本申請(qǐng)是2013年8月16日提交的發(fā)明名稱為“水溶性的釋放一氧化氮的聚葡糖胺和其用途”的中國(guó)專利申請(qǐng)201380053757.0的分案申請(qǐng)。政府權(quán)益本發(fā)明是在政府支持下在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(thenationalinstitutesofhealth)授予的eb000708撥款下作出的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供釋放一氧化氮的多糖和寡糖，特別是聚葡糖胺，以及它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)和藥學(xué)應(yīng)用中的用途。更具體地，在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供釋放一氧化氮的寡糖，所述寡糖以受控和靶向方式釋放一氧化氮，從而延長(zhǎng)一氧化氮的療效和改善一氧化氮到靶細(xì)胞和/或組織的遞送的特異性。
背景技術(shù)：
：一氧化氮(no)在生物學(xué)、生理學(xué)和病理生理學(xué)中的多方面作用的發(fā)現(xiàn)(參見(jiàn)marietta,m.a.等人，biofactors,2,219-225(1990))使人們尋找能夠受控釋放一氧化氮的一氧化氮供體。參見(jiàn)keefer,l.k.,chemtech,28,30-35(1998)。迄今為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，no調(diào)控心血管系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的一系列生物過(guò)程。參見(jiàn)ignarro,l.j.,nitricoxide:biologyandpathobiology；academicpress:sandiego,2000；以及ignarro,l.j.等人，proc.natl.acad.sci.,usa.,84,9265-9269(1987)。此外，no作為血管擴(kuò)張劑的發(fā)現(xiàn)以及其作為抗生素和殺腫瘤因子的確定使得no成為有吸引力的藥物候選者。參見(jiàn)例如radomski,m.w.等人，br.j.pharmacol.,92,639-646(1987)；albina,j.e.和reichner,j.s.；canc.metas.rev.,17,19-53(1998)；nablo,b.j.等人，j.am.chem.soc.,123,9712-9713(2001)；cobbs,c.s.等人，cancerres.,55,727-730(1995)；jenkins,d.c.等人，proc.natl.acad.sci.,usa.,92,4392-4396(1995)；以及thomsen,l.l.等人，br.j.cancer.,72,41-44(1995)。已經(jīng)報(bào)道幾種一氧化氮供體，其中最著名的為n-二醇二氮烯鎓。通常，n-二醇二氮烯鎓no供體是通過(guò)胺與no在升高的壓力下的反應(yīng)合成的小分子，并且已被用于例如在水溶液中自發(fā)地產(chǎn)生no。參見(jiàn)hrabie,j.a.和keefer,l.k.,chem.rev.,102,1135-1154(2002)。探索一氧化氮供體例如殺死腫瘤細(xì)胞的活性的治療策略尚有疑問(wèn)，這部分地因?yàn)楸绢I(lǐng)域已知的一氧化氮遞送系統(tǒng)任意釋放或供給一氧化氮。因此，本領(lǐng)域需要以受控和/或靶向方式釋放或供給一氧化氮的一氧化氮遞送系統(tǒng)，以促進(jìn)no在生理學(xué)中的功能的改善理解并為no相關(guān)療法的開(kāi)發(fā)作準(zhǔn)備。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及含有共價(jià)結(jié)合的一氧化氮釋放部分(即no供體)的聚葡糖胺。聚葡糖胺骨架中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元含有式i的結(jié)構(gòu)單元。任選地，所述聚葡糖胺的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元還包含式ii的結(jié)構(gòu)單元。有利的是，本文所述的聚葡糖胺是水溶性的，并且能夠?qū)o遞送到靶標(biāo)。在實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及向個(gè)體遞送或釋放no的方法，其包括給藥包含至少一個(gè)式i的結(jié)構(gòu)單元并且任選地還包含至少一個(gè)式ii的結(jié)構(gòu)單元的聚葡糖胺。在實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及治療個(gè)體的疾病狀態(tài)的方法，其包括給藥包含至少一個(gè)式i的結(jié)構(gòu)單元并且任選地還包含至少一個(gè)式ii的結(jié)構(gòu)單元的聚葡糖胺。在實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及藥物組合物，其含有聚葡糖胺以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，所述聚葡糖胺包含至少一個(gè)式i的結(jié)構(gòu)單元并且任選地還包含至少一個(gè)式ii的結(jié)構(gòu)單元。在實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及制備包含至少一個(gè)式i的結(jié)構(gòu)單元并且任選地還包含至少一個(gè)式ii的結(jié)構(gòu)單元的聚葡糖胺的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及通過(guò)使用包含至少一個(gè)式i的結(jié)構(gòu)單元并且任選地還包含至少一個(gè)式ii的結(jié)構(gòu)單元的聚葡糖胺來(lái)破壞、消除或防止生物膜的方法。在此處的附圖和下文所述的說(shuō)明書(shū)中全面地描述了該主題。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1描述了本申請(qǐng)公開(kāi)的官能化的聚葡糖胺的有利性質(zhì)。圖2示出了在某些實(shí)施方案中發(fā)現(xiàn)的c、h和n的百分比。圖3是某些實(shí)施方案的1hnmr。圖4a描繪了某些殼寡糖cso2-no在不同no綴合溶劑中的釋放曲線。甲醇:h2o7:3總共產(chǎn)生0.87μmol/mg的no儲(chǔ)存；圖4b描繪了殼聚糖2/no-5k在甲醇(實(shí)心正方形)、甲醇/水9:1(實(shí)心圓圈)、甲醇/水8:2(空心三角形)、甲醇/水7:3(實(shí)心三角形)和甲醇/水6:4v/v(空心正方形)中的一氧化氮釋放曲線的特定數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖5a和5b描繪了(a)某些釋放no的殼寡糖的實(shí)時(shí)no釋放曲線；以及(b)某些釋放no的殼寡糖的t[no]對(duì)時(shí)間的曲線。圖6示出了某些實(shí)施方案的t[no]、[no]max和t1/2。圖7描繪的數(shù)據(jù)顯示釋放no的cso導(dǎo)致具有生物膜的銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)5-log減少。釋放no的殼寡糖(實(shí)心符號(hào))和對(duì)照殼寡糖(空心符號(hào))(殼聚糖1-5k；cso1-no(球形)、殼聚糖2-5k；cso2-no(正方形)和殼聚糖3-5k；cso3-no(三角形))對(duì)形成的銅綠假單胞菌生物膜的抗生物膜效力。對(duì)照殼寡糖未導(dǎo)致細(xì)菌活力顯著降低。圖8a和8b描繪了在l929小鼠成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。暴露于對(duì)照殼寡糖和釋放no的殼寡糖的l929小鼠成纖維細(xì)胞的活力，所述殼寡糖在對(duì)于銅綠假單胞菌生物膜實(shí)現(xiàn)5-log細(xì)菌活力降低的濃度(mbc)下。每個(gè)參數(shù)用多個(gè)平行測(cè)定進(jìn)行分析(n＝3)。圖9a-f描繪了ritc標(biāo)記的殼寡糖與生物膜中的銅綠假單胞菌締合的共聚焦熒光圖像(a.殼聚糖2/no-5k，b.殼聚糖3/no-5k，c.殼聚糖2-10k)，以及用d)殼聚糖2/no-5k、e)殼聚糖3/no-5k和f)殼聚糖2/no-10k孵育的syto9標(biāo)記的生物膜的圖像。syto9的綠色熒光表示嵌入生物膜中的銅綠假單胞菌。ritc的紅色熒光表示ritc標(biāo)記的殼寡糖與在生物膜中的銅綠假單胞菌的締合。比例尺：40μm。圖10a-h描繪了與銅綠假單胞菌締合的ritc改性的殼聚糖2/no-5k在a)24分鐘、b)28分鐘、c)42分鐘以及殼聚糖3/no-5k在d)82分鐘、e)86分鐘、f)110分鐘、h)120分鐘(150μgml-1)與銅綠假單胞菌締合的明視野和熒光圖像。用g)殼聚糖2/no-5k孵育的銅綠假單胞菌在44分鐘和用h)殼聚糖2/no-5k孵育的銅綠假單胞菌在120分鐘的疊加圖像。具體實(shí)施方式本申請(qǐng)公開(kāi)的釋放一氧化氮(no)的聚葡糖胺(在實(shí)施方案中也稱為釋放no的殼寡糖)有利地是水溶性的并且是可調(diào)接的。這些性質(zhì)有助于本申請(qǐng)公開(kāi)的聚葡糖胺在水溶性治療劑有利的治療和疾病狀態(tài)中，例如在囊性纖維化的治療中的有效性。本申請(qǐng)公開(kāi)的官能化的釋放no的聚葡糖胺所具備的優(yōu)于已知的no釋放顆粒的其他優(yōu)點(diǎn)包括：1.通過(guò)將含仲胺的低聚物鏈接枝到殼寡糖上的獨(dú)特的合成途徑和化學(xué)組成；2.no儲(chǔ)存和no釋放動(dòng)力學(xué)的可調(diào)接性是優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)節(jié)在氮丙啶低聚物側(cè)鏈上的仲胺的數(shù)量，可以控制no儲(chǔ)存。不同疏水性/親水性的化合物對(duì)所得物質(zhì)上的胺的進(jìn)一步官能化使得能夠控制no釋放動(dòng)力學(xué)。事實(shí)上，用本申請(qǐng)公開(kāi)的官能化的聚葡糖胺獲得更大的no儲(chǔ)存；以及3.與顆粒相比，本文所述的官能化的聚葡糖胺是水溶性的，從而有利于更廣泛的應(yīng)用，包括期望水溶性的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。此前公開(kāi)的釋放no的殼聚糖(us6451,337)不是水溶性的。這凸顯了另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即本申請(qǐng)公開(kāi)的水溶性的官能化聚葡糖胺可以容易地透過(guò)和消除生物膜。本發(fā)明可以不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)被解釋為限于本文所述的實(shí)施方案。相反，提供這些實(shí)施方案，以使本公開(kāi)徹底且完全，并且將本發(fā)明的范圍全面?zhèn)鬟_(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。例如，對(duì)于一個(gè)實(shí)施方案說(shuō)明的特征可納入其他實(shí)施方案中，并且對(duì)于特定實(shí)施方案說(shuō)明的特征可從該實(shí)施方案刪除。此外，鑒于本公開(kāi)，對(duì)本文提出的實(shí)施方案的許多不背離本發(fā)明的變化和增補(bǔ)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見(jiàn)的。除非另有定義，則本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。在本文中用于本發(fā)明的描述的術(shù)語(yǔ)僅出于描述特定實(shí)施方案的目的，并不意欲限制本發(fā)明。本文中所提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)以其整體通過(guò)援引加入本文。如本文所用，英文“a”、“an”或“the”可以指一個(gè)或多于一個(gè)。例如，no釋放部分可以指單個(gè)或多個(gè)。也如本文所用，“和/或”是指包括相關(guān)所列項(xiàng)目中的一個(gè)或多個(gè)的任意和所有可能的組合，以及當(dāng)以替代方式(“或”)解釋時(shí)不存在組合。此外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)指代可測(cè)量的值，例如本發(fā)明的化合物或藥劑的量、劑量、時(shí)間、溫度等時(shí)，意欲包括所指定的量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的變化。術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”(和語(yǔ)法變體)當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的組合物時(shí)是指該組合物可以含有另外的組分，只要所述另外的組分不會(huì)本質(zhì)上改變所述組合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”或“有效量”是指官能化的聚葡糖胺賦予患有病癥、疾病或疾患的個(gè)體調(diào)節(jié)效力的量，所述調(diào)節(jié)效力可以是例如有益的效果，包括改善個(gè)體的病癥(例如，一種或多種癥狀)，延遲或減輕病癥的進(jìn)展，預(yù)防或延遲病癥的發(fā)作和/或改變臨床參數(shù)、疾病或疾患等，這是本領(lǐng)域公知的。例如，治療有效量或有效量可以指組合物、化合物或藥劑將個(gè)體的病癥改善至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的量?！爸委?treat)”或“治療(treating)或“治療(treatment)”是指任何類型的賦予患有病癥、疾病或疾患的個(gè)體調(diào)節(jié)效力的動(dòng)作，所述調(diào)節(jié)效力可以是例如有益的效果，包括改善個(gè)體的病癥(例如，一種或多種癥狀)，延遲或減輕病癥的進(jìn)展和/或改變臨床參數(shù)、疾病或疾患等，這是本領(lǐng)域公知的。術(shù)語(yǔ)“破壞”和“消除”是指本申請(qǐng)公開(kāi)的官能化的聚葡糖胺抗擊生物膜的能力。生物膜可以被部分消除或破壞，這意味著細(xì)胞不再彼此附著或附著到表面。生物膜可以被完全消除，這意味著在相當(dāng)大的程度上，生物膜不再是互連的、粘結(jié)的或連續(xù)的細(xì)胞網(wǎng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“水溶性的”是指所述官能化的聚葡糖胺與官能化前的聚葡糖胺相比在室溫下更可溶于水。優(yōu)選地，本文所公開(kāi)的水溶性的官能化聚葡糖胺是可溶的，以使每毫升水溶解>50mg官能化的聚葡糖胺。更優(yōu)選地，本文所公開(kāi)的水溶性的官能化聚葡糖胺是可溶的，以使每毫升水溶解>75mg官能化的聚葡糖胺。最優(yōu)選地，本文所公開(kāi)的水溶性官能化的聚葡糖胺是可溶的，以使每毫升水溶解>100mg官能化的聚葡糖胺。術(shù)語(yǔ)“一氧化氮供體”或“no供體”是指供給、釋放和/或直接或間接轉(zhuǎn)移一氧化氮物質(zhì)，和/或刺激體內(nèi)一氧化氮的內(nèi)源性產(chǎn)生和/或提高體內(nèi)一氧化氮的內(nèi)源性水平，以使一氧化氮物質(zhì)的生物活性在預(yù)期的作用點(diǎn)表達(dá)的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“一氧化氮釋放”或“一氧化氮供給”是指供給、釋放和/或直接或間接轉(zhuǎn)移一氧化氮的三種氧化還原形式(no+、no-、no)中的任何一種的方法。在一些情況下，實(shí)現(xiàn)一氧化氮釋放或供給，以使一氧化氮物質(zhì)的生物活性在預(yù)期的作用點(diǎn)表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“微生物感染”是指細(xì)菌、真菌、病毒和酵母菌感染。在本文所公開(kāi)的許多實(shí)施方案中治療的“患者”或“個(gè)體”期望為人類患者，但應(yīng)理解，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的原理表明，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題對(duì)于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的所有脊椎動(dòng)物物種(其意欲被包括在術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”和“患者”內(nèi))有效。合適的個(gè)體通常是哺乳動(dòng)物個(gè)體。本發(fā)明可用于研究以及獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括但不限于人類、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、豬、馬、貓、狗、兔、嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠)等。人類個(gè)體包括新生兒、嬰幼兒、青少年、成人和老人個(gè)體。所述個(gè)體可以是“需要”本文所公開(kāi)的方法的個(gè)體，可以是正在經(jīng)歷疾病狀態(tài)和/或預(yù)期將經(jīng)歷疾病狀態(tài)的個(gè)體，并且本發(fā)明的方法和組合物用于治療性和/或預(yù)防性治療。本文所述的寡糖是聚葡糖胺。聚葡糖胺和其衍生物作為殼聚糖和其衍生物而為在本領(lǐng)域所已知。特別有用的聚葡糖胺是大小可為100-20000g/mol內(nèi)的聚合物。分子量低于100g/mol的較小的聚葡糖胺和分子量大于20000g/mol的較大的聚葡糖胺也可以考慮。分子量大于20000g/mol的殼聚糖可能需要進(jìn)一步官能化以成為水溶性的。有用的聚葡糖胺的重要特征是在碳水化合物骨架上的可利用的氮，根據(jù)本文所述的方法，其被衍生化以形成釋放no的聚葡糖胺。有利的是，本文所公開(kāi)的聚葡糖胺是水溶性的。殼聚糖是由隨機(jī)分布的β-(1-4)-連接的d-葡糖胺(脫乙酰單元)和n-乙酰基-d-葡糖胺(乙?；瘑卧?構(gòu)成的線性多糖。它是聚葡糖胺。殼聚糖衍生自幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)是在貝類例如蝦、龍蝦和或蟹的外骨骼中發(fā)現(xiàn)的多糖。它具有以下結(jié)構(gòu)：殼聚糖是可生物降解和生物相容的。殼聚糖本身僅在酸性條件下可溶。殼聚糖多糖在生理?xiàng)l件下不可溶。此外，其no儲(chǔ)存相當(dāng)普通(約0.2μmol/mg)，這可能是由于多糖在no供體形成所需要的堿性溶液中較差的溶解性。valmikinathan,c.m.；mukhatyar,v.j.；jain,a.；karumbaiah,l.；dasari,m.；bellamkonda,r.v.photocrosslinkablechitosanbasedhydrogelsforneuraltissueengineering.softmatter2012,8,1964-1976；zhang,j.l.；xia,w.s.；liu,p.；cheng,q.y.；tahirou,t.；gu,w.x.；li,b.chitosanmodificationandpharmaceutical/biomedicalapplications.mar.drugs2010,8,1962-1987；wan,a.；gao,q.；li,h.l.effectsofmolecularweightanddegreeofacetylationonthereleaseofnitricoxidefromchitosan-nitricoxideadducts.j.appl.polym.sci.2010,117,2183-2188。為合成具有改善的no儲(chǔ)存的n-二醇二氮烯鎓官能化的殼聚糖衍生物，我們通過(guò)在過(guò)氧化氫中降解殼聚糖多糖制備了水溶性殼寡糖。本文所述的殼寡糖的益處是100-20000g/mol，特別是約10000g/mol或更??；或約8000g/mol或更?。换蚣s5000g/mol或更?。换蚣s2500g/mol或更小的相對(duì)低的分子量，以及其容易地透過(guò)生物膜的能力。maghami,g.g.；roberts,g.a.f.evaluationoftheviscometricconstantsforchitosan.makromol.chem.1988,189,195-200；porporatto,c.；bianco,i.d.；riera,c.m.；correa,s.g.,chitosaninducesdifferentl-argininemetabolicpathwaysinrestingandinflammatorymacrophages.biochem.biophy.res.comm.2003,304,266-272。本文所述的殼寡糖具有高達(dá)約8.7μmol/mg的較高no儲(chǔ)存，并且在中性和堿性條件下也是可溶的。殼聚糖骨架上的伯氨基是用于制備本文所公開(kāi)的釋放no的寡糖的“化學(xué)把柄(chemicalhandle)”。如下文的路線中所示，仲氨基是由所述伯氨基制備的。用于形成所述仲氨基的試劑選自氮丙啶(特別是2-甲基氮丙啶)和硫雜丙環(huán)等。在實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及聚葡糖胺，例如殼寡糖，其包含至少一個(gè)式i的結(jié)構(gòu)單元：和任選存在的至少一個(gè)式ii的結(jié)構(gòu)單元：其中，如果存在，r1、r2、r3和r4各自獨(dú)立地選自：氫；c1-5烷基(c＝o)-，當(dāng)所述c1-5烷基是甲基時(shí)，me(c＝o)-是?；鵤c；以及c1-5烷基；在每種情況下，是單鍵或雙鍵，其中，在它是雙鍵的每種情況下，連接到雙鍵-o的r1、r2、r3或r4不存在；當(dāng)r1不存在時(shí)，r5是氫、羥基、c1-5烷基或c1-5烷氧基；當(dāng)r3不存在時(shí)，r6是氫、羥基、c1-5烷基或c1-5烷氧基；其中，在它是單鍵的每種情況下，連接到雙鍵-o的r1、r2、r3或r4存在；當(dāng)r1存在時(shí)，r5是氫；當(dāng)r3存在時(shí)，r6是氫；q是-(crcrd)v-；其中rc和rd獨(dú)立地為氫或c1-5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、正丁基、異丁基和戊基。優(yōu)選地，rc和rd獨(dú)立地為氫、甲基或乙基；并且v是2-6的整數(shù)；優(yōu)選地，v是2；p是1-100，優(yōu)選1-50，更優(yōu)選1-25，最優(yōu)選1-10的整數(shù)；a是其中，l是s、o或n；并且在每種情況下，g獨(dú)立地為氫，或者連同l一起形成一氧化氮供體；x是氫、c1-5烷基，或者連同n一起形成一氧化氮供體；b是氫或-y-z，其中y是間隔基，并且z是聚合物或末端基團(tuán)；或者b不存在；d是-nrarb，其中ra和rb獨(dú)立地選自氫、甲?；?、c1-5烷基(c＝o)-(當(dāng)c1-5烷基是甲基時(shí)，me(c＝o)-是?；鵤c)、c1-5烷基和c1-5烷基酯；或者d是如果存在，r1、r2、r3和r4的有用的值各自獨(dú)立地選自氫和c1-5烷基。當(dāng)r1、r2、r3和r4中的一個(gè)或多個(gè)是c1-5烷基時(shí)，它選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、正丁基、異丁基和戊基。優(yōu)選地，如果存在，r1、r2、r3和r4是氫或甲基。最優(yōu)選地，如果存在，r1、r2、r3和r4是氫。在所有實(shí)施方案中，在每種情況下，是單鍵或雙鍵。優(yōu)選地，在所有情況下，它是單鍵。q是-(crcrd)v-；其中rc和rd獨(dú)立地為氫或c1-5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、正丁基、異丁基和戊基。優(yōu)選地，rc和rd獨(dú)立地為氫、甲基或乙基。v的有用的值是2-6的整數(shù)。優(yōu)選地，v是2。p的有用的值包括1-100的任何整數(shù)。優(yōu)選地，p是1-50的整數(shù)。更優(yōu)選地，p是1-25的整數(shù)。最優(yōu)選地，p是1-10的整數(shù)，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。l的有用的值是n、s和o。優(yōu)選地，l是n或s。在g存在的每種情況下，它獨(dú)立地為氫或一氧化氮供體。由于一氧化氮供體貢獻(xiàn)聚葡糖胺上的可利用的no的量，因此，優(yōu)選地，g是一氧化氮供體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在于聚葡糖胺上的g中的至少30％是一氧化氮供體。更優(yōu)選地，存在于聚葡糖胺上的g中的至少50％是一氧化氮供體。甚至更優(yōu)選地，存在于聚葡糖胺上的g中的至少90％是一氧化氮供體。最優(yōu)選地，存在于聚葡糖胺上的g中的至少95％是一氧化氮供體。x的有用的值是氫、c1-5烷基或一氧化氮供體。由于一氧化氮供體貢獻(xiàn)聚葡糖胺上的可利用的no的量，因此，優(yōu)選地，x是一氧化氮供體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在于聚葡糖胺上的x中的至少30％是一氧化氮供體。更優(yōu)選地，存在于聚葡糖胺上的x中的至少50％是一氧化氮供體。甚至更優(yōu)選地，存在于聚葡糖胺上的x中的至少90％是一氧化氮供體。最優(yōu)選地，存在于聚葡糖胺上的x中的至少95％是一氧化氮供體。b的有用的值是氫、-y-z，其中y是間隔基，并且z是單體或聚合物，或者b是末端基團(tuán)。當(dāng)l是o或s時(shí)，b也可以不存在。如本文所用，末端基團(tuán)是在聚合物或單體的末端的任何封端基團(tuán)。這些基團(tuán)在本領(lǐng)域是已知的。優(yōu)選地，當(dāng)b是末端基團(tuán)時(shí)，它是氫、羥基或c1-5烷基。z的有用的值包括本領(lǐng)域已知的單體和聚合物，特別是在活性藥物成分中使用的那些。特別有用的聚合物或單體包括：和其中，在每種情況下，j是1-100的整數(shù)。在本文所公開(kāi)的式中的有用的間隔基y包括本領(lǐng)域已知的間隔基或連接基，特別是在活性藥物成分中使用的那些。特別有用的間隔基包括以下：或者其中，在每種情況下，rp、rq、rs和rt獨(dú)立地為氫或羥基；并且k是1-20的整數(shù)。使用本文所公開(kāi)的策略，可如本文所述將存在于寡糖上的任何仲氨基進(jìn)行改性，以形成釋放no的寡糖。直接連接到糖骨架部分的仲氨基或在糖骨架部分上懸垂的仲氨基可以用no釋放部分官能化。如本文在合成途徑中充分公開(kāi)的，將伯胺改性為仲胺。該改性可以通過(guò)氮丙啶、硫雜丙環(huán)等促進(jìn)。有用的no釋放部分包括本領(lǐng)域已知的任何no釋放基團(tuán)。特別有用的是no釋放基團(tuán)的殘基，即共價(jià)結(jié)合到聚葡糖胺上的n、s或o的no供體。所述no供體連同所述聚葡糖胺上的其所結(jié)合的原子一起形成選自以下的部分：二醇二氮烯鎓，例如作為亞硝基硫醇(nitrosothiol)基團(tuán)的一部分的-no，亞硝胺，羥基亞硝胺，羥基胺、羥基脲以及它們的組合。優(yōu)選地，所述no釋放部分是二醇二氮烯鎓。這些基團(tuán)可以鹽的形式存在。在一些實(shí)施方案中，所述no供體是n-二醇二氮烯鎓(即，1-氨基取代的二氮烯-1-鎓-1,2-二醇鹽)，n-二醇二氮烯鎓作為no供體特別有吸引力，因?yàn)樗鼈兡軌蛟谏飾l件下自發(fā)產(chǎn)生no。參見(jiàn)hrabie,j.a.和keefer,l.k.,chem.rev.,102,1135-1154(2002)；以及napoli,c.和lanarro,l.j.,annu.rev.pharmacol.toxicol.,43,97-123(2003)。已經(jīng)使用一系列親核殘基合成了幾種n-二醇二氮烯鎓化合物，所述親核殘基包括伯胺和仲胺、聚胺以及仲氨基酸，參見(jiàn)hrabie,j.a.和keeferl.k.,chem.rev.,102,1135-1154(2002)。在n-二醇二氮烯鎓的形成中，1當(dāng)量的胺與2當(dāng)量的一氧化氮在升高的壓力下反應(yīng)。堿(例如醇鹽，如甲醇鹽)從胺氮除去質(zhì)子以產(chǎn)生穩(wěn)定的陰離子[n(o)no]基團(tuán)。盡管在環(huán)境條件下是穩(wěn)定的，但n-二醇二氮烯鎓在含水介質(zhì)中自發(fā)分解以產(chǎn)生no，其速率取決于ph、溫度和/或胺部分的結(jié)構(gòu)。例如，已開(kāi)發(fā)了n-二醇二氮烯鎓改性的脯氨酸(proli/no)、2-(二甲基氨基)-乙基腐胺(2-(dimethylamino)-ethylputreamlne)(dmaep/no)、n,n-二甲基己二胺(dmhd/no)和二亞乙基三胺(deta/no)作為小分子no供體，所述no供體在ph7.4和37℃下具有2秒到20小時(shí)的不同no釋放半衰期。參見(jiàn)hrabie,j.a.和keefer,l.k.,chem.rev.,102,1135-1154(2002)；以及keefer,l.k.,annu,rev.pharmacol.toxicol43,585-607(2003)。聚葡糖胺的仲胺官能團(tuán)在強(qiáng)堿和氣體一氧化氮存在下以高收率轉(zhuǎn)化為一氧化氮供體。如本文所提供的，溶劑系統(tǒng)可影響聚葡糖胺的no加載。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)聚葡糖胺具體地如本文所述用氮丙啶官能化時(shí)，官能化的聚葡糖胺包含至少一個(gè)式ia的結(jié)構(gòu)單元：和任選存在的至少一個(gè)式iia的結(jié)構(gòu)單元：其中，除d以外，變量的定義如上文所定義。在該實(shí)施方案中，d是-nrarb，其中ra和rb獨(dú)立地選自氫、甲?；1-5烷基(c＝o)-、c1-5烷基和c1-5烷基酯；或者d具有以下結(jié)構(gòu)：其中，x、q、p和b如上所述。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，當(dāng)聚葡糖胺具體地如本文所述用氮丙啶官能化時(shí)，官能化的聚葡糖胺包含至少一個(gè)式viii的結(jié)構(gòu)單元：其中，變量如上文對(duì)于該實(shí)施方案所述。術(shù)語(yǔ)“氨基”和“胺”是指含有氮的基團(tuán)，例如nr3、nh3、nhr2和nh2r，其中r可以如本文其他地方所述。因此，本文所用的“氨基”可以指伯胺、仲胺或叔胺。在一些實(shí)施方案中，氨基的一個(gè)r可以是二醇二氮烯鎓(即，nono)。術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)離子胺”和“季胺”是指具有鍵合到氮的額外的(即，第四個(gè))基團(tuán)(例如氫或烷基)的氨基。因此，陽(yáng)離子胺和季胺帶正電荷。術(shù)語(yǔ)“烷基”表示含有1-24個(gè)碳原子，例如1-12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴鏈。烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基等。術(shù)語(yǔ)“烷氧基”在本文中用來(lái)指鍵合到氧原子的如上文所定義的直鏈或支鏈烷基(除非鏈長(zhǎng)度限于此)，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基等。優(yōu)選地，烷氧基鏈的長(zhǎng)度是1-5個(gè)碳原子，更優(yōu)選地，長(zhǎng)度是1-3個(gè)碳原子。公開(kāi)了以下特定實(shí)施方案：1.聚葡糖胺(殼寡糖)，其包含：至少一個(gè)以下結(jié)構(gòu)單元：和任選存在的至少一個(gè)以下結(jié)構(gòu)單元：其中，如果存在，r1、r2、r3和r4各自獨(dú)立地選自氫、c1-5烷基(c＝o)-和c1-5烷基；在每種情況下，是單鍵或雙鍵，其中，在它是雙鍵的每種情況下，連接到雙鍵-o的r1、r2、r3或r4不存在；當(dāng)r1不存在時(shí)，r5是氫、羥基、c1-5烷基或c1-5烷氧基；當(dāng)r3不存在時(shí)，r6是氫、羥基、c1-5烷基或c1-5烷氧基；其中，在它是單鍵的每種情況下，連接到雙鍵-o的r1、r2、r3或r4存在；當(dāng)r1存在時(shí)，r5是氫；當(dāng)r3存在時(shí)，r6是氫；q是-(crcrd)v-；其中rc和rd獨(dú)立地為氫或c1-5烷基；并且v是2-6的整數(shù)；p是1-10的整數(shù)；a是其中，l是s、o或n；并且在每種情況下，g獨(dú)立地為氫，或者連同l一起形成一氧化氮供體，或者不存在；x是氫、c1-5烷基，或者連同n一起形成一氧化氮供體；b是一個(gè)氫或-y-z，其中y是間隔基，并且z是聚合物或末端基團(tuán)；d是-nrarb，其中ra和rb獨(dú)立地選自氫、甲?；1-5烷基(c＝o)-、c1-5烷基和c1-5烷基酯；或者d是2.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中所述x和g中的至少一個(gè)連同所述聚葡糖胺上的其所結(jié)合的原子一起形成一氧化氮供體。3.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其包含以下結(jié)構(gòu)單元：其中，m是1-10,000的整數(shù)。4.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中連同所述聚葡糖胺上的其所結(jié)合的原子一起的所述一氧化氮供體選自：二醇二氮烯鎓、亞硝基硫醇、亞硝胺、羥基亞硝胺、羥基胺、羥基脲以及它們的組合。5.實(shí)施方案4所述的聚葡糖胺，其中所述一氧化氮供體是二醇二氮烯鎓。6.實(shí)施方案3所述的聚葡糖胺，其中m是1-50的整數(shù)。7.實(shí)施方案3所述的聚葡糖胺，其中m是1-10的整數(shù)。8.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其包含至少一個(gè)以下結(jié)構(gòu)單元：其中，d是-nrarb，其中ra和rb獨(dú)立地選自氫、甲酰基、c1-5烷基(c＝o)-、c1-5烷基和c1-5烷基酯。9.實(shí)施方案8所述的聚葡糖胺，其中在每種情況下，是單鍵，r1、r2、r3和r4各自為氫，并且r5和r6各自為氫。10.實(shí)施方案9所述的聚葡糖胺，其包含至少一個(gè)以下結(jié)構(gòu)單元：11.實(shí)施方案10所述的聚葡糖胺，其中b是氫。12.實(shí)施方案11所述的聚葡糖胺，其中b是-y-z。13.實(shí)施方案12所述的聚葡糖胺，其中b是-y-z，其中z具有以下結(jié)構(gòu)：或其中，在每種情況下，j是1-100的整數(shù)。14.實(shí)施方案12所述的聚葡糖胺，其中y具有以下結(jié)構(gòu)：或其中，在每種情況下，rp、rq、rs和rt獨(dú)立地為氫或羥基；并且k是1-20的整數(shù)。15.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其包含以下結(jié)構(gòu)單元：其中，d是16.實(shí)施方案15所述的聚葡糖胺，其中在每種情況下，是單鍵，并且r1、r2、r3和r4各自為氫。17.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中b是-y-z，其中z具有以下結(jié)構(gòu)：或其中，在每種情況下，j是1-100的整數(shù)。18.實(shí)施方案17所述的聚葡糖胺，其中j是1-50的整數(shù)。19.實(shí)施方案17所述的聚葡糖胺，其中j是1-15的整數(shù)。20.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中a是其中g(shù)是氫，或者連同n一起形成一氧化氮供體，或者不存在；并且b是氫。21.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其包含以下結(jié)構(gòu)單元：其中，m是1-1000的整數(shù)，并且n是1-1000的整數(shù)。22.實(shí)施方案21所述的聚葡糖胺，其中m和n各自獨(dú)立地選自1-50的整數(shù)。23.實(shí)施方案21所述的聚葡糖胺，其包含以下結(jié)構(gòu)單元：24.實(shí)施方案20所述的聚葡糖胺，其中x是氫，或者連同n一起形成二醇二氮烯鎓；并且a是其中g(shù)是氫，或者連同n一起形成二醇二氮烯鎓。25.實(shí)施方案21所述的聚葡糖胺，其中b是-y-z，其中z具有以下結(jié)構(gòu)：或其中，在每種情況下，j是1-100的整數(shù)。26.實(shí)施方案22所述的聚葡糖胺，其中y具有以下結(jié)構(gòu)：或其中，在每種情況下，rp、rq、rs和rt獨(dú)立地為氫或羥基；并且k是1-20的整數(shù)。27.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中a是n。28.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中a是s。29.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中rc和rd獨(dú)立地為氫或甲基；并且v是2。30.向個(gè)體遞送一氧化氮的方法，其包括：向所述個(gè)體給藥有效量的權(quán)利要求1所述的聚葡糖胺。31.治療疾病狀態(tài)的方法，其包括：向有此需要的個(gè)體給藥有效量的實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中所述疾病狀態(tài)選自：癌癥、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于醫(yī)療裝置引起的血小板聚集和血小板粘附；由異常細(xì)胞增殖引起的病理病癥；移植排斥、自身免疫疾病、炎癥、血管疾??；疤痕組織；傷口收縮、再狹窄、疼痛、發(fā)熱、胃腸道病癥、呼吸病癥、性功能障礙和性傳播疾病。32.實(shí)施方案31所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是囊性纖維化。33.藥物制劑，其包含：i.權(quán)利要求1所述的聚葡糖胺；以及ii.藥學(xué)上可接受的載體。34.實(shí)施方案33所述的藥物制劑，其中所述聚葡糖胺是水溶性的。35.實(shí)施方案1所述的聚葡糖胺，其中所述聚葡糖胺是水溶性的。在所有實(shí)施方案中，只有當(dāng)取代基和/或變量的組合產(chǎn)生符合每個(gè)原子的已知化合價(jià)的化合物時(shí)，此類組合才是允許的。特定的官能化聚葡糖胺包括：在每個(gè)上述式i的結(jié)構(gòu)和其中的實(shí)施方案(即，式iii、vi和vii)中，當(dāng)存在時(shí)，m是1-10000，優(yōu)選1-1000或1-500，更優(yōu)選1-200或1-100，最優(yōu)選1-50、1-20或1-10的整數(shù)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；n是1-10000，優(yōu)選1-1000或1-500，更優(yōu)選1-200或1-100，最優(yōu)選1-50、1-20或1-10的整數(shù)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且i是1-10000，優(yōu)選1-1000或1-500，更優(yōu)選1-200或1-100，最優(yōu)選1-50、1-20或1-10的整數(shù)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及向個(gè)體遞送一氧化氮的方法，其包括向個(gè)體給藥有效量的官能化的聚葡糖胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及治療疾病狀態(tài)的方法，其包括向有此需要的個(gè)體給藥有效量的所述權(quán)利要求1的聚葡糖胺，其中所述疾病狀態(tài)選自：癌癥、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于醫(yī)療裝置引起的血小板聚集和血小板粘附；由異常細(xì)胞增殖引起的病理病癥；移植排斥、自身免疫疾病、炎癥、血管疾?。话毯劢M織；傷口收縮、再狹窄、疼痛、發(fā)熱、胃腸道病癥、呼吸病癥、性功能障礙和性傳播疾病。優(yōu)選地，所述疾病狀態(tài)是囊性纖維化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及破壞、消除或防止生物膜的方法。該方法包括使表面或區(qū)域與如本文所述的官能化的聚葡糖胺接觸，所述表面或區(qū)域含有生物膜或者易受生物膜影響，所述生物膜形成或占據(jù)所述表面或區(qū)域的一部分或全部。術(shù)語(yǔ)“生物膜”旨在表示一種或多種微生物的聚集體，其中細(xì)胞彼此粘附，通常在表面上。大多數(shù)任何自由漂浮的微生物可以形成生物膜和/或附著到表面。微生物可以經(jīng)由范德華力通過(guò)弱的可逆的粘附而粘附到表面或彼此粘附。所述微生物使用細(xì)胞粘附或例如菌毛的結(jié)構(gòu)可以更長(zhǎng)久地錨定。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的主題涉及包含官能化的聚葡糖胺和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。優(yōu)選地，如本公開(kāi)通篇所述，所述官能化的聚葡糖胺是水溶性的。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”是指不是生物學(xué)上或其他方面不期望的物質(zhì)，即，該物質(zhì)可與本發(fā)明的組合物一起給藥于個(gè)體，而不會(huì)造成實(shí)質(zhì)有害的生物學(xué)效應(yīng)或以有害的方式與所述組合物所含的任何其他組分相互作用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見(jiàn)例如remington'spharmaceuticalscience；第20版.2005)，自然會(huì)選擇所述物質(zhì)，以最小化活性成分的任何降解以及最小化在個(gè)體中的任何不良副作用。例示性的用于本發(fā)明的組合物的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無(wú)菌無(wú)熱原水和無(wú)菌無(wú)熱原的生理鹽水溶液。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的治療組合物包括包含本申請(qǐng)公開(kāi)的釋放一氧化氮的聚葡糖胺和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。合適的組合物包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、殺菌抗生素和使制劑與預(yù)期接受者的體液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌混懸劑，其可包含懸浮劑和增稠劑。本申請(qǐng)公開(kāi)的方法中使用的組合物可以采取諸如在油性或水性媒介物中的混懸劑、溶液或乳劑的形式，并且可以包含配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以為粉末形式，其用于在使用前用合適的媒介物(例如無(wú)菌無(wú)熱原水)進(jìn)行構(gòu)建。所述治療組合物可以在單位劑量或多劑量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中呈現(xiàn)，并且可以冷凍或冷凍干燥(凍干)的狀態(tài)儲(chǔ)存，僅需要在使用前即刻加入無(wú)菌液體載體。對(duì)于口服給藥，所述組合物可以采取例如通過(guò)常規(guī)技術(shù)用藥學(xué)上可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊的形式，所述賦形劑例如粘合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)。片劑可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣。例如，治療劑可以與氫氯噻嗪組合進(jìn)行配制并且作為具有腸溶包衣或延遲釋放包衣的ph穩(wěn)定化的核心，所述包衣保護(hù)所述治療劑，直到其到達(dá)靶器官。用于口服給藥的液體制劑可以采取例如溶液、糖漿或混懸劑的形式，或者它們可以作為在使用前用水或其他合適的媒介物進(jìn)行構(gòu)建的干燥產(chǎn)品呈現(xiàn)。此類液體制劑可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)用藥學(xué)上可接受的添加劑制備，所述添加劑例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制劑還可以視需要含有緩沖鹽、矯味劑、著色劑和甜味劑?？梢赃m當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诳诜o藥的制劑，以提供活性化合物的控制釋放。對(duì)于含服給藥，所述組合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑或糖錠的形式。所述化合物還可以被配制成用于植入或注射的制劑。因此，例如，所述化合物可與合適的聚合物或疏水性材料(例如，作為在可接受的油中的乳液)或離子交換樹(shù)脂一起配制，或者作為微溶衍生物(例如，作為微溶鹽)。所述化合物也可以被配制成直腸組合物(例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)(例如可可脂或其他甘油酯)的栓劑或保留灌腸劑)、乳膏或洗劑，或者透皮貼劑。還提供適于作為氣溶膠通過(guò)吸入給藥的藥物制劑。優(yōu)選地，本文所述的官能化的聚葡糖胺被配制成溶液和/或氣溶膠形式。這些制劑包含本文所述的釋放no的聚葡糖胺的溶液或混懸液。期望的制劑可以被放置在小室中，并霧化。霧化可以通過(guò)壓縮空氣或通過(guò)超聲能以形成多個(gè)包含所述釋放no的聚葡糖胺的液滴或固體顆粒來(lái)完成。例如，本申請(qǐng)公開(kāi)的釋放no的聚葡糖胺可以通過(guò)吸入給藥，以治療與囊性纖維化有關(guān)的細(xì)菌感染。與囊性纖維化有關(guān)的細(xì)菌感染包括但不限于寡養(yǎng)單胞菌屬(stenotrophomonis)感染、鳥(niǎo)胞內(nèi)分枝桿菌(mybacteriumaviumintracellulaire)感染和膿腫分枝桿菌(m.abcessus)感染、洋蔥伯克氏菌(burkhoderiacepacia)感染和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa或p.aeruginosa)感染。術(shù)語(yǔ)“有效量”在本文中用于指治療組合物(例如，包含釋放一氧化氮的聚葡糖胺的組合物)足以產(chǎn)生可測(cè)量的生物反應(yīng)的量。本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的活性組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化，以給藥對(duì)于特定個(gè)體和/或應(yīng)用有效實(shí)現(xiàn)期望反應(yīng)的量的活性化合物。所選劑量水平取決于多種因素，包括組合物的活性、制劑、給藥途徑、與其他藥物或治療組合、所治療病癥的嚴(yán)重程度，以及所治療個(gè)體的身體狀況和先前病史。優(yōu)選地，給藥最小劑量，并且在不存在劑量限制性毒性的情況下，將劑量逐步增加到最小有效量。有效劑量的確定和調(diào)整，以及何時(shí)和如何進(jìn)行此類調(diào)整的評(píng)估對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言是已知的。對(duì)于如本文所公開(kāi)的組合物的給藥，可以使用用于將小鼠劑量換算為人類劑量的換算因子，進(jìn)行基于向鼠類動(dòng)物模型給藥的劑量外推人類劑量的常規(guī)方法：人類劑量/kg＝小鼠劑量/kg×12。參見(jiàn)freireich等人，cancerchemotherrep.50,219-244(1966)。藥物劑量也可以mg/平方米體表面積給出，因?yàn)檫@種方法勝于體重實(shí)現(xiàn)與某些代謝和排泄功能的良好相關(guān)。此外，體表面積可以用作成人和兒童以及不同動(dòng)物物種中的藥物劑量的共同特征。參見(jiàn)freireich等人，cancerchemotherrep.50,219-244(1966)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，為將在任何給定物種中的mg/kg劑量表示為等效的mg/sqm劑量，將劑量乘以合適的km因子。在成人中，100mg/kg相當(dāng)于100mg/kg×37kg/sqm＝3700mg/m2。關(guān)于制劑和劑量的更多指導(dǎo)，參見(jiàn)美國(guó)專利第5,326,902號(hào)；第5,234,933號(hào)；pct國(guó)際公開(kāi)第wo93/25521號(hào)；berkow等人，themerckmanualofmedicalinformation，home編，merckresearchlaboratories:whitehousestation,n.j.(1997)；goodman等人，goodman&gilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics，第9版.mcgraw-hillhealthprofessionsdivision:newyork(1996)；ebadi,crcdeskreferenceofclinicalpharmacology,crcpress,bocaraton,fla.(1998)；katzunq,basic&clinicalpharmacology，第8版.langemedicalbooks/mcgraw-hillmedicalpub.division:newyork(2001)；remington等人，remington'spharmaceuticalsciences，第15版.mackpub.co.:easton,pa.(1975)；以及speight等人，avery'sdrugtreatment:aguidetotheproperties,choice,therapeuticuseandeconomicvalueofdrugsindiseasemanagement，第4版.adisinternational:auckland/philadelphia(1997)；dutch等人，toxicol.leu.,100-101,255-263(1998)。用于向個(gè)體給藥本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的組合物的合適的方法包括但不限于全身給藥、腸胃外給藥(包括血管內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)給藥)、口服遞送、含服遞送、皮下給藥、吸入、氣管內(nèi)滴注(intratrachealinstallation)、手術(shù)植入、經(jīng)皮遞送、局部注射和超高速注射/轟擊。在適用的情況下，連續(xù)輸注可以增強(qiáng)在目標(biāo)部位的藥物蓄積(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第6,180,082號(hào))。根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的方法使用的特定藥物給藥模式取決于多種因素，包括但不限于所使用的藥劑和/或載體、所治療病癥的嚴(yán)重程度以及活性劑在給藥后的代謝或消除機(jī)制。在一些實(shí)施方案中，一種或多種另外的治療劑可以與所述官能化的聚葡糖胺組合使用。此類另外的藥劑可以是包含所述官能化的聚葡糖胺的制劑的一部分，或者作為單獨(dú)的制劑在包含所述官能化的聚葡糖胺的制劑之前、之后或在同一時(shí)間(并行)給藥。具體地，此類另外的治療劑包括抗癌治療劑、抗微生物劑、止痛藥、消炎藥、血管擴(kuò)張劑和免疫抑制劑，以及可以增強(qiáng)所治療疾病或病癥的減輕的任何其他已知的治療劑?！安⑿小笔侵笗r(shí)間足夠接近以產(chǎn)生組合效果(也就是說(shuō)，并行可以是同時(shí)，或者它可以是兩個(gè)或更多個(gè)事件在彼此前后很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生)。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種化合物“并行”給藥是指兩種化合物的給藥時(shí)間足夠接近，使得一種化合物的存在改變了另一種化合物的生物學(xué)效應(yīng)。兩種化合物可以在相同或不同的制劑中或者順序給藥。并行給藥可以通過(guò)以下方式來(lái)進(jìn)行：在給藥之前混合化合物，或者以兩種不同的制劑給藥化合物，例如，在相同的時(shí)間點(diǎn)，但在不同的解剖部位或使用不同的給藥途徑。欲與釋放no的聚葡糖胺組合使用的另外的治療劑的選擇取決于多種因素，包括但不限于疾病的類型、個(gè)體的年齡和一般健康狀況、疾病進(jìn)展的攻擊性以及個(gè)體耐受包含所述組合的藥劑的能力。多種化學(xué)化合物(也被描述為“抗腫瘤”劑或“化學(xué)治療劑”)可以與用于治療癌癥的本申請(qǐng)公開(kāi)的釋放no的聚葡糖胺組合使用。此類化學(xué)治療化合物包括但不限于烷化劑、dna嵌入劑、蛋白質(zhì)合成抑制劑、dna或rna合成抑制劑、dna堿基類似物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗血管生成劑，以及端粒酶抑制劑或端粒dna結(jié)合化合物。例如，合適的烷化劑包括烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派(benzodizepa)、卡巴醌、美妥替哌和烏瑞替派；乙烯亞胺和甲基蜜胺，例如六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖、新氮芥(novembichine)、膽甾醇對(duì)苯乙酸氮芥、潑尼氮芥、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀。在癌癥的治療中使用的抗生素包括放線菌素d、柔紅霉素、多柔比星、伊達(dá)比星、硫酸博來(lái)霉素、絲裂霉素c、普卡霉素和鏈佐星?；瘜W(xué)治療抗代謝劑包括巰基嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、克拉屈濱、磷酸氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷、阿糖胞苷、噴司他丁、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤、阿昔洛韋、腺嘌呤β-1-d-阿糖胞苷、氨甲蝶呤、氨基蝶呤、2-氨基嘌呤、阿非迪霉素、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、偶氮絲氨酸、6-氮尿嘧啶、2'-疊氮基-2'-脫氧核苷、5-溴脫氧胞苷、胞嘧啶β-1-d-阿糖胞苷、重氮氧正亮氨酸、雙脫氧核苷、5-氟脫氧胞苷、5-氟脫氧尿苷和羥基脲?；瘜W(xué)治療蛋白合成抑制劑包括相思豆毒蛋白、金精三羧酸、氯霉素、大腸桿菌素e3、環(huán)己酰亞胺、白喉毒素、伊短菌素a、依米丁、紅霉素、乙硫氨酸、氟化物、5-氟色氨酸、夫西地酸、鳥(niǎo)苷酰亞甲基二磷酸(guanylylmethylenediphosphonate)和鳥(niǎo)苷酰亞胺二磷酸(guanylylimidodiphosphate)、卡那霉素、春雷霉素、黃色霉素和o-甲基蘇氨酸。另外的蛋白合成抑制劑包括蒴蓮根毒蛋白、新霉素、正纈氨酸、密旋霉素、巴龍霉素、嘌羅霉素、蓖麻毒蛋白、志賀毒素、焦土霉素、司帕霉素、大觀霉素、鏈霉素、四環(huán)素、硫鏈絲菌肽和甲氧芐啶。dna合成抑制劑可以用作本申請(qǐng)公開(kāi)的癌癥治療的一部分，所述dna合成抑制劑包括烷化劑，例如硫酸二甲酯、絲裂霉素c、氮芥和硫芥；嵌入劑，例如吖啶染料、放線菌素、阿霉素、蒽類、苯并芘、溴乙啶、二碘化丙啶-纏繞劑(propidiumdiiodide-intertwining)；以及例如偏端霉素和紡錘菌素的藥劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如香豆霉素、萘啶酸、新生霉素和奧索利酸)；細(xì)胞分裂抑制劑(包括秋水仙胺、秋水仙堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿)；以及rna合成抑制劑(包括放線菌素d、α-鵝膏蕈堿和其他真菌鵝膏蕈毒素、蛹蟲(chóng)草菌素(3'-脫氧腺苷)、二氯呋喃核糖基苯并咪唑、利福平、曲張鏈菌素和利迪鏈菌素)也可以與官能化的聚葡糖胺組合以提供合適的癌癥治療。因此，可與本申請(qǐng)所述的釋放no的官能化的聚葡糖胺組合使用的現(xiàn)有化學(xué)治療劑包括阿霉素、5-氟尿嘧啶(5fu)、依托泊苷、喜樹(shù)堿、放線菌素-d、絲裂霉素、順鉑、過(guò)氧化氫、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基脲、放線菌素d、柔紅霉素、多柔比星、博來(lái)霉素、普卡霉素、他莫昔芬、紫杉醇、反鉑、長(zhǎng)春堿和甲氨蝶呤等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗微生物劑”是指殺死細(xì)菌、真菌、酵母菌或病毒，抑制其生長(zhǎng)，或者阻止其生長(zhǎng)的任何藥劑?？梢該饺氡旧暾?qǐng)公開(kāi)的釋放no的官能化的聚葡糖胺中以幫助治療或預(yù)防微生物感染的合適的抗微生物劑包括但不限于抗生素，例如萬(wàn)古霉素、博來(lái)霉素、噴司他丁、米托蒽醌、絲裂霉素、放線菌素d、普卡霉素和阿米卡星。其他抗微生物劑包括抗細(xì)菌劑，例如2-對(duì)-磺胺?；桨坊掖?、4,4'-氨苯亞砜、4-磺胺水楊酸、氨苯砜乙酸、磺胺苯砜、阿米卡星、阿莫西林、兩性霉素b、氨芐西林、阿帕西林、阿哌環(huán)素、安普霉素、阿貝卡星、阿撲西林、疊氮氯霉素、阿奇霉素、氨曲南、桿菌肽、班貝霉素、比阿培南、溴莫普林、布替羅星、卷曲霉素、羧芐西林、卡波霉素、卡蘆莫南、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢曲嗪、頭孢拉宗、頭孢克定、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢甲肟、頭孢米諾、頭孢地嗪、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢替坦、頭孢替安、頭孢唑蘭、頭孢咪唑、頭孢匹胺、頭孢匹羅、頭孢丙烯、頭孢沙定、頭孢他啶、頭孢特侖、頭孢布烯、頭孢曲松、頭孢唑南、頭孢氨芐、頭孢來(lái)星、頭孢菌素c、頭孢拉定、氯霉素、金霉素、環(huán)丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯莫環(huán)素、粘菌素、環(huán)青霉素、氨苯砜、地美環(huán)素(demecicycline)、地百里砜、地貝卡星、雙氫鏈霉素、地紅霉素、多西環(huán)素、依諾沙星、恩維霉素、依匹西林、紅霉素、氟氧頭孢、福提霉素、慶大霉素、葡胺苯砜、苯丙砜、短桿菌肽s、短桿菌肽、格帕沙星、胍甲環(huán)素、海他西林、亞胺培南、異帕米星、交沙霉素、卡那霉素、柱晶白霉素、林可霉素、洛美沙星、魯斯霉素、賴甲環(huán)素、甲氯環(huán)素、美羅培南、甲烯土霉素、小諾霉素、麥迪霉素、米諾環(huán)素、拉氧頭孢、莫匹羅星、那氟沙星、那他霉素、新霉素、奈替米星、諾氟沙星、竹桃霉素、土霉素、對(duì)-磺胺?；S胺、帕尼培南、巴龍霉素、帕珠沙星、青霉素n、匹哌環(huán)素、吡哌酸、多粘菌素、普利霉素、喹那西林、核糖霉素、利福米特、利福平、利福霉素sv、利福噴丁、利福昔明、利托菌素、利替培南、羅他霉素、羅利環(huán)素、薔薇霉素、羅紅霉素、柳氮磺嘧啶、山環(huán)素、西索米星、司帕沙星、大觀霉素、螺旋霉素、鏈霉素、琥珀氨苯砜、磺胺柯定、磺胺洛西酸、磺胺米柯定、對(duì)氨基苯磺酸、阿地砜、替考拉寧、替馬沙星、替莫西林、四環(huán)素、四氧普林、甲砜霉素、噻唑砜、硫鏈絲菌素、替卡西林、替吉莫南、妥布霉素、托氟沙星、甲氧芐啶、丙大觀霉素、曲伐沙星、結(jié)核放線菌素和萬(wàn)古霉素?？刮⑸飫┻€可以包括抗真菌劑，例如兩性霉素b、偶氮絲氨酸、殺念菌素、氯苯甘醚、制皮菌素、非律平、制霉色基素、美帕曲星、制霉菌素、寡霉素、表霉素a、殺結(jié)核菌素、咪唑、三唑和灰黃霉素。在一些實(shí)施方案中，可以將所述釋放no的聚葡糖胺摻入聚合物膜中。此類摻入可以通過(guò)將所述聚葡糖胺物理嵌入聚合物表面中，經(jīng)由所述聚葡糖胺在聚合物表面上的靜電締合，或者通過(guò)官能化的聚葡糖胺共價(jià)連接到聚合物表面上的反應(yīng)性基團(tuán)上進(jìn)行?；蛘撸梢詫⑺龉倌芑木燮咸前坊烊胍簯B(tài)聚合物前體的溶液中，從而在聚合物固化時(shí)被俘獲在聚合物基質(zhì)中。也可以使用可聚合基團(tuán)進(jìn)一步官能化所述官能化的聚葡糖胺，由此，所述聚葡糖胺可以在聚合過(guò)程期間共聚合為聚合物?？梢詫⑺鲠尫舗o的聚葡糖胺摻入其中的合適的聚合物包括聚烯烴，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯和聚偏乙烯，以及聚酯、聚醚、聚氨酯等。特別地，聚氨酯可包括醫(yī)學(xué)上分節(jié)的聚氨酯(medicallysegmentedpolyurethanes)。醫(yī)學(xué)上分節(jié)的聚氨酯還可以包含一個(gè)或多個(gè)向聚合物添加額外的長(zhǎng)度或重量的擴(kuò)展部分，例如亞烷基鏈。此類聚氨酯也通常是無(wú)毒性的。醫(yī)學(xué)上分節(jié)的聚氨酯的一個(gè)實(shí)例是含有釋放no的聚葡糖胺的聚合物膜可以用于涂覆各種制品，特別是外科手術(shù)工具、生物傳感器和醫(yī)療植入物，以防止血小板粘附，防止細(xì)菌感染，充當(dāng)血管擴(kuò)張劑。這些制品可以用在血管醫(yī)療裝置、泌尿醫(yī)療裝置、膽道醫(yī)療裝置、胃腸醫(yī)療裝置、適于放置在手術(shù)部位的醫(yī)療裝置和適于放置在皮膚傷口或開(kāi)口上的醫(yī)療裝置中。因此，所述聚合物可用于涂覆動(dòng)脈支架、導(dǎo)絲、導(dǎo)管、套針、骨錨、骨螺絲、保護(hù)性鍍層、髖關(guān)節(jié)置換、電引線、生物傳感器、探針、縫合線、手術(shù)單、傷口敷料和繃帶。在一些實(shí)施方案中，所涂覆的裝置可具有金屬表面，例如，不銹鋼、鎳、鈦、鋁、銅、金、銀、鉑和其組合。在一些實(shí)施方案中，含有所述釋放no的聚葡糖胺的膜或聚合物可用于涂覆非金屬表面，例如玻璃或纖維(例如，布或紙)。此外，可以使用含有釋放no的聚葡糖胺的聚合物形成裝置本身。例如，可以將所述聚合物塑造成血液或組織的儲(chǔ)存袋或者塑造為傷口敷料。可以與官能化的聚葡糖胺接觸以防止或破壞生物膜的表面包括選自醫(yī)療裝置、管子附件、冷凝器盤(pán)管、光學(xué)表面、船體和飛機(jī)的那些。其他非限制性實(shí)例包括臺(tái)面、窗戶、器具、硬地板、地毯、浴缸、淋浴器、鏡子、馬桶、坐浴盆、浴室裝置、水槽、冰箱、微波爐、廚房小器具、桌子、椅子、櫥柜、抽屜、沙發(fā)、雙人沙發(fā)、長(zhǎng)椅、床、凳子、大型衣櫥、衣柜、梳妝臺(tái)、展示柜、鐘表、餐具柜、簾幕、百葉窗、娛樂(lè)中心、臂軌(armrail)、燈具、樓梯扶手、圖書(shū)館、櫥柜、書(shū)桌、門(mén)、貨架、睡椅、推車、鋼琴、雕塑和其他藝術(shù)品、擱物架、風(fēng)扇、燈固定架、臺(tái)球桌、乒乓球桌、足球桌、牌桌、工具(例如，手動(dòng)工具和/或手持工具、電動(dòng)工具、氣動(dòng)工具等)、電話、收音機(jī)、電視、立體聲設(shè)備、cd和dvd播放器、模擬和數(shù)字聲音裝置、掌上計(jì)算機(jī)、膝上型計(jì)算機(jī)、臺(tái)式計(jì)算機(jī)和塔式計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)監(jiān)視器、mp3播放器、存儲(chǔ)器存儲(chǔ)裝置、照相機(jī)、攝像機(jī)、車輛表面(例如，擋風(fēng)玻璃；輪胎；金屬、纖維玻璃、復(fù)合材料和/或塑料外表面；織物和/或乙烯樹(shù)脂外表面；織物、乙烯樹(shù)脂和/或皮革內(nèi)表面；金屬、塑料、木材和/或復(fù)合材料內(nèi)表面、玻璃內(nèi)表面等)、自行車、摩托雪橇、摩托車、越野車、場(chǎng)地設(shè)備、農(nóng)場(chǎng)設(shè)備、洗滌設(shè)備(例如，動(dòng)力清洗機(jī)等)、涂裝設(shè)備(例如，電動(dòng)和氣動(dòng)涂裝設(shè)備等)、醫(yī)療和/或牙科設(shè)備、水上設(shè)備(例如，帆船、機(jī)動(dòng)船、筏、帆板、獨(dú)木舟、劃槳船等)、玩具、書(shū)寫(xiě)工具、手表、加框照片或圖畫(huà)、書(shū)本和/或類似物。在期望導(dǎo)致一種或多種類型的液體流過(guò)表面而不是被吸收到表面中和/或沾污表面的情況中，任何表面都可以是基底。例如，暴露于環(huán)境條件的表面。還特別優(yōu)選所述表面可成為微生物粘附地點(diǎn)的情況，例如接觸身體組織或體液的醫(yī)療裝置。適于穿過(guò)血管或其他體腔的醫(yī)療裝置(例如導(dǎo)管)通常具有低摩擦外表面。如果醫(yī)療裝置的表面不是低摩擦表面，則將所述裝置插入體腔中和將所述裝置從體腔中移除變得更加困難，并且可能會(huì)發(fā)生身體組織的損傷或炎癥。低摩擦表面也有益于降低可能由于某些長(zhǎng)期裝置(例如，長(zhǎng)期導(dǎo)管)與周圍組織之間的移動(dòng)造成的，例如由于患者的活動(dòng)造成的不適和損傷。醫(yī)療裝置包括各種可植入和可插入的醫(yī)療裝置(在本文中也稱為“內(nèi)部醫(yī)療裝置”)。此類醫(yī)療裝置的實(shí)例包括涉及遞送或移除流體(例如，含有藥物的流體、加壓流體例如充氣流體、體液、造影劑、熱或冷的介質(zhì)等)的裝置以及用于插入和/或通過(guò)各種體腔的裝置，所述體腔包括心血管系統(tǒng)的管腔，例如心臟、動(dòng)脈(例如，冠狀動(dòng)脈、股動(dòng)脈、主動(dòng)脈、髂動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和脊椎基底動(dòng)脈)和靜脈；泌尿生殖系統(tǒng)的管腔，例如尿道(包括前列腺尿道)、膀胱、輸尿管、陰道、子宮、輸精管和輸卵管；鼻淚管、咽鼓管；呼吸道的管腔，例如氣管、支氣管、鼻道和鼻竇；胃腸道的管腔，例如食管、腸、十二指腸、小腸、大腸、直腸；膽管和胰管系統(tǒng)；淋巴系統(tǒng)的管腔；主要體腔(腹膜、胸膜、心包)等。內(nèi)部醫(yī)療裝置的非限制性具體實(shí)例包括血管裝置，例如血管導(dǎo)管(例如氣囊式導(dǎo)管)，包括氣囊和用于其的充氣管、水解器導(dǎo)管、導(dǎo)絲、撤回套管、過(guò)濾器(例如，腔靜脈過(guò)濾器)、左心室輔助裝置、完全型人工心臟、注射針、藥物遞送管、引流管、胃腸和結(jié)腸鏡管、內(nèi)窺鏡裝置、氣管內(nèi)裝置例如導(dǎo)氣管、用于泌尿道的裝置例如導(dǎo)尿管和輸尿管支架，以及用于神經(jīng)區(qū)域的裝置例如導(dǎo)管和金屬絲、套針、骨錨、骨螺絲、保護(hù)性鍍層、關(guān)節(jié)置換、電引線、生物傳感器、探針、縫合線、手術(shù)單、傷口敷料和繃帶。本發(fā)明的許多裝置具有一個(gè)或多個(gè)圓柱形的部分，包括實(shí)心和中空?qǐng)A柱形兩者。固體基底材料可包括有機(jī)材料(例如，含有50重量％或更多有機(jī)物質(zhì)的材料)，例如聚合物材料，以及無(wú)機(jī)材料(例如，含有50重量％或更多無(wú)機(jī)物質(zhì)的材料)，例如金屬材料(例如，金屬和金屬合金)和非金屬材料(例如，包括碳、半導(dǎo)體、玻璃和陶瓷，其尤其可包含各種金屬氧化物和非金屬氧化物、各種金屬氮化物和非金屬氮化物、各種金屬碳化物和非金屬碳化物、各種金屬硼化物和非金屬硼化物、各種金屬磷酸鹽和非金屬磷酸鹽以及各種金屬硫化物和非金屬硫化物)。非金屬無(wú)機(jī)材料的具體實(shí)例可以是包含以下之中的一種或多種的材料：金屬氧化物，包括鋁的氧化物和過(guò)渡金屬的氧化物(例如，鈦、鋯、鉿、鉭、鉬、鎢、錸和銥的氧化物)；硅；基于硅的陶瓷，例如含有硅氮化物、硅碳化物和硅氧化物的那些(有時(shí)稱為玻璃陶瓷)；磷酸鈣陶瓷(例如，羥基磷灰石)；碳；以及基于碳的陶瓷類材料，例如碳氮化物。另外，可以將所述釋放no的聚葡糖胺摻入洗滌劑中，例如但不限于抗微生物的肥皂中。例如，可以通過(guò)與水接觸和/或使用時(shí)ph的下降觸發(fā)從包埋在條狀肥皂中的官能化聚葡糖胺的no釋放。隨著條狀肥皂的外表面被沖蝕或溶解，條狀肥皂內(nèi)的另外的官能化聚葡糖胺暴露以便條皂的后續(xù)使用。還可以將釋放no的聚葡糖胺懸浮在液體肥皂中。此類肥皂或洗滌劑可用于個(gè)人衛(wèi)生，或者用以提供纖維的抗微生物處理。此類肥皂或洗滌劑也可用于處理家居表面或者可能暴露于微生物例如細(xì)菌、真菌或病毒的醫(yī)院或其他醫(yī)療環(huán)境中的任何表面。術(shù)語(yǔ)“生物相容的”在本文中是指這樣的有機(jī)溶劑，當(dāng)以一定量向患者給藥時(shí)其不誘發(fā)毒性或不希望的副作用。制劑包括其所有藥學(xué)上可接受的鹽形式。此類鹽的實(shí)例包括衍生自藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)和有機(jī)酸和堿的那些。合適的酸式鹽的實(shí)例包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、羥乙酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過(guò)硫酸鹽、羥基萘甲酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。其他酸(例如草酸)盡管本身不是藥學(xué)上可接受的，但也可用于制備可作為中間體用于獲得本發(fā)明的化合物和其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的鹽。衍生自適當(dāng)?shù)膲A的鹽包括但不限于堿金屬(例如鈉、鉀)鹽、堿土金屬(例如鎂和鈣)鹽、銨鹽和n-(烷基)4+鹽。所述官能化的聚葡糖胺還包括其中任何堿性含氮基團(tuán)的季銨化的那些。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，所提供的本文中的討論未涉及立體異構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文所述的聚葡糖胺可以包含一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，因此，可以作為外消旋物和外消旋混合物、單個(gè)的旋光異構(gòu)體、單獨(dú)的非對(duì)映異構(gòu)體以及非對(duì)映異構(gòu)體的混合物存在。這些化合物的所有此類異構(gòu)形式都明確包括在本發(fā)明中。在下面的非限制性實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地解釋。實(shí)施例1.釋放no的殼寡糖的合成殼寡糖通過(guò)殼聚糖多糖的氧化(過(guò)氧化氫)(kim,s.k.；rajapakse,n.enzymaticproductionandbiologicalactivitiesofchitosanoligosaccharides(cos):areview.carbohydr.polym.2005,62,357-368)或酶促降解來(lái)合成。將所得水溶性殼寡糖通過(guò)氮丙啶化合物(包括但不限于氮丙啶和2-甲基氮丙啶)的陽(yáng)離子開(kāi)環(huán)改性以賦予仲胺部分，隨后在堿性條件下與高壓no反應(yīng)(“加載”)，得到水溶性的釋放no的殼寡糖。材料和方法中等分子量的殼聚糖、2-甲基氮丙啶(maz)、異硫氰酸若丹明b(ritc)、聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(平均mn＝480)(peg)、胎牛血清(fbs)、dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem)、吩嗪甲硫酸鹽(pms)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑內(nèi)鹽(mts)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)和青霉素鏈霉素(ps)從aldrichchemicalcompany(milwaukee,wi)購(gòu)得。銅綠假單胞菌(atcc#19143)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(manassas,va)獲得。胰蛋白酶大豆肉湯(tsb)和胰蛋白酶大豆瓊脂(tsa)從becton,dickinson,andcompany(franklinlakes,nj)購(gòu)得。l929小鼠成纖維細(xì)胞(atcc#ccl-1)從universityofnorthcarolinatissueculturefacility(chapelhill,nc)獲得。蒸餾水用milliporemilli-qgradienta-10水純化系統(tǒng)(bedford,ma)進(jìn)行純化。syto9綠色熒光核酸染劑從lifetechnologies(grandisland,ny)購(gòu)得。常用的實(shí)驗(yàn)室鹽和溶劑從fisherscientific(pittsburgh,pa)購(gòu)得。除非另有說(shuō)明，否則所有材料不經(jīng)進(jìn)一步純化按來(lái)樣使用。核磁共振(nmr)光譜在400mhzbruker儀器上記錄。元素(碳、氫和氮或者chn)分析使用perkinelmerelementalanalyzerseries2400儀器(waltham,ma)進(jìn)行。殼寡糖通過(guò)使用過(guò)氧化氫氧化降解來(lái)制備。在65-85℃下，將中等分子量的殼聚糖(2.5g)在攪拌下在過(guò)氧化氫溶液(15重量％或30重量％)中懸浮1小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾移除未溶解的殼聚糖后，通過(guò)向?yàn)V液中加入丙酮使殼寡糖從溶液中沉淀出來(lái)。將沉淀通過(guò)離心收集，用乙醇洗滌兩次，并在室溫下在真空中干燥。殼寡糖的粘度在25℃下使用ubbleohde毛細(xì)管粘度計(jì)在nacl(0.20m)和ch3cooh(0.10m)溶液中測(cè)量。寡糖分子量使用經(jīng)典的mark-houwink公式(即，[η]＝1.81×10-3m0.93)測(cè)定。maghami(1988)。通過(guò)改變過(guò)氧化氫的濃度和降解溫度實(shí)現(xiàn)分子量(mw)的控制。殼寡糖的粘度使用ubbleohde毛細(xì)管粘度計(jì)在氯化鈉(0.20m)和乙酸(0.10m)溶液中測(cè)定。du,j.；hsieh,y.l.nanofibrousmembranesfromaqueouselectrospinningofcarboxymethylchitosan.nanotechnology2008,19,125707。結(jié)合mark-houwink公式(即，[η]＝1.81×10-3m0.93)，隨著處理?xiàng)l件的改變測(cè)定分子量。總的來(lái)說(shuō)，較大的過(guò)氧化氫濃度和升高的降解溫度產(chǎn)生較低分子量的殼聚糖。如表1中所示，在15重量％過(guò)氧化氫下在65℃下歷經(jīng)1小時(shí)制備約10kd分子量的殼寡糖。將降解溫度升高到85℃產(chǎn)生顯著更小的大小(mw約為5kd)。表1。表1不同分子量的殼寡糖的降解條件和元素分析。a通過(guò)經(jīng)典的mark-houwink公式(即，[η]＝1.81×10-3m0.93)測(cè)定的粘度平均分子量。當(dāng)采用較大的過(guò)氧化氫濃度(即，30重量％)和升高的溫度(即，85℃)時(shí)，殼寡糖的分子量進(jìn)一步降低(約2.5kd)。如表2中所示，寡糖的chn元素分析表明6.3重量％的總氮含量。表2殼寡糖和仲胺官能化的衍生物的元素(chn)分析。a接枝2-甲基氮丙啶之前的殼寡糖。每個(gè)參數(shù)用平行測(cè)定進(jìn)行分析(n＝3)。將2-甲基氮丙啶(maz)以不同進(jìn)料比(即，2:1和1:1)接枝到殼寡糖上，以改變仲胺官能化和no儲(chǔ)存。將2-甲基氮丙啶對(duì)伯胺的進(jìn)料比從1:1(cso1；殼聚糖1-5k)增加到2:1(cso2；殼聚糖2-5k)獲得更大的no儲(chǔ)存(例如，相應(yīng)為約0.30μmol/mg到0.87μmol/mg)。如圖5a和5b中所示，殼聚糖1/no-5k的no通量和儲(chǔ)存均低于殼聚糖2/no-5k，這一結(jié)果可能是由于殼聚糖1-5k的胺濃度(約8.9重量％)與殼聚糖2-5k(約10.8重量％)相比較小。方案a和b描繪了用于制備本文所述的釋放no的殼寡糖的途徑。ab在路線a中，cso1(x＝1)；cso2(x＝2)；cso1-no(x＝1)；cso2-no(x＝2)。在路線b中，cso3(x＝2)；cso3-no(x＝2)。上文的路線a是用于制備仲胺官能化的殼寡糖衍生物和二醇二氮烯鎓官能化的殼寡糖衍生物的合成路徑，其涉及將2-甲基氮丙啶接枝到殼寡糖的伯胺上(cso1、2)和所得物質(zhì)的二醇二氮烯鎓化(cso1、2-no)。上文的路線b是用于制備仲胺官能化的殼寡糖衍生物和二醇二氮烯鎓官能化的殼寡糖衍生物的合成路徑，其涉及2-甲基氮丙啶接枝的殼寡糖的peg化(cso3)和所得物質(zhì)的二醇二氮烯鎓化(cso3-no)。路線a’和b’描繪了本文所公開(kāi)的殼寡糖的合成途徑：路線a’路線b’仲胺官能化的殼寡糖(殼聚糖1、殼聚糖2和殼聚糖3)與no(在堿性條件下，10atm)的反應(yīng)產(chǎn)生n-二醇二氮烯鎓no供體官能化的殼寡糖(殼聚糖1/no、殼聚糖2/no和殼聚糖3/no)。no綴合(“加載”)溶劑影響加載效率并潛在地影響總no儲(chǔ)存。carpenter,a.w.；slomberg,d.l.；rao,k.s.；schoenfisch,m.h.,influenceofscaffoldsizeonbactericidalactivityofnitricoxide-releasingsilicananoparticles.acsnano2012,5,7235-7244。水溶液是必要的，以便充分溶解殼寡糖。為研究水濃度對(duì)n-二醇二氮烯鎓轉(zhuǎn)化效率的影響，制備甲醇(常見(jiàn)的加載溶劑)(carpenter(2012)；stasko,n.a.；schoenfisch,m.h.dendrimersasascaffoldfornitricoxiderelease.j.am.chem.soc.2006,128,8265-8271)和水的混合物(10:0、9:1、8:2、7:3和6:4v/v)，并通過(guò)加入甲醇鈉將ph調(diào)整到高于10。路線c描繪了用于制備如本文所述的亞硝基硫醇no釋放性殼寡糖的途徑。路線c路線d描繪了二醇二氮烯鎓的綴合和從綴合的二醇二氮烯鎓釋放2no。路線d仲胺官能化的殼寡糖：遵循先前報(bào)道的方法合成了2-甲基氮丙啶(maz)接枝的殼寡糖。wong,k.；sun,g.b.；zhang,x.q.；dai,h.；liu,y.；he,c.b.；leong,k.w.pei-g-chitosan,anovelgenedeliverysystemwithtransfectionefficiencycomparabletopolyethylenimineinvitroandafterliveradministrationinvivo.bioconj.chem.2006,17,152-158。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將濃hcl(11μl)、水(100μl)和maz的混合物以與殼寡糖上的伯胺1:1(cso1；殼聚糖1)或2:1(cso2；殼聚糖2)的摩爾比逐滴加入殼寡糖(100mg)在去離子水(5ml)中的溶液中。將所得溶液在室溫下攪拌5天，然后在75℃下攪拌24小時(shí)。將產(chǎn)物通過(guò)滲析純化，并通過(guò)凍干收集。將產(chǎn)物中的任何高分子量的聚(2-甲基氮丙啶)通過(guò)用甲醇洗滌移除，并將所得材料在室溫下在真空中干燥。然后，將殼聚糖2在水中在ph10.0下溶解。將殼寡糖上的伯胺通過(guò)加入聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯官能化，以產(chǎn)生殼聚糖3。將所得peg官能化的殼寡糖衍生物通過(guò)滲析純化，并通過(guò)凍干收集。殼聚糖1和殼聚糖2的1hnmr數(shù)據(jù)(400mhz,cd3od,δ)：0.8-1.1(nh2ch(ch3)ch2nh),1.9(c7:chnhcoch3),2.3-2.7(nh2ch(ch3)ch2nhch,c2:nh2ch(ch3)ch2nhch),3.3-4.0(c3,c4,c5,c6:ohch,ochch(oh)ch(nh2)ch,ohch2ch,ohch2ch),4.4(c1:och(chnh2)o)。殼聚糖3的1hnmr數(shù)據(jù)(400mhz,cd3od,δ)：0.8-1.1(nh2ch(ch3)ch2nh),1.9(c7:chnhcoch3),2.3-2.7(nh2ch(ch3)ch2nhch,c2:nh2ch(ch3)ch2nhch),3.2(och2ch2och3),3.3-4.0(och2ch2o和c3,c4,c5,c6:ohch,ochch(oh)ch(nh2)ch,ohch2ch,ohch2ch),4.4(c1:och(chnh2)o)。n-二醇二氮烯鎓官能化的殼寡糖：將仲胺官能化的殼寡糖(cso1、殼聚糖1、cso2、殼聚糖2、殼聚糖3和cso3)和5.4mm甲醇鈉(75μl)加入不同v/v比(例如，10:0、9:1、8:2、7:3、6:4)的甲醇/水混合物(2ml)中。將懸浮液加入位于parr氫化容器中的小瓶中，將其用氬氣迅速吹掃三次(5-10s)，隨后進(jìn)行三個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的氬氣吹掃循環(huán)(10min)，以從溶液中移除殘留的氧氣。然后，用經(jīng)koh顆粒純化(以移除no降解產(chǎn)物)的no氣體將parr氫化容器加壓到10atm，并在10atm下維持3天。進(jìn)行相同的氬氣吹掃方案，以從溶液中移除未反應(yīng)的no和降解產(chǎn)物，隨后將小瓶從容器中取出。熒光標(biāo)記的殼寡糖：這些殼寡糖是遵循先前報(bào)道的方法制備的。tokura,s.；ueno,k.；miyazaki,s.；nishi,n.,molecularweightdependentantimicrobialactivitybychitosan.macromol.symp.1997,120,1-9。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將殼寡糖(50mg)在水(2ml)中在ph9.0下溶解。將異硫氰酸若丹明b(ritc)以與殼寡糖上的伯胺1:100的摩爾比加入溶液中，然后接枝2-甲基氮丙啶。將溶液在室溫下在黑暗中攪拌3天。隨后的滲析和凍干獲得ritc標(biāo)記的殼寡糖。通過(guò)調(diào)節(jié)maz和伯胺的比率(例如，1:1cso1和殼聚糖1，2:1cso2和殼聚糖2)，可調(diào)節(jié)接枝到殼寡糖上的maz重復(fù)單元的數(shù)目(支持nmr數(shù)據(jù))，從而產(chǎn)生一系列仲胺濃度和no儲(chǔ)存。將丙烯酸酯官能化的peg鏈通過(guò)michael加成反應(yīng)綴合到cso2和殼聚糖2上的伯胺，以獲得peg改性的骨架(例如，cso3和殼聚糖3，參見(jiàn)方案b和b’)。對(duì)于cso1和殼聚糖1以及cso2和殼聚糖2，將2-甲基氮丙啶接枝到寡糖將相應(yīng)的氮含量分別從6.3重量％增加到8.9重量％和10.8重量％。cso2和殼聚糖2的peg化導(dǎo)致氮含量的相應(yīng)降低(3.1重量％)(cso3和殼聚糖3)。2.官能化的聚葡糖胺中的一氧化氮加載、儲(chǔ)存和釋放本文所公開(kāi)的主題描述了仲胺官能化的殼寡糖(例如，cso1、2、3)的加載條件的優(yōu)化。使用甲醇和水的混合物作為加載溶劑。圖4示出了在不同溶劑中加載的cso2-no的no釋放曲線。當(dāng)使用7:3的甲醇/水時(shí)，獲得最大總no儲(chǔ)存(例如，約0.87μmol/mg)。表3.仲胺官能化的殼寡糖(cso2；殼聚糖2/no-5k)在pbs(ph＝7.4)中在37℃下的一氧化氮釋放特性。本文所公開(kāi)的主題描述了通過(guò)調(diào)節(jié)氮丙啶化合物與殼寡糖上的伯胺的比率來(lái)控制總no儲(chǔ)存。通過(guò)增加氮丙啶化合物的使用，可以實(shí)現(xiàn)更大的仲胺含量且因此實(shí)現(xiàn)更大的總no儲(chǔ)存。例如，如圖5a和5b以及表4a和4b中所示，用2:1的2-甲基氮丙啶/伯胺比率的合成獲得約0.87μmol/mg的總儲(chǔ)存，而比率1:1獲得0.30μmol/mg的no儲(chǔ)存。因此，氮丙啶化合物使用的進(jìn)一步增加可能會(huì)獲得更加提高的no儲(chǔ)存。最大no儲(chǔ)存(使用7:3的甲醇/水加載溶劑比率)為0.87μmol/mg，其為先前報(bào)道的殼聚糖多糖(約0.2μmol/mg)的大約4倍。du,j.；hsieh,y.l.nanofibrousmembranesfromaqueouselectrospinningofcarboxymethylchitosan.nanotechnology2008,19,125707；kim,s.k.；rajapakse,n.enzymaticproductionandbiologicalactivitiesofchitosanoligosaccharides(cos):areview.carbohydr.polym.2005,62,357-368；maghami(1988)。本文所公開(kāi)的主題描述了通過(guò)將仲胺官能化的殼寡糖(cso1、2)的胺部分官能化來(lái)控制no釋放動(dòng)力學(xué)。如圖5a和5b以及表4a和4b中所示，用親水性peg改性的殼寡糖(cso3-no)與peg官能化之前的相應(yīng)物(cso2-no)相比表現(xiàn)出更大的初始no通量和更短的半衰期。表4a。n-二醇二氮烯鎓no供體官能化的殼寡糖的一氧化氮釋放性質(zhì)。相應(yīng)地，寡糖單元將以反映在no釋放性質(zhì)中的摩爾比存在。在實(shí)施方案中，m為約0.4-約0.9，例如約0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9；n為約0.1-約0.6，例如約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6；其中m和n表示每個(gè)單元的摩爾分?jǐn)?shù)，并且m與n的和是1。表4b。使用化學(xué)發(fā)光no分析儀測(cè)量的不同的n-二醇二氮烯鎓no供體官能化的殼寡糖在pbs(ph＝7.4，37℃)中的一氧化氮釋放性質(zhì)。每毫克仲胺官能化的ppi經(jīng)24小時(shí)和4小時(shí)a釋放的總no以及b釋放的no(μmol)。每個(gè)參數(shù)用多個(gè)平行測(cè)定進(jìn)行分析(n＝3)。將在水/甲醇混合物中的n-二醇二氮烯鎓官能化的殼寡糖(1mg)(cso1-no、殼聚糖1/no、cso2-no、殼聚糖2/no、cso3-no、殼聚糖3/no)在37℃下加入含有30ml的脫氧的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)(10mm，ph＝7.4)的樣品容器中，這引起no的釋放。為定量釋放的no，將溶液用氮?dú)庖?0ml/min的流速吹掃，以將放出的no攜帶到分析儀。向容器供應(yīng)額外的氮?dú)饬鳎云ヅ鋬x器的收集速率(200ml/min)。當(dāng)no釋放水平下降到低于10ppbno/mg殼寡糖時(shí)，終止no的分析。釋放no的殼寡糖的化學(xué)發(fā)光數(shù)據(jù)表示為：1)no釋放的總量(t[no]，μmolno/mg仲胺官能化的殼寡糖)；2)no釋放的最大通量([no]max，ppb/mg仲胺官能化的殼寡糖)；以及3)no釋放的半衰期(t1/2)。3.小鼠成纖維細(xì)胞活力測(cè)定將l929小鼠成纖維細(xì)胞在補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(fbs)和1重量％青霉素/鏈霉素的dmem中生長(zhǎng)，并在5％(v/v)co2中在加濕條件下在37℃下孵育。達(dá)到80％匯合后，將細(xì)胞胰蛋白酶化，以3×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到組織培養(yǎng)物處理的聚苯乙烯96孔板上，并在37℃下孵育48小時(shí)。然后，將上清液吸出，隨后向每個(gè)孔中加入200μl新鮮的dmem和50μl釋放no的殼寡糖在pbs中的溶液。在37℃下孵育24小時(shí)后，將上清液吸出，并向每個(gè)孔中加入120μldmem/mts/pms混合物(105/20/1，v/v/v)。使用thermoscientificmultiskanex酶標(biāo)儀，在490nm下定量在37℃下孵育1.5小時(shí)后所得有色溶液的吸光度。分別使用dmem/mts/pms的混合物和未處理的細(xì)胞作為空白和對(duì)照。通過(guò)公式1計(jì)算細(xì)胞活力。4.通過(guò)將小鼠成纖維細(xì)胞暴露于在上述對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的mbc下的寡糖比較了對(duì)照和釋放no的殼寡糖的細(xì)胞毒性。孵育24小時(shí)后對(duì)照和釋放no的殼寡糖的標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞活力結(jié)果在圖8a和8b中示出。無(wú)論大小(即，分子量)，對(duì)照和釋放no的殼寡糖在釋放no的骨架的mbc下對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞無(wú)毒性，從而表明這些物質(zhì)與其他抗細(xì)菌劑相比作為抗生物膜劑的優(yōu)勢(shì)。與殼聚糖對(duì)照相比，釋放no的殼寡糖表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性。5.在靜態(tài)條件下的殺菌測(cè)定將銅綠假單胞菌的細(xì)菌培養(yǎng)物從冷凍(-80℃)的原液在tsb中在37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。將所得懸浮液的500μl等分試樣加入50ml新鮮tsb中，并在37℃下孵育約2小時(shí)，直到濃度達(dá)到約1×108個(gè)菌落形成單位(cfu)/ml，這通過(guò)od600、平行鋪板和在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上計(jì)數(shù)證實(shí)。通過(guò)將細(xì)菌懸浮液鋪板在tsa上并在37℃下孵育過(guò)夜產(chǎn)生工作細(xì)菌原液。每周制備tsa的細(xì)菌原液并儲(chǔ)存在4℃下。對(duì)于殺菌測(cè)定，將銅綠假單胞菌的菌落從tsa板取出，分散在3mltsb中，并在37℃下孵育過(guò)夜。將500μl培養(yǎng)物的等分試樣加入50ml新鮮tsb中，并孵育到約1×108cfu/ml的濃度。將細(xì)菌通過(guò)離心收集，再懸浮于pbs中，并稀釋到約1×106cfu/ml。通過(guò)將細(xì)菌懸浮液用釋放no的殼寡糖在37℃下孵育評(píng)價(jià)釋放no的殼寡糖對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌功效。在4小時(shí)時(shí)，取出100μl細(xì)菌懸浮液的等分試樣，在pbs中稀釋10倍，鋪板在tsa上，并在37℃下孵育過(guò)夜。導(dǎo)致細(xì)菌活力的3-log降低的釋放no的殼寡糖的最小濃度定義為用于浮游生物研究的最小殺菌濃度(mbc)。在靜態(tài)條件下進(jìn)行細(xì)菌活力測(cè)定，以測(cè)定將細(xì)菌活力降低3log(即，99.9％殺死)所需要的殼聚糖的濃度，下文中將其稱為最小殺菌濃度或mbc。還研究了在測(cè)定時(shí)間內(nèi)(4小時(shí))從釋放no的殼寡糖遞送的no的量(表4)，以定量評(píng)價(jià)實(shí)現(xiàn)99.9％細(xì)菌殺死所需要的no劑量。殼寡糖所需要的mbc和殺菌no劑量在表5中提供。表5.對(duì)于浮游生物銅綠假單胞菌活力的3-log降低，釋放no的殼寡糖的最小殺菌濃度(mbc)和no劑量。殼聚糖mbc(μg/ml)no劑量(μmol/ml)殼聚糖1/no-5k20000.32殼聚糖2/no-5k2000.10殼聚糖3/no-5k15000.45殼聚糖2/no-2.5k2500.12無(wú)論大小(即，分子量約為2.5kda、5kda或10kda)，對(duì)于3-log殺死，每種釋放no的殼寡糖(殼聚糖2/no-2.5k、殼聚糖2/no-5k、殼聚糖2/no-10k)表現(xiàn)出類似的殺菌no濃度(即，約10μmolno/ml)(表5)。所研究的每種釋放no的殼寡糖(包括cso2-no-5k)均導(dǎo)致銅綠假單胞菌的≥99.9％殺死。在等效濃度下，對(duì)照(不釋放no的)殼聚糖未導(dǎo)致細(xì)菌活力的顯著降低，從而表明no作為殺菌劑(數(shù)據(jù)未顯示)。6.用釋放no的殼寡糖處理銅綠假單胞菌生物膜使用cdc生物反應(yīng)器(biosurfacetechnologies,bozeman,mt)在48小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)銅綠假單胞菌生物膜。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在組裝反應(yīng)器之前，將醫(yī)用級(jí)硅橡膠基材安裝在試樣架中。然后，將組裝的反應(yīng)器高壓滅菌。將反應(yīng)器流出物管線夾緊，并在無(wú)菌條件下加入1％(v/v)無(wú)菌tsb(500ml)。然后，將銅綠假單胞菌在tsb中培養(yǎng)到108cfu/ml。將反應(yīng)器以約2×105cfu/ml的最終濃度接種該細(xì)菌懸浮液的等分試樣(1ml)。將反應(yīng)器在37℃下在緩慢攪拌(150rpm)下孵育24小時(shí)。在該“分批階段(batchphase)”生長(zhǎng)后，將反應(yīng)器培養(yǎng)基通過(guò)流出物管線用0.33％(v/v)tsb在6ml/min下連續(xù)補(bǔ)充另外24小時(shí)。將生長(zhǎng)在硅橡膠基材上的銅綠假單胞菌生物膜在輕微攪拌下暴露于在pbs中的殼寡糖(37℃，24小時(shí))，以測(cè)定引發(fā)活力的5-log降低所需要的最小殺菌濃度(mbc)。然后，在24小時(shí)時(shí)，將樣品超聲處理并渦旋以破壞生物膜。將細(xì)菌/殼聚糖懸浮液的等分試樣(100μl)稀釋，并鋪板在tsa上。將tsa板在37℃下孵育過(guò)夜后，通過(guò)計(jì)數(shù)觀察到的菌落測(cè)定細(xì)菌活力。值得注意的是，對(duì)于該所選的板計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)限為2.5×103cfu/ml。因此，對(duì)生物膜的生長(zhǎng)條件進(jìn)行選擇以精確地表示生物膜活力的5-log降低。為評(píng)估釋放no的殼寡糖(例如，殼聚糖1/no-5k、殼聚糖2/no-5k、殼聚糖3/no-5k)的抗生物膜活性，將銅綠假單胞菌生物膜暴露于0.2-1.3mg/ml釋放no的殼寡糖24小時(shí)(對(duì)應(yīng)于約0.17-0.46μmolno/ml)。處理后，將生物膜通過(guò)渦旋和超聲處理從硅橡膠基材移除，以實(shí)現(xiàn)活力的定量。salmon,d.j.；torresdeholding,c.l.；thomas,l.；peterson,k.v.；goodman,g.p.；saavedra,j.e.；srinivasan,a.；davies,k.m.；keefer,l.k.；miranda,k.m.hnoandnoreleasefromaprimaryamine-baseddiazeniumdiolateasafunctionofph.inorg.chem.50,3262-70。進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)使用所選方案的銅綠假單胞菌生物膜的生長(zhǎng)。如圖7中所示，當(dāng)僅暴露于pbs時(shí)，生物膜中的銅綠假單胞菌的活力為約2×108cfu。對(duì)于殼聚糖2/no-5k、殼聚糖1/no-5k和殼聚糖3/no-5k，實(shí)現(xiàn)生物膜細(xì)菌活力的5-log降低的殼聚糖濃度(mbc)分別為400、700和1000μg/ml。殼聚糖2/no-5k表現(xiàn)出最大的抗生物膜功效，該有希望的結(jié)果是由于增加的no儲(chǔ)存/釋放以及與帶負(fù)電荷的細(xì)菌的快速締合。盡管殼聚糖1/no-5k和殼聚糖3/no-5k儲(chǔ)存類似水平的no(約0.3μmol/mg)，但與殼聚糖3/no-5k(mbc1000μg/ml)相比，殼聚糖1/no-5k在消除生物膜細(xì)菌方面更有效(mbc700μg/ml)。使用共聚焦顯微鏡評(píng)價(jià)了殼聚糖2/no-5k和殼聚糖3/no-5k與銅綠假單胞菌生物膜的締合。如圖9a-f中所示，暴露于殼聚糖2/no-5k的生物膜與暴露于殼聚糖3/no-5k的生物膜相比表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的紅色熒光，再次證實(shí)帶正電荷的殼聚糖2/no-5k與細(xì)菌的增強(qiáng)的締合。7.共聚焦顯微鏡將銅綠假單胞菌在tsb中培養(yǎng)到濃度為約1×108cfu/ml，通過(guò)離心(3645×g，10分鐘)收集，再懸浮于無(wú)菌pbs中，并調(diào)整到約1×106cfu/ml。將細(xì)菌溶液的等分試樣在37℃下在玻璃底共聚焦皿中孵育1.5小時(shí)。使用具有543nmhene激發(fā)激光器和lp585nm過(guò)濾器的zeiss510meta倒置激光掃描共聚焦顯微鏡，以獲得異硫氰酸若丹明b(ritc)改性的殼寡糖的熒光圖像。明視野和熒光圖像由具有40倍物鏡的n.a.1.2c-復(fù)消色差水浸透鏡收集。將ritc標(biāo)記的釋放no的殼寡糖在pbs中的溶液(1.5ml)加入在玻璃共聚焦皿中的細(xì)菌溶液(1.5ml)中，以達(dá)到150μg/ml的最終濃度。每2分鐘收集圖像，以表征殼寡糖與銅綠假單胞菌隨時(shí)間的締合(如果存在)。為觀察殼寡糖與生物膜內(nèi)的細(xì)菌的締合，將用syto9(10μm)染色的形成的生物膜與ritc標(biāo)記的殼寡糖(150μg/ml，在pbs中)一起孵育2.5小時(shí)。在成像之前，將樣品用pbs沖洗(3×)。使用分別具有488nmar和543nmhene激發(fā)激光器以及bp505-530nm和lp585nm過(guò)濾器的zeiss510meta倒置激光掃描共聚焦顯微鏡來(lái)獲得所有的共聚焦圖像。熒光圖像用20倍物鏡收集。使用共聚焦顯微鏡來(lái)比較殼聚糖3/no-5k和殼聚糖2/no-5k與細(xì)菌的締合動(dòng)力學(xué)。合成了異硫氰酸若丹明b(ritc)標(biāo)記的殼聚糖2/no-5k和殼聚糖3/no-5k。maghami(1988)。ritc對(duì)殼聚糖-細(xì)菌締合的潛在影響通過(guò)使用低濃度的ritc(即，以與總伯胺1:100的摩爾比)最小化。然后，通過(guò)測(cè)量細(xì)菌周圍的紅色熒光密切觀察釋放no的殼寡糖與細(xì)菌的締合程度。與殼聚糖3/no-5k(86分鐘)相比，殼聚糖2/no-5k與細(xì)菌的締合更迅速(在24分鐘內(nèi))(圖10)。在42分鐘時(shí)殼聚糖2/no-5k的熒光顯著強(qiáng)于在110分鐘時(shí)殼聚糖3/no-5k的熒光，這進(jìn)一步證明殼聚糖3/no-5k與細(xì)菌的締合由于peg(中性)改性而速率大為減慢。殼聚糖2/no-5k和殼聚糖3/no-5k與銅綠假單胞菌的締合的進(jìn)一步檢查顯示，殼聚糖2/no-5k的細(xì)菌締合增強(qiáng)(圖10-g、h)。盡管未觀察到殼聚糖的分子量在殺滅浮游生物中發(fā)揮顯著作用，但當(dāng)使用殼聚糖2/no-10k對(duì)抗生物膜時(shí)，觀察到較低效力的殺菌作用，所述殼聚糖2/no-10k是最大的殼寡糖(對(duì)于殼聚糖2/no-10k和殼聚糖2/no-2.5k，600μg/mlvs.400μg/ml)。鑒于先前報(bào)道的在生理?xiàng)l件下不可溶的釋放no的多糖，殼寡糖與生物膜中的細(xì)菌的有效締合是有利的。在本申請(qǐng)?zhí)峒暗奈墨I(xiàn)中提及或參考的所有文獻(xiàn)，以及本文提及或參考的所有文獻(xiàn)(“本文提及的文獻(xiàn)”)，以及在本文提及的文獻(xiàn)中提及或參考的所有文獻(xiàn)，連同本文提到或本文通過(guò)援引加入的任何文獻(xiàn)中提到的任何產(chǎn)品的任何制造商說(shuō)明書(shū)、描述、產(chǎn)品規(guī)格說(shuō)明和產(chǎn)品書(shū)頁(yè)在此通過(guò)援引加入本文中，并且可以在本發(fā)明的實(shí)踐中采用。盡管已經(jīng)在本發(fā)明的詳細(xì)優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是，由上述段落限定的本發(fā)明不應(yīng)限于上文描述中所述的特定細(xì)節(jié)，因?yàn)槠湓S多顯而易見(jiàn)的變化在不偏離本發(fā)明的精神或范圍下是可能的。當(dāng)前第1頁(yè)12