本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地指一種安卡拉病毒亞單位疫苗的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2015年10月我國(guó)山東、安徽、河南等地爆發(fā)安卡拉病毒，此病是由腺病毒引起，主要引起腎炎、包涵體肝炎、心包積液、產(chǎn)蛋下降綜合征等。腺病毒分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞型，Ⅰ亞型不常見，Ⅱ亞型(火雞出血性腸炎和相關(guān)病毒)，Ⅲ亞型就是近期鬧的沸沸揚(yáng)揚(yáng)的腎炎、產(chǎn)蛋下降綜合癥、包涵體肝炎以及心包積水綜合癥(因其最早爆發(fā)于巴基斯坦的安卡拉地區(qū)，故又叫安卡拉疾病)。本病發(fā)生于3～6周齡的肉雞發(fā)病雞群多于3周齡開始死亡，4～5周齡達(dá)高峰，高峰持續(xù)期4～8天，5～6周齡死亡減少。病程8～15天，死亡率達(dá)20～80％。本病可垂直傳播和水平傳播。易與禽流感、新城疫、傳染性法氏囊和傳染性貧血病并發(fā)本病發(fā)病急驟一旦感染將給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失成為危害畜牧業(yè)發(fā)展的重大疫病之一。疫苗免疫接種是預(yù)防本病的有效措施。

安卡拉病毒是一種沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，由252個(gè)殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體(hexon)、12個(gè)五鄰體(penton)及12根纖毛(fiber)，除此之外還有其他一些小蛋白。五鄰體是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，它的多肽長(zhǎng)452個(gè)氨基酸，參與構(gòu)成病毒粒子的十二個(gè)頂點(diǎn)五鄰體通過其RGD或LGV基序與細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白作用，有助于腺病毒的侵入和內(nèi)化。其抗體可以阻斷病毒體從酸性的核內(nèi)質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞漿，從而使病毒感染性失活五鄰體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。因此Penton蛋白是作為安卡拉病毒的亞單位疫苗的首選。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)就是一個(gè)有力的工具，桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Baculovims expression vector system BEVS)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)它以桿狀病毒為載體通過將外源基因插入到桿狀病毒基因組并且用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞或者昆蟲幼蟲來(lái)表達(dá)外源蛋白并對(duì)蛋白進(jìn)行一定程度的包裝修飾折疊。到目前使用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源基因已有數(shù)千種是最具有應(yīng)用前景的真核基因高效表達(dá)系統(tǒng)之一。隨著生物技術(shù)的發(fā)展桿狀病毒從單一感染昆蟲細(xì)胞發(fā)展為現(xiàn)在的感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞它的應(yīng)用從蛋白的表達(dá)、疫苗的生產(chǎn)拓展到表面展示、基因治療等許多領(lǐng)域并且仍然處于不斷改進(jìn)與發(fā)展之中。

作為新發(fā)病毒目前尚無(wú)商業(yè)化的安卡拉病毒疫苗進(jìn)行防控。此病造成如此大的經(jīng)濟(jì)損失，使得安全高效的疫苗的投入市場(chǎng)迫在眉睫。而常用的滅活苗在滅活過程中有可能損害或改變有效的抗原決定簇；產(chǎn)生的免疫效果維持時(shí)間短，不產(chǎn)生局部抗體；可能產(chǎn)生毒性或潛在的對(duì)機(jī)體不利的免疫反應(yīng)；需要多次注射，需要抗原量比較大，成本比較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供了一種安卡拉病毒亞單位疫苗的制備方法及應(yīng)用，該疫苗以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的安卡拉病毒的主要抗原Penton蛋白表達(dá)量高，蛋白活性高，Penton蛋白為抗原的安卡拉亞單位疫苗以及Penton+Fiber2蛋白為抗原的安卡拉混合亞單位疫苗都能對(duì)安卡拉病毒達(dá)到100％的保護(hù)率并且兩種疫苗產(chǎn)生的抗體高，維持時(shí)間長(zhǎng)。均能有效治療安卡拉病，減少安卡拉病毒感染將給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton，所述重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton是在載體pFastBac HTB的BamHI和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)間插入Penton基因構(gòu)建而成，其中，Penton基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本發(fā)明提供了一種上述重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)Penton基因的獲得

設(shè)計(jì)引物：

Penton-F：5'-AGCGGATCCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'，

BamHI

Penton-R：5'-GGTAAGCTTCTACTGCAAGGTCGCGGAACTC-3'；

HindⅢ

以安卡拉病毒的全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因；

2)重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建

以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因連接，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。

作為優(yōu)先方案，所述步驟1)中，

PCR體系：

PCR條件：94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s 68℃1min；30個(gè)循環(huán)后68℃延伸10min；

所述步驟2)中，酶切體系：

酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h。

本發(fā)明還提供了一種重組桿狀病毒Ac-Penton，所述重組桿狀病毒Ac-Penton的基因組中含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。

本發(fā)明還提供了一種上述重組桿狀病毒Ac-Penton的制備方法，包括以下步驟：

1)Penton基因的獲得

設(shè)計(jì)引物：

Penton-F：5'-AGCGGATCCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'，

BamHI

Penton-R：5'-GGTAAGCTTCTACTGCAAGGTCGCGGAACTC-3'；

HindⅢ

以卡拉病毒的全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因；

2)重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建

以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因連接，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。

3)重組桿粒Bacmid-Penton

將重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后取少量培養(yǎng)液劃線于含有三抗(卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)和IPTG、X-gal的高鹽LB平板培養(yǎng)，通過藍(lán)白斑篩選挑取單個(gè)白色菌落PCR鑒定正確后接種含有抗生素的的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm/min振動(dòng)培養(yǎng)振搖培養(yǎng)過夜，提取得到重組桿粒Bacmid-Penton；

4)重組桿狀病毒Ac-Penton獲得

將重組桿粒Bacmid-Penton轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，4-7天后觀察到細(xì)胞有明顯病變，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清即獲得重組桿狀病毒Ac-Penton。

作為優(yōu)先方案，所述步驟1)中，

PCR體系：

PCR條件：94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min；

所述步驟2)中，酶切體系：

酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h。

本發(fā)明還提供了一種基于重組桿狀病毒Ac-Penton制備安卡拉病毒亞單位疫苗的方法，包括以下步驟：

1)將重組桿狀病毒Ac-Penton接種懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞SF9中，培養(yǎng)離心收集細(xì)胞；

2)上述細(xì)胞超聲破碎裂解取上清，親和層析純化回收，然后沖洗過柱洗脫，得到純化的蛋白，

3)將步驟2)純化的蛋白稀釋至300～800μg/ml，將稀釋的蛋白與佐劑按重量比2:7～1:2混合均勻，得到安卡拉病毒亞單位疫苗。

作為優(yōu)選方案，所述佐劑為Montanide^TMISA 71 VG、

上述制備安卡拉病毒亞單位疫苗在防治安卡拉病中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種基于重組桿狀病毒Ac-Penton和Ac-Fiber2制備安卡拉病毒混合亞單位疫苗的方法，包括以下步驟：

1)Fiber2基因的獲得

設(shè)計(jì)引物：

Fiber2-F：5’-AGCTCTAGAATGCTCCGGGCCCCTAAA-3’，

Xba Ⅰ

Fiber2-R：5’-GGTAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCG-3’；

HindⅢ

以卡拉病毒的全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，

PCR體系：

PCR條件：94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min；

擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)Xba Ⅰ/HindⅢ的Fiber2基因；

2)重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Fiber2的構(gòu)建

以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)Xba Ⅰ/HindⅢ的Fiber2基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Fiber2基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Fiber2基因連接，

酶切體系：

酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h；得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Fiber2。

3)重組桿粒Bacmid-Fiber2

將重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Fiber2轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后取少量培養(yǎng)液劃線于含有三抗(卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)和IPTG、X-gal的高鹽LB平板培養(yǎng)，通過藍(lán)白斑篩選挑取單個(gè)白色菌落PCR鑒定正確后接種含有抗生素的的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm/min振動(dòng)培養(yǎng)振搖培養(yǎng)過夜，提取得到重組桿粒Bacmid-Fiber2；

4)重組桿狀病毒Ac-Fiber2獲得

將重組桿粒Bacmid-Fiber2轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，4-7天后觀察到細(xì)胞有明顯病變，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清即獲得重組桿狀病毒Ac-Fiber2；

5)利用重組桿狀病毒Ac-Penton和Ac-Fiber2制備安卡拉病毒混合亞單位疫苗

a.將重組桿狀病毒Ac-Penton和Ac-Fiber2分別接種于懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞SF9中，培養(yǎng)分別離心收集細(xì)胞；

b.上述細(xì)胞分別超聲破碎裂解取上清，親和層析純化回收，然后分別沖洗過柱洗脫，分別得到純化的蛋白Penton和Fiber2，

c.將步驟b)純化的蛋白Penton和Fiber2分別稀釋至相同濃度300-800μg/ml，將稀釋的蛋白Penton和Fiber2按體積比1:1混合后按與佐劑按重量比2:7～1:2混合均勻，得到安卡拉病毒混合亞單位疫苗。

作為優(yōu)選方案，所述佐劑為Montanide^TMISA 71 VG。

本發(fā)明還提供了一種上述安卡拉病毒混合亞單位疫苗在防治安卡拉病中應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供一種桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTB-Penton和桿狀病毒重組毒Ac-Penton以及利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Penton蛋白亞單位苗和以Penton蛋白和Fiber2蛋白混合亞單位疫苗。大量高效的表達(dá)安卡拉病毒的主要抗原性蛋白Penton蛋白，此蛋白表達(dá)量高，蛋白活性好，以Penton蛋白為抗原的疫苗和以Penton蛋白和Fiber2蛋白為抗原的混合苗都能對(duì)安卡拉病毒達(dá)到100％的保護(hù)率。而且產(chǎn)生的抗體高，維持時(shí)間長(zhǎng)。

附圖說(shuō)明

圖1為目的基因Fiber2的擴(kuò)增鑒定；M.DNA marker(DL2000)1～2.Fiber2的擴(kuò)增；

圖2為目的基因Penton的擴(kuò)增鑒定；M.DNA marker(DL2000)1～2.Penton的擴(kuò)增；

圖3為挑取白斑對(duì)Bacmid中目的基因Penton和Fiber2的鑒定；分別用目的基因Penton和Fiber2的上游引物和M13下游引物擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，M.DNA marker(DL5000)，1～2.Penton的鑒定；3～4.Fiber2的鑒定；

圖4為P3代重組桿狀病毒Ac-Penton和Ac-Fiber2中目的基因Penton和Fiber2的鑒定圖；

圖中，M為DL5000 DNA Marker，1～3.Penton的鑒定；4～6.Fiber2的鑒定；

圖5為P3代重組桿狀病毒Ac-Penton和Ac-Fiber2無(wú)野毒污染的鑒定；

圖中，M為DL5000 DNA Marker，1～2.Ac-Penton中無(wú)野毒污染的鑒定，3～4.Ac-Fiber2中無(wú)野毒污染的鑒定，5.陰性對(duì)照6.陽(yáng)性對(duì)照；

圖6為通過western-blotting鑒定P3代重組毒Ac-Penton和Ac-Fiber2感染Sf9細(xì)胞中目的蛋白Penton和Fiber2蛋白的表達(dá)圖；

圖中，1，3是ProteinMarker,2是Penton蛋白，4.Fiber2蛋白；

圖7為中間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白Penton、Fiber2的表達(dá)圖；

圖8為對(duì)Penton蛋白的表達(dá)的最佳接毒劑量?jī)?yōu)圖化；

圖中，1是Protein Marker，2-7是不同劑量(0.1MOI、0.2MOI、0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI)的P3代重組毒Ac-Penton感染Sf9細(xì)胞得到目的蛋白的相對(duì)水平；

圖9為對(duì)Fiber2蛋白的表達(dá)的最佳接毒劑量?jī)?yōu)化圖；

圖中，1是Protein Marker，2-7是不同劑量(0.1MOI、0.2MOI、0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI)的P3代重組毒Ac-Fiber2感染Sf9細(xì)胞得到目的蛋白的相對(duì)水平；

圖10為免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組病變對(duì)比圖；

圖11為免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組心臟病理切片圖對(duì)比圖；

圖12為免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組肝臟病理切片圖對(duì)比圖；

圖13為Penton蛋白為抗原的疫苗免疫后抗體監(jiān)測(cè)S/P值折線圖；

圖14為Penton和Fiber2蛋白為抗原的混合疫苗免疫后抗體監(jiān)測(cè)S/P值折線圖；

分別于首免后第7、14、21、28、35、42、49、56、63、70天翅靜脈采血用腺病毒商品試劑盒檢測(cè)血清S/P值規(guī)律(S/P值≥0.5判定為陽(yáng)性，S/P≤0.499判定為陰性)。

圖15為pFastBac HTB質(zhì)粒載體圖譜；

圖16為pFastBac HTB質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1：重組桿狀病毒Ac-Penton的獲取

1.Penton基因的獲得

安卡拉病毒DNA的提?。?/p>

病毒DNA的抽提采用的是SDS-蛋白酶K-酚/氯仿法，即取600μL病毒液，4℃,12000rpm/min離心10min，取425μ上清加入20μL25mg/mL的蛋白酶K和50μL 10％SDS使蛋白酶K和SDS最終濃度為1mg/ml和1％。56℃水浴1h且不時(shí)搖動(dòng)；加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)充分混勻，4℃10000rpm，離心15min。取上清，在上清中加入等體積的氯仿充分混勻4℃10000rpm，離心15min取上清加入1/10體積的NaAc(3M,pH 5.0)和大于2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，-20℃沉淀2h，12000rpm/min離心15min去掉上清，將沉淀干燥稀釋于20μL滅菌純水中，-20℃保存。

設(shè)計(jì)引物：

Penton-F：5'-AGCGGATCCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'，

BamHI

Penton-R：5'-GGTAAGCTTCTACTGCAAGGTCGCGGAACTC-3'；

HindⅢ

以安卡拉病毒的DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因；該毒株命名為I群禽腺病毒株FAdv-HB，于2017年1月3日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為：CCTCC NO：V201703。

PCR體系：

將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min。全部反應(yīng)結(jié)束后，將所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示得到正確的Penton基因序列。

2.重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建

以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因連接，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。

雙酶切體系：

雙酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h，取10μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

連接體系

連接條件：將上述連接體系混勻后4℃連接過夜。

3.重組Bacmid-Penton的獲得及提取

3.1 Bacmid-Penton的獲得

將鑒定正確的pFastBac HTB-Penton重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃220rpm/min振動(dòng)培養(yǎng)4h，用無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基將菌液做10¹、10²、10³倍稀釋，涂布在含有慶大霉素(7㎎/L)、卡那霉素(50㎎/L)、四環(huán)素(10㎎/L)、IPTG(40㎎/L)、X-gal(100㎎/L)的LB瓊脂平皿上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)8h，挑取單個(gè)白色菌落接種含有慶大霉素(7㎎/L)、卡那霉素(50㎎/L)、四環(huán)素(10㎎/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm/min振動(dòng)培養(yǎng)振搖培養(yǎng)過夜，提取重組桿粒

Penton基因的特異性上游引物和M13下引物對(duì)其進(jìn)行目的鑒定，鑒定正確結(jié)果如圖3所示獲得基因的重組桿粒Bacmid-Penton同時(shí)挑取單個(gè)藍(lán)斑菌落，用做陰性對(duì)照。

3.2 Bacmid-Penton提取方法

1)過夜培養(yǎng)的菌液1.5mL，8000rpm/min離心5min收集菌體；

2)加入300μL溶液Ⅰ重懸菌體，冰上放置3-5min后加入，300μL溶液Ⅱ，顛倒混勻，冰上靜置2-5min；加入300μL預(yù)冷的溶液Ⅲ，顛倒混勻，冰上靜置10min；

3)12000rpm/min 4℃離心15min，取上清重復(fù)離心一次，再取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，置于-20℃沉淀30min；

4)12000rpm/min 4℃離心15min，棄上清將沉淀用75％預(yù)冷的乙醇洗滌兩遍后室溫晾干，加入適量無(wú)菌RNA酶水37℃溶解30min后于-80℃保存?zhèn)溆?；溶液Ⅰ?0mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-Cl(PH8.0)；

溶液Ⅱ：0.2M NaOH:1％SDS＝1：1現(xiàn)配現(xiàn)用；

溶液Ⅲ：3M乙酸鉀，pH為5.5。

4.Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到重組毒Ac-Penton

4.1 Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的方法：

1)取1μgBacmid于100μL Grace培養(yǎng)基中混勻命名為A液靜置10min；

2)取6μL Cellfectin于94μLGrace培養(yǎng)基中輕輕混勻命名為B液靜置10min；

3)將A液和B液混勻，每隔5分鐘輕彈15下，3-4次后靜置15min，使Cellfectin充分接觸包裹Bacmid；

4)向混合液中加入800μLGrace培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻；

5)取培養(yǎng)在六孔板中密度為2×10⁶cells/ml的Sf9細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入無(wú)菌PBS輕搖洗兩次后加入1mLGrace培養(yǎng)基；

6)將混合液均勻加入六孔板中，使細(xì)胞培養(yǎng)基總體積為2mL，放入26℃培養(yǎng)箱中孵育5h；

7)棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清每孔加入2mL含10％FBS的Grace培養(yǎng)基，其中含抗生素20μL慶大霉素和20μL鏈霉素后置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-96h直至細(xì)胞75％發(fā)生病變；

8)離心棄去細(xì)胞碎片取培養(yǎng)上清即為P1代重組桿狀病毒。

9)將P1代重組毒連續(xù)擴(kuò)增兩代得到P3代重組毒Ac-Penton進(jìn)行目的基因的鑒定和野毒污染的鑒定如圖4和圖5所示，我們得到了正確的重組桿狀病毒并且無(wú)野毒污染。

實(shí)施例2：重組蛋白Penton的表達(dá)、定量及純化

1.Western Blotting檢測(cè)目的蛋白Penton的表達(dá)

將P3代重組桿狀病毒感染的細(xì)胞生型桿狀病毒感染的細(xì)胞和正常細(xì)胞用細(xì)胞裂解液冰上裂解30min加入5×SDS Loading Buffer，沸水煮5-8min后瞬離，按常規(guī)方法進(jìn)行10％分離膠和5％濃縮膠的SDS-PAGE電泳分析，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上5％脫脂奶粉，4℃封閉過夜，加入1:5000稀釋的His標(biāo)簽一抗，室溫振搖2-3h，TBST洗3遍加入1:5000稀釋的AP標(biāo)記的兔抗鼠二抗，室溫振搖1h后TBST洗3遍，利用NBT/BCIP系統(tǒng)顯色。觀察特異性蛋白條帶，表明Penton蛋白已表達(dá)。(如圖6所示)

2.間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白Penton的表達(dá)

將Sf9細(xì)胞在24孔板上培養(yǎng)到密度為1×10⁶然后用P3代重組毒AcPenton感染此細(xì)胞26℃培養(yǎng)72h后棄掉培養(yǎng)上清用PBS洗兩次，加入4％多聚甲醛固定10min，棄掉固定液PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，加入1％Triton透化10min后PBS洗3次，加入1％BSA封閉30min后棄去封閉液PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，加入用1％BSA1:1000稀釋的His標(biāo)簽一抗室溫孵育2h后棄去上清用PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，加入用1％BSA稀釋FITC標(biāo)記的的兔抗鼠IgG避光震蕩30min后棄去上清用PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，每孔加入500μLPBS在熒光顯微鏡下觀察，同步設(shè)立正常Sf9細(xì)胞和野生型桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞為對(duì)照。表明目的蛋白Penton成功在桿狀病毒系統(tǒng)中得到表達(dá)(如圖7所示)。

3.蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

用不同0.1MOI、0.2MOI、0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI等不同MOI的P3代重組毒Ac-Penton分別感染健康Sf9細(xì)胞在27℃孵育72-96小時(shí)后觀察病變達(dá)75％收樣3500rpm/min離心10min，棄去培養(yǎng)液。將所收集的細(xì)胞超聲破碎12000rpm/min離心10min取裂解上清利用western-blotting確定最佳表達(dá)接毒量(如圖8所示)可以得出Penton蛋白的最小接毒劑量是P3代種毒1MOI。

4、重組桿狀病毒Ac-Penton的擴(kuò)大培養(yǎng)及Penton蛋白的純化

以P3代重組桿狀病毒為種毒，當(dāng)Sf9昆蟲細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生產(chǎn)期時(shí)(細(xì)胞密度為1-2×10⁶cells/ml)接種病毒，使病毒感染復(fù)數(shù)MOI為1。用重組毒Ac-Penton感染健康Sf9細(xì)胞在27℃孵育72-96小時(shí)后觀察病變達(dá)75％收樣3500rpm/min離心10min，棄去培養(yǎng)液。

將所收集的細(xì)胞超聲破碎12000rpm/min離心10min取裂解上清。使用親和層析介質(zhì)Ni一NTA對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化回收。

具體過程為將細(xì)胞液用BindingBuffer稀釋、上柱；再用BingdingBuffer沖洗柱子，去雜蛋白；ElutionBuffer洗脫，收集洗脫峰；洗脫后重生柱子。將純化后的蛋白稀釋至500μg/ml。

實(shí)施例3：安卡拉亞單位疫苗油乳劑的組成、制備及檢測(cè)

抗原：500μg/ml純化的目的蛋白Penton

佐劑：ISA 71 VG油包水型(W/O)

抗原與佐劑質(zhì)量比：3：7

疫苗制備：將純化的目的蛋白Penton稀釋到500μg/ml加入容器再按上述比例將佐劑佐劑ISA 71 VG分滴到容器中進(jìn)行乳化。

疫苗性狀檢測(cè)：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散開，第二滴油珠狀，晃動(dòng)液面油珠不破乳。

無(wú)菌檢測(cè)：取少許疫苗涂布TSA平皿，37℃溫箱培養(yǎng)18小時(shí)無(wú)菌落長(zhǎng)出。

穩(wěn)定性檢驗(yàn)：3000rpm/min離心15分鐘，離心后乳化疫苗未分層。

實(shí)施例4：安卡拉亞單位疫苗免疫SPF雞的保護(hù)力檢測(cè)及抗體消長(zhǎng)試驗(yàn)

取SPF雞(購(gòu)自北京梅里亞)40只，隨機(jī)分為2組每組20只按照表1進(jìn)行免疫。

第1組：Penton組；

第2組：健康Sf9細(xì)胞裂解上清(對(duì)照組)。具體免疫方案參見表1

雞群2周齡首免，4周齡二免，6周齡時(shí)每組隨機(jī)取10只攻毒。具體免疫劑量，抗原含量，佐劑，保護(hù)率見表1和表2。每組剩余10只于一免后第7，14，21，28，35，42，49，56，63，70天采血用BioChek禽腺病毒1群(FADV-1)ELISA檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品代碼：CK132)檢測(cè)抗體消長(zhǎng)規(guī)律。S/P值≥0.5判定為陽(yáng)性，S/P≤0.499判定為陰性(如圖13所示)可見此疫苗不僅保護(hù)效果好且產(chǎn)生抗體快，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

表1免疫分組，每組抗原含量，免疫劑量、方式、次數(shù)等

表2免疫攻毒保護(hù)率

按照如表1所示的免疫方案我們得到以Penton蛋白為抗原的安卡拉亞單位疫苗對(duì)安卡拉病毒有100％的保護(hù)率。對(duì)免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組的雞只與攻毒之后分別進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)空白攻毒對(duì)照組有明顯的心包積液和肝臟病變淤血而免疫攻毒組未見明顯異常(如圖10所示)，另外對(duì)免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組雞只取心臟和肝臟做病理切片也發(fā)現(xiàn)空白攻毒對(duì)照有明顯的心肌細(xì)胞成團(tuán)紅細(xì)胞聚集，主要是淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，少量多核巨細(xì)胞，中央血管壁平滑肌細(xì)胞壞死(如圖11所示)。肝竇輕度充血，門管區(qū)及組織間有聚集成團(tuán)的淋巴細(xì)胞，部分細(xì)胞有嗜堿性核內(nèi)包涵體而免疫攻毒組的心肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞均無(wú)明顯異常(如圖12所示)。

實(shí)施例5：重組桿狀病毒Ac-Fiber2的獲取

1.Fiber2基因的獲得

安卡拉病毒DNA的提?。?/p>

病毒DNA的抽提采用的是SDS-蛋白酶K-酚/氯仿法，即取600μL病毒液，4℃,12000rpm/min離心10min，取425μL上清加入20μL 25mg/mL的蛋白酶K和50μL 10％SDS使蛋白酶K和SDS最終濃度為1mg/ml和1％。56℃水浴1h且不時(shí)搖動(dòng)；加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)充分混勻，4℃10000rpm，離心15min。取上清，在上清中加入等體積的氯仿充分混勻4℃10000rpm，離心15min取上清加入1/10體積的NaAc(3M,pH 5.0)和大于2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，-20℃沉淀2h，12000rpm/min離心15min去掉上清，將沉淀干燥稀釋于20μL滅菌純水中，-20℃保存。

設(shè)計(jì)引物：

Fiber2-F：5’-AGCTCTAGAATGCTCCGGGCCCCTAAA-3’，

Xba Ⅰ

Fiber2-R：5’-GGTAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCG-3’

HindⅢ

以安卡拉病毒的DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)Xba Ⅰ/HindⅢ的Penton基因；

PCR體系：

將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min。全部反應(yīng)結(jié)束后，將所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果(如圖1所示)得到正確的Fiber2基因序列。

2.重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Fiber2的構(gòu)建

以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Fiber2基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Fiber2基因連接，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Fiber2。

雙酶切體系：

雙酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h，取10μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

連接體系

連接條件：將上述連接體系混勻后4℃連接過夜。

3.重組Bacmid-Fiber2的獲得及提取

3.1 Bacmid-Fiber2的獲得

將鑒定正確的pFastBac HTB-Fiber2重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃220rpm/min振動(dòng)培養(yǎng)4h，用無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基將菌液做10¹、10²、10³倍稀釋，涂布在含有慶大霉素(7㎎/L)、卡那霉素(50㎎/L)、四環(huán)素(10㎎/L)、IPTG(40㎎/L)、X-gal(100㎎/L)的LB瓊脂平皿上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)8h，挑取單個(gè)白色菌落接種含有慶大霉素(7㎎/L)、卡那霉素(50㎎/L)、四環(huán)素(10㎎/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm/min振動(dòng)培養(yǎng)振搖培養(yǎng)過夜，提取重組桿粒

Fiber2基因的特異性上游引物和M13下引物對(duì)其進(jìn)行目的鑒定，鑒定正確結(jié)果如圖3所示獲得基因的重組桿粒Bacmid-Fiber2同時(shí)挑取單個(gè)藍(lán)斑菌落，用做陰性對(duì)照。

3.2 Bacmid-Fiber2提取方法

1)過夜培養(yǎng)的菌液1.5mL，8000rpm/min離心5min收集菌體；

2)加入300μL溶液Ⅰ重懸菌體，冰上放置3-5min后加入，300μL溶液Ⅱ，顛倒混勻，冰上靜置2-5min；加入300μL預(yù)冷的溶液Ⅲ，顛倒混勻，冰上靜置10min；

3)12000rpm/min 4℃離心15min，取上清重復(fù)離心一次，再取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，置于-20℃沉淀30min；

4)12000rpm/min 4℃離心15min，棄上清將沉淀用75％預(yù)冷的乙醇洗滌兩遍后室溫晾干，加入適量無(wú)菌RNA酶水37℃溶解30min后于-80℃保存?zhèn)溆?；溶液Ⅰ?0mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(PH8.0)；

溶液Ⅱ：0.2M NaOH:1％SDS＝1：1現(xiàn)配現(xiàn)用；

溶液Ⅲ：3M乙酸鉀，pH為5.5。

4.Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到重組毒Ac-Fiber2

4.1 Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的方法：

1)取1μgBacmid于100μL Grace培養(yǎng)基中混勻命名為A液靜置10min；

2)取6μL Cellfectin于94μLGrace培養(yǎng)基中輕輕混勻命名為B液靜置10min；

3)將A液和B液混勻，每隔5分鐘輕彈15下，3-4次后靜置15min，使Cellfectin充分接觸包裹Bacmid；

4)向混合液中加入800μLGrace培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻；

5)取培養(yǎng)在六孔板中密度為2×10⁶cells/ml的Sf9細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入無(wú)菌PBS輕搖洗兩次后加入1mLGrace培養(yǎng)基；

6)將混合液均勻加入六孔板中，使細(xì)胞培養(yǎng)基總體積為2mL，放入26℃培養(yǎng)箱中孵育5h；

7)棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清每孔加入2mL含10％FBS的Grace培養(yǎng)基，其中含抗生素20μL慶大霉素和20μL鏈霉素后置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-96h直至細(xì)胞75％發(fā)生病變；

8)離心棄去細(xì)胞碎片取培養(yǎng)上清即為P1代重組桿狀病毒。

9)將P1代重組毒連續(xù)擴(kuò)增兩代得到P3代重組毒進(jìn)行目的基因的鑒定和野毒污染的鑒定如圖4和圖5所示，我們得到了正確的重組桿狀病毒Ac-Fiber2并且無(wú)野毒污染。

實(shí)施例6重組蛋白Fiber2的表達(dá)、定量及純化

1.Western Blotting檢測(cè)目的蛋白Fiber2的表達(dá)

將P3代重組桿狀病毒感染的細(xì)胞生型桿狀病毒感染的細(xì)胞和正常細(xì)胞用細(xì)胞裂解液冰上裂解30min加入5×SDS Loading Buffer，沸水煮5-8min后瞬離，按常規(guī)方法進(jìn)行10％分離膠和5％濃縮膠的SDS-PAGE電泳分析,轉(zhuǎn)印至PVDF膜上5％脫脂奶粉，4℃封閉過夜,加入1:5000稀釋的His標(biāo)簽一抗，室溫振搖2-3h，TBST洗3遍加入1:5000稀釋的AP標(biāo)記的兔抗鼠二抗，室溫振搖1h后TBST洗3遍，利用NBT/BCIP系統(tǒng)顯色。觀察特異性蛋白條帶，表明Fiber2蛋白已正確表達(dá)(如圖6所示)。

2.間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白Fiber2的表達(dá)

將Sf9細(xì)胞在24孔板上培養(yǎng)到密度為1×10⁶然后用P3代重組毒AcPenton感染此細(xì)胞26℃培養(yǎng)72h后棄掉培養(yǎng)上清用PBS洗兩次，加入4％多聚甲醛固定10min，棄掉固定液PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，加入1％Triton透化10min后PBS洗3次，加入1％BSA封閉30min后棄去封閉液PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，加入用1％BSA 1:1000稀釋的His標(biāo)簽一抗室溫孵育2h后棄去上清用PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，加入用1％BSA稀釋FITC標(biāo)記的的兔抗鼠IgG避光震蕩30min后棄去上清用PBS洗3次每次震蕩搖晃5min，每孔加入500μLPBS在熒光顯微鏡下觀察，同步設(shè)立正常Sf9細(xì)胞和野生型桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞為對(duì)照。表明目的蛋白Fiber2成功在桿狀病毒系統(tǒng)中得到表達(dá)(如圖7所示)。

3.蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

用不同0.1MOI、0.2MOI、0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI等不同MOI的P3代重組毒Ac-Fiber2分別感染健康Sf9細(xì)胞在27℃孵育72-96小時(shí)后觀察病變達(dá)75％收樣3500rpm/min離心10min，棄去培養(yǎng)液。將所收集的細(xì)胞超聲破碎12000rpm/min離心10min取裂解上清利用western-blotting確定最佳表達(dá)接毒量。(如圖9所示)可以得出Fiber2蛋白的最小接毒劑量是P3代種毒2MOI。

4、重組桿狀病毒Ac-Fiber2的擴(kuò)大培養(yǎng)及Fiber2蛋白的純化

以P3代重組桿狀病毒為種毒，當(dāng)Sf9昆蟲細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生產(chǎn)期時(shí)(細(xì)胞密度為1-2×10⁶cells/ml)接種病毒,使病毒感染復(fù)數(shù)MOI為1。用重組毒Ac-Penton感染健康Sf9細(xì)胞在27℃孵育72-96小時(shí)后觀察病變達(dá)75％收樣3500rpm/min離心10min，棄去培養(yǎng)液。

將所收集的細(xì)胞超聲破碎12000rpm/min離心10min取裂解上清。使用親和層析介質(zhì)Ni一NTA對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化回收。

具體過程為將細(xì)胞液用BindingBuffer稀釋、上柱；再用BingdingBuffer沖洗柱子,去雜蛋白；ElutionBuffer洗脫,收集洗脫峰；洗脫后重生柱子。將純化后的蛋白稀釋至500μg/ml。

實(shí)施例7安卡拉混合亞單位疫苗油乳劑的組成、制備及檢測(cè)

抗原：500μg/ml純化的目的蛋白Penton和500μg/ml純化的目的蛋白Fiber21:1混合

佐劑：ISA 71 VG油包水型(W/O)

抗原與佐劑質(zhì)量比：3：7

疫苗制備：將純化的目的蛋白Penton和Fiber2分別稀釋到500μg/ml并按1:1加入容器再按抗原與佐劑質(zhì)量比3：7將佐劑佐劑ISA 71 VG分滴到容器中進(jìn)行乳化。

疫苗性狀檢測(cè)：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散開，第二滴油珠狀，晃動(dòng)液面油珠不破乳。

無(wú)菌檢測(cè)：取少許疫苗涂布TSA平皿，37℃溫箱培養(yǎng)18小時(shí)無(wú)菌落長(zhǎng)出。

穩(wěn)定性檢驗(yàn)：3000rpm/min離心15分鐘，離心后乳化疫苗未分層。

實(shí)施例8安卡拉亞單位疫苗免疫SPF雞的保護(hù)力檢測(cè)及抗體消長(zhǎng)試驗(yàn)

取SPF雞(購(gòu)自北京梅里亞)40只，隨機(jī)分為2組每組20只進(jìn)行免疫，具體免疫方式參見表1。

第1組：混合苗(Penton+Fiber2)組；

第2組：健康Sf9細(xì)胞裂解上清(對(duì)照組)。具體免疫方案參見表1

雞群2周齡首免，4周齡二免，6周齡時(shí)每組隨機(jī)取10只攻毒。具體免疫劑量，抗原含量，佐劑，保護(hù)率見表3和表4。每組剩余10只于一免后第7，14，21，28，35，42，49，56，63，70天采血用BioChek禽腺病毒1群(FADV-1)ELISA檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品代碼：CK132)檢測(cè)抗體消長(zhǎng)規(guī)律。S/P值≥0.5判定為陽(yáng)性，S/P≤0.499判定為陰性。(如圖13所示)可見此疫苗不僅保護(hù)效果好且產(chǎn)生抗體快，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

表3免疫分組，每組抗原含量，免疫劑量、方式、次數(shù)等

表4免疫攻毒保護(hù)率

按照如表3所示的免疫方案我們得到以Penton+Fiber2蛋白為抗原的安卡拉亞單位混合疫苗對(duì)安卡拉病毒有100％的保護(hù)率(如表4所示)。對(duì)免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組的雞只與攻毒之后分別進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)空白攻毒對(duì)照組有明顯的心包積液和肝臟病變淤血而免疫攻毒組未見明顯異常(如圖10所示)，另外對(duì)免疫攻毒組和空白攻毒對(duì)照組雞只取心臟和肝臟做病理切片也發(fā)現(xiàn)空白攻毒對(duì)照有明顯的心肌細(xì)胞成團(tuán)紅細(xì)胞聚集，主要是淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，少量多核巨細(xì)胞，中央血管壁平滑肌細(xì)胞壞死(如圖11所示)。肝竇輕度充血，門管區(qū)及組織間有聚集成團(tuán)的淋巴細(xì)胞，部分細(xì)胞有嗜堿性核內(nèi)包涵體而免疫攻毒組的心肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞均無(wú)明顯異常(如圖12所示)。

其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 安卡拉病毒亞單位疫苗的制備方法及應(yīng)用

<211>1578bp

<212> DNA

<213> Penton基因

<400> 1

atgtgggggttgcagccgccgacgtcgattccgccgcctcctccgccgaccgagttaacgccctcgacctatccggcgat

ggtgaacggctatccgcctccggccgcgtccgcgcagagctgtccctctagcgacggtcagagcgagctgtatatgcccc

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<210>2

<211> 1440bp

<212> DNA

<213> Fiber2基因

<400> 2

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