本發(fā)明提供一種添加胡蘿卜汁誘導(dǎo)雨生紅球藻高效積累蝦青素的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
天然蝦青素（3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素，C40H52O4）是一種具有極強(qiáng)著色和抗氧化作用的紅色類胡蘿卜素，它在醫(yī)藥、化妝品、食品及養(yǎng)殖工業(yè)中有廣泛應(yīng)用（Guerin M et al, 2003）。與其它類胡蘿卜素一樣，它有一個(gè)很長(zhǎng)的共軛雙鍵，但該雙鍵末端還含有不飽和的α-羥基酮，這種結(jié)構(gòu)使得蝦青素比普通類胡蘿卜素具有一些特殊的生理功能（Kamath et al, 2008）。主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先，具有超強(qiáng)的抗氧化活性。有研究顯示蝦青素抗氧化活性顯著高于β-胡蘿卜素（10倍以上）、玉米黃素、角黃質(zhì)、維生素C和維生素E（550倍）等常見(jiàn)抗氧化物質(zhì)；其次，大量研究表明，蝦青素能大幅提高人和動(dòng)物的免疫力，還能防治癌癥，有被開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤藥物的潛能（Hussein et al, 2005）。對(duì)天然蝦青素生物學(xué)功能和藥理藥效研究表明它是安全健康的天然色素，在日本、美國(guó)、歐盟、加拿大已被批準(zhǔn)為安全的人類食品添加劑，用于食品的著色、保鮮、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充及用作珍貴魚類和甲殼類動(dòng)物和家禽的飼料添加劑（Hussein et al, 2006）。
雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）在多種脅迫條件下，如強(qiáng)光、高溫、營(yíng)養(yǎng)鹽（氮、磷）饑餓、高鹽等，能夠迅速合成并大量積累蝦青素，其積累量最高可達(dá)藻細(xì)胞干重的4.0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于從水產(chǎn)品廢棄物（蝦蟹等甲殼）提取和利用紅發(fā)夫酵母（Phaffia rhodoxyma）發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的產(chǎn)量（0.15%—0.4%），因此被公認(rèn)是目前自然界中生產(chǎn)天然蝦青素最理想的工具（Boussiba, 2000）。
過(guò)去關(guān)于刺激雨生紅球藻積累蝦青素的誘導(dǎo)因子研究大多集中在物理因子和化學(xué)因子。添加含有蝦青素前體的天然生物質(zhì)誘導(dǎo)雨生紅球藻高效合成蝦青素的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道，同上述誘導(dǎo)因子相比較，含有蝦青素前體的天然生物質(zhì)具有制備簡(jiǎn)單、效益高、無(wú)毒無(wú)激素類物質(zhì)殘留等優(yōu)勢(shì)。胡蘿卜（Daucus carrot），又稱甘荀，是傘形科胡蘿卜，屬二年生草本植物，以肉質(zhì)根作蔬菜食用。胡蘿卜中含有大量由4個(gè)異戊二烯雙鍵首尾相連而成的β-胡蘿卜素（C40H56），屬四萜類化合物，在分子的兩端各有1 個(gè)β-紫蘿酮環(huán)，中心斷裂可產(chǎn)生2個(gè)維生素A 分子，有多個(gè)雙鍵且雙鍵之間共軛。它是自然界中最普遍存在也是最穩(wěn)定的天然色素，也是形成天然蝦青素的前體物質(zhì)。這個(gè)過(guò)程可由兩條路徑產(chǎn)生：一條是β-胡蘿卜素經(jīng)羥基化反應(yīng)在 C-3，3'位形成β-隱黃質(zhì)和玉米黃素兩種中間產(chǎn)物，C-4再氧化形成3-二羥基-2-酮-β-胡蘿卜素，進(jìn)一步氧化形成蝦青素；另一條路徑是β-胡蘿卜素在 C-4,4'位經(jīng)過(guò)氧化反應(yīng)生成海膽酮和角黃質(zhì)，以兩種物質(zhì)為中間產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)羥基化，形成4-二酮-3-羥基-β-胡蘿卜素，進(jìn)一步在C-3羥基化位形成蝦青素（Margalith et al, 1999）。
目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有一些生產(chǎn)蝦青素的相關(guān)專利技術(shù)，如寧波大學(xué)的“大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝置及其方法”（200610154678.0）公開(kāi)了一種大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝置及方法，整個(gè)培養(yǎng)裝置由設(shè)置在固定架上的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)、充氣裝置、培養(yǎng)液灌輸裝置和靜細(xì)胞收集裝置組成，固定架上設(shè)置浮沉控制裝置。中山大學(xué)的“光生物反應(yīng)器促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)增殖及調(diào)控蝦青素合成和積累的方法”（CN02134387.X），涉及幾種可調(diào)控的全天候封閉式大規(guī)模運(yùn)行系統(tǒng)光生物反應(yīng)器培養(yǎng)和促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)增殖及提高種群密度、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物蝦青素合成和積累的方法。“從甲殼質(zhì)、殼聚糖生產(chǎn)廢水中回收蝦青素和蛋白質(zhì)的方法”（CN200510047267.7），主要是從甲殼質(zhì)、殼聚糖生產(chǎn)廢水中回收蝦青素，雖然能變廢為寶，但是蝦青素的提取效率較低?！爱a(chǎn)蝦青素的藻類和酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法”（CN03105314.9），公開(kāi)了一種產(chǎn)蝦青素的藻類和酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法是在裝有特定培養(yǎng)基的反應(yīng)器內(nèi)，同時(shí)接種包括雨生紅球藻和包括紅發(fā)夫酵母進(jìn)行混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素。“一種培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法（CN02138827.X）公開(kāi)了一種培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，包括培養(yǎng)基配方、一步法生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)基的循環(huán)使用和用二氧化碳調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值誘導(dǎo)紅球藻孢子的形成及蝦青素積累的方法。DSMIP資產(chǎn)公司研究的“利用補(bǔ)料分批發(fā)酵法通過(guò)Phaffia rhodozyma制備蝦青素”（CN1692159），在蝦青素生產(chǎn)期，根據(jù)蝦青素生產(chǎn)速率補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，同時(shí)在整個(gè)發(fā)酵期中保持發(fā)酵培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度為接近0g/L。上述相關(guān)專利技術(shù)雖然先進(jìn)，但均涉及造價(jià)高昂的生物反應(yīng)器等專業(yè)設(shè)施、對(duì)設(shè)備要求比較高、技術(shù)工藝比較復(fù)雜、操作繁瑣、而且費(fèi)用很高、產(chǎn)量沒(méi)有保障、這無(wú)疑增加了生產(chǎn)成本和技術(shù)推廣的難度。但它們均未涉及利用造價(jià)低廉，來(lái)源廣泛的含蝦青素前體物的天然物質(zhì)誘導(dǎo)雨生紅球藻高效積累蝦青素的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，技術(shù)工藝簡(jiǎn)單易行、廉價(jià)高效且能顯著提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的產(chǎn)量。利用添加純天然的胡蘿卜汁誘導(dǎo)雨生紅球藻高效積累蝦青素的方法，其具體的技術(shù)方案為：
添加胡蘿卜汁誘導(dǎo)雨生紅球藻高效積累蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟：
（1）制備藻液：培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；
（2）積累蝦青素：積累蝦青素：先將胡蘿卜洗凈、表面消毒，在無(wú)菌環(huán)境下去皮，加等質(zhì)量無(wú)菌水勻漿，用四層滅菌紗布除去碎渣，10000r/min 離心10min，取上清制成待用胡蘿卜汁母液。將該母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至胡蘿卜汁最終含量為0.025±0.005L/L藻液；然后將上述添加了胡蘿卜汁的藻液與空白對(duì)照組藻液同時(shí)在28±2℃、光強(qiáng)4800±200lx、光暗比為24h /0h及營(yíng)養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下培養(yǎng)18±1d。
所述的添加胡蘿卜汁誘導(dǎo)雨生紅球藻高效積累蝦青素的方法，步驟（1）中，采用BBM培養(yǎng)基（華汝成 1986），在溫度20±2℃，光強(qiáng)1800±200lx，光暗比為12h /12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至培雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞濃度達(dá)2.85×105個(gè)/mL。
所述的添加胡蘿卜汁誘導(dǎo)雨生紅球藻高效積累蝦青素的方法，胡蘿卜汁來(lái)自于市場(chǎng)上銷售的普通胡蘿卜。
本發(fā)明是一種較為理想的提高雨生紅球藻中蝦青素產(chǎn)量的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明的原材料雨生紅球藻細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室可以按常規(guī)方法自行培養(yǎng)，采用“添加胡蘿卜汁誘導(dǎo)與復(fù)合脅迫培養(yǎng)”相結(jié)合的方法，胡蘿卜來(lái)源廣泛且造價(jià)低廉，該工藝不僅簡(jiǎn)單易行，成本低廉，無(wú)毒無(wú)殘留，而且能大幅提高雨生紅球藻積累蝦青素的產(chǎn)量，從而顯著提高生產(chǎn)效率。結(jié)果表明添加0.025±0.005L/L藻液的胡蘿卜汁處理組雨生紅球藻細(xì)胞蝦青素產(chǎn)量為3.42（±0.62）mg/L，是空白對(duì)照組產(chǎn)量的1.66~2.44倍。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例 1：
步驟1、制備藻液：采用BBM培養(yǎng)基（華汝成，1986），在溫度19℃、1800lx光強(qiáng)、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度達(dá)2.85×105個(gè)/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；
步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素：先將胡蘿卜洗凈、表面消毒，在無(wú)菌環(huán)境下去皮，加等質(zhì)量無(wú)菌水勻漿，用四層滅菌紗布除去碎渣，10000r/min 離心10min，取上清制成待用胡蘿卜母液。將胡蘿卜汁母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至胡蘿卜汁最終含量為0.025L/L；然后將上述添加了胡蘿卜汁的藻液與空白對(duì)照組藻液同時(shí)在28℃、光強(qiáng)4800lx、光暗比為24h /0h及營(yíng)養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下培養(yǎng)18d。
實(shí)施例 2：
步驟1、制備藻液：采用BBM培養(yǎng)基（華汝成，1986），在溫度20℃、光強(qiáng)1900lx、光暗比為12h /12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度達(dá)2.85×105個(gè)/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；
步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素：先將胡蘿卜洗凈、表面消毒，在無(wú)菌環(huán)境下去皮，加等質(zhì)量無(wú)菌水勻漿，用四層滅菌紗布除去碎渣，10000r/min 離心10min，取上清制成待用胡蘿卜母液。將胡蘿卜汁母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至胡蘿卜汁最終含量為0.028L/L；然后將上述添加了胡蘿卜汁的藻液與空白對(duì)照組藻液同時(shí)在29℃、光強(qiáng)5000lx、光暗比為24h /0h及營(yíng)養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下培養(yǎng)18d。
實(shí)施例 3：
步驟1、制備藻液：采用BBM培養(yǎng)基（華汝成，1986），在溫度22℃、光強(qiáng)2000lx、光暗比為12h /12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度達(dá)2.85×105個(gè)/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；
步驟2、先將胡蘿卜洗凈、表面消毒，在無(wú)菌環(huán)境下去皮，加等質(zhì)量無(wú)菌水勻漿，用四層滅菌紗布除去碎渣，10000r/min 離心10min，取上清制成待用胡蘿卜母液。將胡蘿卜汁母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至胡蘿卜汁最終含量為0.030L/L；然后將上述添加了胡蘿卜汁的藻液與空白對(duì)照組藻液同時(shí)在26℃、光強(qiáng)4700lx、日光燈連續(xù)光照及營(yíng)養(yǎng)鹽饑餓（誘導(dǎo)培養(yǎng)樣過(guò)程中不添加營(yíng)養(yǎng)鹽，下同）的復(fù)合脅迫條件下進(jìn)行培養(yǎng)19d。
采用以下方法對(duì)本發(fā)明中含有胡蘿卜汁的藻液及空白對(duì)照組藻液定期進(jìn)行顯微觀察，具體是每天取少量藻液樣品在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞的顏色變化以及蝦青素積累情況，在顯微鏡底下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞完全變紅時(shí)即可測(cè)定蝦青素含量，測(cè)定步驟參照（Boussiba et al, 1991）具體如下：
①取對(duì)照和處理藻液各5ml，5000r/min 離心5min，棄上清得到藻細(xì)胞沉淀；
②分別向兩種藻細(xì)胞沉淀加入3mL含 5%KOH和30%甲醇破壞葉綠素5min后，5000r/min離心收集沉淀；
③在收集的沉淀中分別加入3ml二甲亞砜，利用超聲波破壁后（3次15 sec破壁/5sec間歇，輸出功率40W），于70℃水浴中處理10min，抽提至藻體發(fā)白；
④然后10000r/min離心10min，分別取上清于492nm下測(cè)定OD值；
⑤按公式C（mg/L）= （4.5×A×Va）/Vb計(jì)算兩種上清中的蝦青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亞砜的體積，Vb表示藻液體積。
結(jié)果表明：添加0.025±0.005L/L胡蘿卜汁處理組雨生紅球藻細(xì)胞蝦青素產(chǎn)量為3.42±0.62mg/L，是空白對(duì)照組產(chǎn)量的1.66~2.44倍。說(shuō)明添加胡蘿卜汁處理組能大幅提高雨生紅球藻積累蝦青素的產(chǎn)量，從而顯著提高生產(chǎn)效率。