr Ser Tyr Met Gly Asn Glu Ile Ser Tyr Pro Leu Lys Pro Phe Leu

275 280 285

Ile Glu Asp Ser Lys Asp Lys Phe Trp Asp Arg Cys Leu Leu Ile Val

290 295 300

Asn Arg Leu Ser Ser Glu Met Leu Arg Ile Asn Ser Glu Pro Gly Phe

305 310 315 320

Phe Thr Glu Val Phe Thr Glu Leu Lys Ala Cys Gly Ala Gly Asp Arg

325 330 335

Gly Ser Leu Pro Gly Thr Gly Leu Glu Arg Ser Leu Val Val Ser Gly

340 345 350

Val Ala Val Pro Thr Lys Ala Ala

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