發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥劑以及它們在增生性疾病(如癌癥(特別是腦癌))的治療中的用途。

發(fā)明背景

現(xiàn)有的治療大腦實體癌癥(即腦腫瘤)的方法涉及外科手術(shù)、放射治療和化療中的一種或多種。例如，使用stupp方案治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(其是人類中最常見的腦癌)。這涉及放射/替莫唑胺化療一起，以及接著單獨(dú)使用替莫唑胺的輔助化療，并是在腫瘤的外科手術(shù)最大程度切除術(shù)后進(jìn)行。替莫唑胺使生存期延長約3個月(與單獨(dú)放療相比)，且成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的平均生存期為15個月。阿瓦斯汀(avastin)已被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，但就生存率其幾乎沒有改善。

此外，即使50％的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤依賴于表皮生長因子受體(egfr)信號傳導(dǎo)，臨床上可用的egfr抑制劑在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床試驗中已失敗。一些抑制劑沒有足夠的血腦屏障(bbb)滲透性。最近的研究也顯示成膠質(zhì)細(xì)胞瘤僅對ii型egfr抑制劑作出反應(yīng)，而ⅰ型抑制劑被試驗。成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的極度異質(zhì)性和侵襲性也導(dǎo)致作為用于腦癌的有效療法的分子靶向治療的失敗。

已經(jīng)顯示在許多非腦癌中有效的另一類化合物是微管蛋白靶向化學(xué)治療劑。然而，臨床使用的所述微管蛋白抑制劑(例如紫杉醇)是不能穿透血腦屏障的非常大的分子。此外，紫杉醇和其他的微管蛋白靶向的化學(xué)治療劑(如長春堿和長春新堿)具有嚴(yán)重的副作用(如化療誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變)。

因此，需要尋找用于增生性疾病(如癌癥)的新療法，特別是尋找用于腦癌的有效療法。

在本說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的提及不是承認(rèn)或暗示在任何管轄范圍內(nèi)該現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成普通通用知識的一部分，或者該現(xiàn)有技術(shù)可以被合理地預(yù)期會被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為相關(guān)的和/或與其他現(xiàn)有技術(shù)組合。

發(fā)明概要

本發(fā)明尋求解決上述問題中的一個或多個，和/或提供癌癥治療的改進(jìn)，并且在第一方面，提供式(i)化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥，其中：

x是c1-c6烷基或c2-c6烯基；

y是ch2、nh、n-烷基、n-烯基、s或o；

w是o、s或nh；

z是ch2、nh、n-烷基、n-烯基、s或o；

r1是鹵素、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，該環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被取代；

ar是芳基或雜芳基；

r2是h、oh、nh2或no2。

該化合物可以是式(i)化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥，其中：

x是c1-c6烷基或c2-c6烯基；

y是ch2、nh、n-烷基、n-烯基、s或o；

w是o、s或nh；

z是ch2、nh、n-烷基、n-烯基、s或o；

r1是鹵素、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，該環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被取代；

ar是芳基或雜芳基；

r2是h、oh、nh2或no2。

條件是該化合物不具有以下結(jié)構(gòu)：

該化合物可以是式(i)化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥，其中：

x是c1-c6烷基或c2-c6烯基；

y是ch2、nh、n-烷基、n-烯基、s或o；

w是o、s或nh；

z是ch2、nh、n-烷基、n-烯基、s或o；

r1是鹵素、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，該環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被取代；

ar是芳基或雜芳基；

r2是h、oh、nh2或no2。

條件是當(dāng)r1是芳基(特別是苯基)時，r1不被f取代。

x可以是c2烷基或c2烯基。

y可以是ch2。z可以是nh。z可以是o。z可以是ch2。

y可以是nh。y可以是o。

y和z都可以是nh。

y可以是ch2且z可以是nh。

z可以是ch2且y可以是nh。

y可以是ch2且z可以是o。

y可以是o且z可以是ch2。

w可以是o。

r1可以是鹵素基團(tuán)(例如br)。r1可以是芳基。所述芳基可以是單環(huán)或雙環(huán)。所述芳基可以是苯基或萘基。

所述芳基可以被取代。所述取代基可以選自鹵素基團(tuán)和雜烷基。所述鹵素基團(tuán)可以是f，所述雜烷基可以是o-烷基(例如-och3)或氨基烷基(例如-ch2nh2)。

r1可以是雜芳基。所述雜芳基可以是單環(huán)或雙環(huán)。所述雜芳基可以包括一個或多個氮原子。例如，所述雜芳基可以是吡唑、異噁唑、三唑、吡啶、嘧啶、喹啉、苯并咪唑或吲哚。所述雜芳基可以被取代。例如，所述取代基可以是鹵素基團(tuán)(例如f)或雜烷基(例如o-烷基，如-och3，或氨基烷基，如-ch2nh2)。

r1可以是雜環(huán)烷基。所述雜環(huán)烷基可以包括一個或多個氮原子。所述雜環(huán)烷基可以是哌嗪。所述雜環(huán)烷基可以包括一個或多個氧原子(除了一個或多個氮原子外，或作為一個或多個氮原子的替代物)。所述雜環(huán)烷基可以是嗎啉。所述雜環(huán)烷基可以被例如鹵素基團(tuán)(例如f)或雜烷基(例如o-烷基，如-och3，或氨基烷基，如-ch2nh2)取代。

ar可以是芳基。所述芳基可以是苯基。在一個實施方式中，ar是雜芳基。所述雜芳基可以包括一個或多個氮原子和/或nh基團(tuán)。所述雜芳基可以具有4或5個環(huán)碳原子。所述雜芳基可以是吡啶或嘧啶。

r2可以是h或oh。r2可以在對位。

式(i)化合物可以選自：

式(i)化合物可以選自：

4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺

4-(4-(2-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺

4-(4-(2,6-二氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺

4-(4-(6-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(吡啶-3-基)苯基)丁酰胺

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(2-甲氧基嘧啶-5-基)苯基)丁酰胺

4-(4-溴苯基)-n-苯基丁酰胺

4-(4-(2-氟吡啶-3-基)苯基)-n-苯基丁酰胺

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(嘧啶-5-基)苯基)丁酰胺

4-(4'-(氨基甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(喹啉-3-基)苯基)丁酰胺。

在第二方面，本發(fā)明涉及包含式(i)化合物(根據(jù)本發(fā)明的第一方面)與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

本發(fā)明的化合物和藥物組合物可適用于增生性疾病的治療或預(yù)防。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療或預(yù)防受試者的增生性疾病的方法，所述方法包括給該受試者施用有效量的本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防增生性疾病的藥物中的用途。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物在治療或預(yù)防受試者增生性疾病中的用途。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物用于治療或預(yù)防受試者增生性疾病。

在一個實施方式中，所述增生性疾病是癌癥。所述癌癥可以選自：腦癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮癌、皮膚癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。

所述癌癥可以是原發(fā)的。所述癌癥可以是轉(zhuǎn)移性的。所述癌癥可以是良性的。所述癌癥可以是惡性的。

所述癌癥可以是腦癌(例如間變性星形細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤、脈絡(luò)叢癌、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、彌漫性內(nèi)腦橋神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤、室管膜腫瘤、纖維性星形細(xì)胞瘤、巨細(xì)胞成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、大腦膠質(zhì)瘤病、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、視神經(jīng)鞘膜腦瘤、兒科室管膜瘤、纖維性星形細(xì)胞瘤、成松果體細(xì)胞瘤、松果體細(xì)胞瘤、多型的間變的成神經(jīng)細(xì)胞瘤、多形性黃色星形細(xì)胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、蝶骨嵴腦膜瘤、室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤、亞室管膜瘤、三邊視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。所述腦癌可以是原發(fā)性癌癥(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤或神經(jīng)鞘瘤)。所述腦癌可以是轉(zhuǎn)移性癌癥(例如黑素瘤或肺癌的結(jié)果)。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種完全或部分地預(yù)防受試者中實體瘤復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括給受試者施用有效量的本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物在制備用于完全或部分地預(yù)防實體瘤復(fù)發(fā)的藥物中的用途。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物用于完全或部分地預(yù)防受試者實體瘤復(fù)發(fā)的用途。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的式(i)化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物用于完全或部分地預(yù)防受試者實體瘤復(fù)發(fā)。

所述實體瘤可以是腦癌(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤)。所述腦癌可以是原發(fā)性癌癥。所述腦癌可以是轉(zhuǎn)移性癌癥。

所述式(i)化合物可以在療法中單獨(dú)使用或與一種或多種其它治療劑組合使用，例如作為聯(lián)合療法的一部分。

從通過實施例并參照附圖給出的以下描述，前述段落中描述的本發(fā)明的其它方面以及其實施方式將變得顯而易見。

附圖說明

圖1.用sc-38治療各種癌細(xì)胞系的結(jié)果以測試sc-38的癌細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性。

圖2.用sc-38治療各種癌細(xì)胞系的結(jié)果以測試sc-38對于惡性細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

圖3.化合物1-18的腦攝取。

圖4.在u87和u87viii細(xì)胞中sc-38誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖5.在sc-38治療后在u87和u87viii細(xì)胞中parp切割的蛋白質(zhì)印跡分析。(a)用1和5μm的sc-38處理u87(泳道1-3)和u87viii(泳道4-6)細(xì)胞48小時。顯示3個獨(dú)立實驗的代表性印跡。gapdh用作加載對照。(b)定量化parp切割并將其對gapdh進(jìn)行歸一化(表示為倍數(shù)變化)。結(jié)果是來自3個獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,***p<0.001,****p<0.0001)。

圖6.在u87和u87viii細(xì)胞中化合物1-08誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。用化合物1-08處理u87(a-b)和u87viii(c-d)細(xì)胞48小時，并用annexin-fitc/7-aad染色。使用muse細(xì)胞分析儀(密理博公司)(millipore)顯現(xiàn)凋亡細(xì)胞。結(jié)果是3次獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試計算統(tǒng)計顯著性(***p<0.001)。

圖7.在化合物1-08治療后在u87和u87viii細(xì)胞中parp切割的蛋白質(zhì)印跡分析。(a)用1和5μm化合物1-08處理u87(泳道1-3)和u87viii(泳道4-6)細(xì)胞48小時。顯示3個獨(dú)立實驗的代表性印跡。gapdh用作加載對照。(b)定量化parp切割并將其對gapdh進(jìn)行歸一化(表示為倍數(shù)變化)。結(jié)果是來自3個獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,****p<0.0001)。

圖8.在u87、u87viii和u251中sc-38處理對bcl-2家族蛋白的影響。

圖9.在u87、u87viii和u251中化合物1-08處理對bcl-2家族蛋白的影響。u87(泳道1-3)、u87viii(泳道4-6)和u251(泳道7-9)細(xì)胞。代表性印跡示于(a)，且定量化示于(b-e)，顯示為相對蛋白表達(dá)。結(jié)果為來自2次獨(dú)立實驗的平均值±sem，且使用未配對t-檢驗確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,**p<0.01)。

圖10.化合物1-08(稱為“化合物13”和“化合物13”)表現(xiàn)出與微管破壞一致的作用機(jī)制。(a)化合物1-08在體外抑制微管蛋白聚合。數(shù)據(jù)表示為來自至少3次獨(dú)立實驗的平均值；每個數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行三次。(b)用alexa488標(biāo)記的抗β-微管蛋白抗體(綠色)或dapi(藍(lán)色)染色用化合物1-08(24小時)處理的u87細(xì)胞。治療深深地擾亂了微管網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)致多核細(xì)胞的形成(白色箭頭)。白色比例尺表示50μm。手動計數(shù)多核細(xì)胞，且對每個樣品計數(shù)至少200個細(xì)胞。條形圖(c)中的數(shù)據(jù)表示為平均值±sem(n＝3；*p<0.05，***p<0.001；單因素方差分析，隨后是newman-keuls后測試)。(d)用化合物1-08處理u87細(xì)胞(48小時)，微管蛋白和dna如(b)中染色。用1-08治療導(dǎo)致有缺陷的有絲分裂紡錘體形成。顯示了來自3個獨(dú)立實驗的代表性圖像。白色比例尺表示2μm。

圖11.sc-38(簡稱“cmpd1”)、化合物1-08(簡稱“化合物13”)、化合物1-18(簡稱“化合物7”)和化合物1-38(簡稱“化合物10”)在代表兩個成膠質(zhì)細(xì)胞瘤亞型的原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤球中的功效。(a)rn1，經(jīng)典和(b)wk1，間充質(zhì)。在藥物治療72小時后，使用阿爾瑪藍(lán)細(xì)胞活力測定法確定測試化合物的細(xì)胞功效(ec50)。數(shù)據(jù)是來自3次獨(dú)立的一式三份進(jìn)行的實驗的平均值±sem。

具體實施方式

本發(fā)明基于式(i)化合物在增生性疾病(如癌癥，特別是腦癌)的治療中具有出乎意料的改進(jìn)這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)。

本文通常使用標(biāo)準(zhǔn)命名法來描述化合物。對于具有不對稱中心的化合物，應(yīng)當(dāng)理解，除非另有說明，否則包括所有光學(xué)異構(gòu)體及其混合物。具有兩個或更多個不對稱要素的化合物也可以非對映異構(gòu)體的混合物存在。此外，具有碳-碳雙鍵的化合物可以以z和e形式存在，除非另有說明，化合物的所有異構(gòu)體形式都包括在本發(fā)明中。當(dāng)化合物以各種互變異構(gòu)形式存在時，所列舉的化合物不限于任何一種特定的互變異構(gòu)體，而是旨在包括所有互變異構(gòu)形式。所列舉的化合物進(jìn)一步旨在包括其中一個或多個原子被同位素(即具有相同原子數(shù)但質(zhì)量數(shù)不同的原子)替代的化合物。作為一般實施例，但不限于此，氫的同位素包括氚和氘，且碳的同位素包括¹¹c、¹³c和¹⁴c。

具有一個或多個立體異構(gòu)中心的根據(jù)本文提供的所述化學(xué)式的化合物具有至少50％的對映體過量。例如，這樣的化合物可具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％的對映體過量。所述化合物的一些實施方式具有至少99％的對映體過量。顯而易見的是，可以通過不對稱合成、源自光學(xué)純前體的合成、生物合成或通過外消旋體的拆分(例如酶拆分或通過常規(guī)方法(如在拆分劑存在下的結(jié)晶化，或色譜法，使用例如手性hplc柱)的拆分)獲得單一的對映異構(gòu)體(光學(xué)活性形式)。

本文使用包括諸如r1、r2、ar、w、x、y和z的變量的通式描述某些化合物。除非另有說明，否則在該式中的每個變量的定義獨(dú)立于任何其它變量，并且在公式中出現(xiàn)超過一次的任何變量在每次出現(xiàn)時都獨(dú)立定義。因此，例如，如果一個基團(tuán)被0、1或2個r*取代，該基團(tuán)可以是未被取代的或被至多兩個r*基團(tuán)取代，并且每次出現(xiàn)的r*獨(dú)立地選自r*的定義。此外，取代基和/或變量的組合只有在這種組合產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物(即化合物可被分離、表征和測試生物活性)時才允許。

本文公開的化合物的“藥學(xué)上可接受的鹽”是本領(lǐng)域通常認(rèn)為適合用于與人類或動物的組織接觸而沒有過度毒性或致癌性，優(yōu)選沒有刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥的酸或堿鹽。特別地，本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽是不會不利地影響化合物穿過bbb的能力的那些。這樣的鹽包括堿性殘基(如胺)的礦物和有機(jī)酸鹽，以及酸性殘基(如羧酸)的堿或有機(jī)鹽。

適合的藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于：例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、蘋果酸、乙醇酸、富馬酸、硫酸、氨基磺酸、對氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羥乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水楊酸、谷氨酸、抗壞血酸、雙羥萘酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、丙酸、羥基馬來酸、氫碘酸、苯乙酸、鏈烷酸(如乙酸、hooc-(ch2)n-cooh(其中n是0至6的任何整數(shù)，即0、1、2、3、4、5或6)等酸的鹽。類似地，藥學(xué)上可接受的陽離子包括但不限于：鈉、鉀、鈣、鋁、鋰和銨。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可到本文提供的化合物的其它藥學(xué)上可接受的鹽。通常，藥學(xué)上可接受的酸或堿鹽可以通過任何常規(guī)的化學(xué)方法由含有堿性或酸性部分的母體化合物合成。簡言之，這些鹽可以通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學(xué)計量的適當(dāng)?shù)膲A或酸在水或有機(jī)溶劑(例如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈)或兩者的混合物中反應(yīng)來制備。

顯而易見的是，式(i)的每種化合物可以但不必以水合物、溶劑合物或非共價復(fù)合物形式存在。此外，各種晶型和多晶型物以及本文提供的式(i)化合物的前藥也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

“前藥”是一種可能不完全滿足本文提供化合物的結(jié)構(gòu)要求的化合物，但在給受試者或患者施用后在體內(nèi)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生本文提供的式(i)化合物。例如，前藥可以是本文提供的化合物的?；苌铩Ｇ八幇ㄆ渲辛u基、羧基、胺或巰基鍵合到任何基團(tuán)(當(dāng)給予哺乳動物受試者時，這些基團(tuán)分別切割形成游離羥基、羧基、氨基或巰基)的化合物。前藥的例子包括但不限于：本文提供的化合物中的醇和胺官能團(tuán)的乙酸鹽、甲酸鹽、磷酸鹽和苯甲酸鹽衍生物。本文提供的化合物的前藥可以通過以這樣的方式(即使得該修飾在體內(nèi)被切割以產(chǎn)生母體化合物)修飾化合物中的官能團(tuán)來制備。

如本文所用的“取代基”是指共價鍵合到目的分子內(nèi)的原子的分子部分。例如，“環(huán)取代基”可以是如鹵素、烷基、雜烷基、鹵代烷基或其它本文所述的取代基的部分，其共價鍵合到是環(huán)成員的原子(優(yōu)選碳原子或氮原子)上。如本文所用，術(shù)語“取代的”是指指定原子上的任一個或多個氫被選自所指示的取代基取代，條件是不超過指定的原子的正常價態(tài)，并且所述取代形成穩(wěn)定的化合物，即可以被分離、表征和測試生物活性的化合物。當(dāng)取代基是氧代，即＝o時，所述原子上的兩個氫被取代。作為芳香族碳原子的取代基的氧代基導(dǎo)致-ch-轉(zhuǎn)化為-c(＝o)-和喪失芳香性。例如，被氧代的吡啶基是吡啶酮。合適的取代基的實例是烷基(包括鹵代烷基，例如cf3)、雜烷基(例如-och3、-ch2nhch3、-ch2nh2)、鹵素(例如氟、氯、溴或碘原子)、oh、＝o、sh、so3h、nh2、＝nh、n3和no2基團(tuán)。

術(shù)語“烷基”是指飽和的、直鏈或支鏈的烴基。烷基的具體實例是甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基和2,2-二甲基丁基。

術(shù)語“雜烷基”是指含有一個或多個選自氧、氮和硫(特別是氧和氮)的雜原子的如上定義的烷基。雜烷基的具體實例是o-烷基(例如甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、丁氧基和叔丁氧基)、甲氧基甲基、乙氧基甲基、-ch2ch2oh、-ch2oh、甲氧基乙基、1-甲氧基乙基、1-乙氧基乙基、2-甲氧基乙基或2-乙氧基乙基、氨基烷基(如-ch2nh2、–ch2ch2nh2等)甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、異丙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、異丙基乙基氨基、甲基氨基甲基、乙基氨基甲基、二異丙基氨基乙基、甲硫基、乙硫基、異丙硫基、烯醇醚、二甲基氨基甲基、二甲基氨基乙基、乙酰基、丙酰基、丁酰氧基、乙酰氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙酰氧基、乙酰氨基、丙酰氨基、羧甲基、羧乙基、羧丙基，n-乙基-n-甲基氨基甲?；蚽-甲基氨基甲?；?。雜烷基的其它實例是腈、異腈、氰酸酯、硫氰酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯和烷基腈基團(tuán)。

術(shù)語“烯基”是指至少部分不飽和的、含有至少兩個碳原子的直鏈或支鏈烴基(即c2烯基)。烯基的具體實例是乙烯基、丙烯基(烯丙基)、異丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、乙炔基、炔丙基、異戊二烯基和己-2-烯基。優(yōu)選地，烯基具有一個或兩個雙鍵。

術(shù)語“環(huán)烷基”是指含有一個或多個環(huán)(優(yōu)選1或2個)的飽和或部分不飽和(例如環(huán)烯基)的環(huán)基，并且含有3至14個環(huán)碳原子，優(yōu)選3至10(特別是3、4、5、6或7)個環(huán)碳原子。環(huán)烷基的具體實例是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、螺[4,5]癸基、降冰片基(norbornyl)、環(huán)己基、環(huán)戊烯基、環(huán)己二烯基、十氫化萘基、雙環(huán)[4.3.0]壬基、四氫萘基、金剛烷(即三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷)、環(huán)戊基環(huán)己基和環(huán)己-2-烯基。

術(shù)語“雜環(huán)烷基”是指如上定義的環(huán)烷基，其中一個或多個(優(yōu)選1、2或3)個環(huán)碳原子各自獨(dú)立地被氧、氮、硅、硒、磷或硫原子替代(優(yōu)選被氧、硫或氮原子)。這包括含有如nh這些原子的基團(tuán)。雜環(huán)烷基優(yōu)選具有1或2個環(huán)，其包含3至10(特別是3、4、5、6或7)個環(huán)原子(優(yōu)選選自c、o、n和s)。具體實例是哌啶基、脯氨?；?prolinyl)、咪唑烷基、哌嗪基、嗎啉基、六亞甲基四胺基(urotropinyl)、吡咯烷基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、四氫呋喃基和2-吡唑啉基以及內(nèi)酰胺、內(nèi)酯、環(huán)狀酰亞胺和環(huán)狀酸酐。

術(shù)語“芳基”是指含有一個或多個環(huán)的芳族基團(tuán)，該環(huán)含有6至14個環(huán)碳原子，優(yōu)選6至10(特別是6)個環(huán)碳原子。實例是苯基、萘基和聯(lián)苯基。

術(shù)語“雜芳基”是指含有一個或多個環(huán)的芳族基團(tuán)，該環(huán)含有5至14個環(huán)原子，優(yōu)選5至10(特別是5或6)個環(huán)原子，并且含有一個或多個(優(yōu)選1、2、3或4個)氧、氮、磷或硫環(huán)原子(優(yōu)選o、s或n)。這包括o、s或含n的基團(tuán)，如nh。實例是吡啶基(例如4-吡啶基)、咪唑基(例如2-咪唑基)、苯基吡咯基(例如3-苯基吡咯基)、噻唑基、異噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、噁二唑基(oxadiazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、吲哚基、吲唑基、四唑基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、噁唑基、異噁唑基、三唑基、四唑基、異噁唑基、吲唑基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并噻唑基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、吡咯基、嘌呤基、咔唑基、吖啶基、嘧啶基、2,3'-二呋喃基和吡唑基(例如3-吡唑基)。

如本文所用的術(shù)語“鹵素”或“鹵素原子”是指氟、氯、溴或碘。

術(shù)語“任選地取代的”是指基團(tuán)中一個、兩個、三個或更多個氫原子彼此獨(dú)立地被鹵素(例如氟、氯、溴或碘原子)和/或被例如oh、＝o、sh、so3h、nh2、n-烷基、nh-烷基、n3或no2基團(tuán)取代。該表達(dá)還指被一個、兩個、三個或更多個烷基、烯基或雜烷基(例如-och3、-och2ch3、-ch2nhch3和-ch2nh2)取代的基團(tuán)。這些基團(tuán)本身可以被取代。例如，烷基取代基可以被一個或多個鹵素原子取代(即可以是鹵代烷基)。術(shù)語“鹵代烷基”是指被一個或多個鹵素原子(如上定義)取代的烷基(如上定義)。鹵代烷基的具體實例是三氟甲基、二氯乙基、二氯甲基和碘乙基。

如本文所用，定義長度范圍界限的用詞如，例如“從1至5”指1至5的任何整數(shù)，即1、2、3、4和5。換句話說，明確提及的兩個整數(shù)定義的任何范圍意指包括并公開定義所述界限的任何整數(shù)以及包含在所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)。

優(yōu)選的式(i)化合物是其中x是c1、c2或c3烷基或c2或c3烯基(例如c2烷基或c2烯基)的那些。x也可以是c1烷基。

y可以是ch2。z可以是nh。z可以是o。z可以是ch2。

y可以是nh。y可以是o。

y和z都可以是nh。

y可以是ch2且z可以是nh。

z可以是ch2且y可以是nh。

y可以是ch2且z可以是o。

y可以是o且z可以是ch2。

r1可以是鹵素基團(tuán)(例如br)。r1可以是芳基。所述芳基可以是單環(huán)或雙環(huán)。所述芳基可以是苯基或萘基。

所述芳基可以被取代。所述取代基可以選自鹵素基團(tuán)和雜烷基。所述鹵素基團(tuán)可以是f，且所述雜烷基可以是o-烷基(例如och3或och2ch3)或氨基烷基(例如-ch2nh2或–ch2ch2nh2)。

r1可以是雜芳基。所述雜芳基可以是單環(huán)或雙環(huán)。所述雜芳基可以包括一個或多個氮原子。例如，所述雜芳基可以是吡唑、異噁唑、三唑、吡啶、嘧啶、喹啉、苯并咪唑或吲哚。所述雜芳基可以被取代。例如，所述取代基可以是鹵素基團(tuán)(例如f)或雜烷基(例如o-烷基，如-och3或och2ch3，或氨基烷基，如-ch2nh2或–ch2ch2nh2)。

r1可以是雜環(huán)烷基。所述雜環(huán)烷基可以包括一個或多個氮原子。所述雜環(huán)烷基可以是哌嗪。所述雜環(huán)烷基可以包括一個或多個氧原子。所述雜環(huán)烷基可以是嗎啉。所述雜環(huán)烷基可以被例如鹵素基團(tuán)(例如f)或雜烷基(例如o-烷基，例如-och3或och2ch3，或氨基烷基，例如-ch2nh2或–ch2ch2nh2)取代。

ar可以是芳基。所述芳基可以是苯基。ar可以是雜芳基。所述雜芳基可以包括一個或多個氮原子。所述雜芳基可以具有4或5個環(huán)碳原子。所述雜芳基可以是吡啶或嘧啶。

r2可以是h或oh。r2可以在對位。

本發(fā)明化合物的具體實例列于下表1中。

表1.本發(fā)明化合物的實例

在一個實施方式中，所述式(i)化合物選自來自上表1的化合物1-01、1-07、1-08、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-38和20。

在另一個實施方式中，所述式(i)化合物不包括來自上表1中的化合物sc-38。

在一個實施方式中，本發(fā)明的化合物是如本文所述的式(i)化合物，條件是該化合物不具有以下結(jié)構(gòu)：

在一個實施方式中，本發(fā)明的化合物是本文所述的式(i)化合物，條件是當(dāng)r1為芳基(特別是苯基)時，r1不被f取代。

本發(fā)明的化合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法合成。下面在方案1中給出常規(guī)合成。

方案1.本發(fā)明化合物的常規(guī)合成的示例

本發(fā)明的化合物可表現(xiàn)出高的抗增生活性，特別是對腦癌的高功效。具體地，在本文的實施例中，具體化合物顯示誘導(dǎo)凋亡并且也能夠穿過bbb。

式(i)化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥以及制劑和藥物組合物(包括式(i)化合物的混合物)的治療用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明還涉及包含治療有效量的式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或前藥以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。

“藥物載體、稀釋劑或賦形劑”包括但不限于任何生理緩沖的(即ph約7.0至7.4)介質(zhì)，包括合適的水溶性載體、常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、填料、固體載體、涂層、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑。合適的水溶性載體包括但不限于：鹽水、葡萄糖、玉米油、二甲亞砜和明膠膠囊。其它常規(guī)添加劑包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、粘結(jié)劑(如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、明膠)、崩解劑(如羧甲基纖維素鈉)和潤滑劑(如滑石粉或硬脂酸鎂)。

藥物組合物可以配制用于任何合適的給藥途徑，包括例如局部(例如透皮或眼部)、口服、面頰、鼻腔、陰道、直腸或腸胃外給藥。如本文所用的術(shù)語“腸胃外”包括皮下、皮內(nèi)、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌肉內(nèi)、脊髓、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、眼周、眶內(nèi)、滑膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射以及任何類似的注射或輸注技術(shù)。在某些實施方式中，適于口服使用或腸胃外使用的形式的組合物是優(yōu)選的。合適的口服形式包括：例如片劑、錠劑、糖錠、水性或油性的懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。對于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給藥，可以將一種或多種化合物與無菌水溶液組合，所述無菌水溶液優(yōu)選與受體血液等滲。這樣的制劑可以通過將固體活性成分溶解在含有生理上相容的物質(zhì)(如氯化鈉或甘氨酸)的水中，并使其具有與生理條件相容的緩沖ph以產(chǎn)生水溶液，并使所述溶液無菌的方法制備。所述制劑可以存在于單或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶或小瓶。合適的組分的實例描述于馬丁代爾-大藥典(theextrapharmacopoeia)(醫(yī)藥出版社(pharmaceuticalpress)，倫敦，1993年)和馬丁(編)，雷明頓的制藥科學(xué)(remington'spharmaceuticalsciences)。

對于增生性疾病的治療，本發(fā)明的生物活性化合物的劑量可以在寬范圍內(nèi)變化，并且可以根據(jù)個體需要進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的活性化合物通常以治療有效量施用。優(yōu)選的劑量范圍為每天每千克體重約0.1mg至約140mg(例如，每位患者每天約0.5mg至約7g)。日劑量可以以單一劑量或以多個劑量施用?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將根據(jù)所治療的宿主和特定給藥方式而變化。劑量單位形式通常含有約1mg至約500mg的活性成分。

然而，應(yīng)當(dāng)理解，任何特定患者的具體劑量水平將取決于多種因素，包括所用具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑和排泄速率、藥物組合(即用于治療患者的其他藥物)、進(jìn)行治療的特定病癥的嚴(yán)重程度以及不想要的增生細(xì)胞的位置。如果化合物在局部施用而不是全身施用，并且用于預(yù)防而不是用于治療，則劑量通常較低。這樣的治療可以根據(jù)需要盡可能多地給藥和經(jīng)治療醫(yī)師判斷在必要的時間段內(nèi)給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可能需要針對每個個體優(yōu)化待施用的式(i)化合物的劑量方案或治療有效量。

應(yīng)當(dāng)理解，治療不同疾病可能需要不同的劑量。藥物的有效量是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞計數(shù)、生長或大小統(tǒng)計地顯著降低的量。對本發(fā)明的藥物有反應(yīng)的腫瘤性疾病包括但不限于腦癌。

術(shù)語“治療有效量”或“有效量”是指導(dǎo)致預(yù)防、改善或修復(fù)增生性病癥癥狀的式(i)化合物的量。本發(fā)明化合物或藥物組合物的劑型和劑量可以通過參考已知的治療或預(yù)防方案容易地確定。

本發(fā)明優(yōu)選的化合物將具有一定的藥理學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)包括但不限于：口服生物利用度和bbb通透性，從而使得上述討論的優(yōu)選的口服劑型可以在體內(nèi)提供化合物的治療有效水平。

本發(fā)明的化合物優(yōu)選經(jīng)口或腸胃外給藥于患者(例如人)，并且存在于患者的至少一個體液或組織中。因此，本發(fā)明還提供了用于治療患有增生性疾病(包括癌癥，例如腦癌)的患者的方法。

術(shù)語“治療”、“治法”和“療法”在本文中用于指治療療法。因此，在本文上下文中，術(shù)語“治療”包括治愈和改善癌癥或其相關(guān)癥狀的嚴(yán)重性。

如果在施用本發(fā)明的化合物或藥物組合物后癌癥發(fā)展，“防止”或“預(yù)防”是指防止癌癥的發(fā)生或緩解癌癥的嚴(yán)重性。這完全防止臨床明顯的不期望的細(xì)胞增生的發(fā)生或者防止處于危險中的個體中不期望的快速細(xì)胞增生的臨床前明顯階段的發(fā)生。

患者可以包括但不限于：具有如本文所述的劑量的靈長類動物，特別是人類、馴養(yǎng)的伴侶動物(如狗、貓、馬)和家畜(如牛、豬、綿羊)。

本發(fā)明的化合物可用于治療和/或預(yù)防與細(xì)胞增生相關(guān)的病癥和病癥(包括癌癥，例如腦癌)。因此，本發(fā)明還涉及一種治療或預(yù)防患者的增生性疾病的方法，包括向患者施用治療有效量的式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、水合物或前藥。本發(fā)明還涉及治療有效量的式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、水合物或前藥用于治療或預(yù)防增生性病癥的用途。在本說明書中描述的任何實施方式中，本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防增生性病癥的藥物組合物。本發(fā)明還涉及治療有效量的式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或前藥在制備用于治療或預(yù)防增生性病癥的藥物中的用途。

當(dāng)用于治療或預(yù)防增生性病癥的方法中時，本發(fā)明還涉及式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、水合物或前藥。本發(fā)明還涉及具有用于治療或預(yù)防增生性病癥的活性成分的組合物，其中所述活性成分是式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、水合物或前藥。本發(fā)明還涉及含有式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、水合物或前藥的藥物組合物在治療或預(yù)防增生性病癥(如上所述)中的用途。在一個實施方式中，式(i)化合物基本上是組合物的唯一活性成分。在一個實施方式中，所述增生性病癥是癌癥。在一個實施方式中，癌癥是腦癌(例如實體瘤)。

本發(fā)明的式(i)化合物及其藥物組合物可用于治療或預(yù)防增生性疾病，優(yōu)選癌癥。本發(fā)明的化合物和組合物可用于治療多種癌癥(腫瘤)，包括但不限于：實體瘤，例如腦癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。

本發(fā)明可適用于治療的癌癥或腫瘤細(xì)胞的類型包括：例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌、胃腸癌(包括食管癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、與結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)的息肉、胰腺癌和膽囊癌)、腎上腺皮質(zhì)癌、產(chǎn)生acth的腫瘤、膀胱癌、腦癌(包括下文討論的那些)、尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、包括口腔癌和喉癌的頭頸癌、包括腎細(xì)胞癌的腎癌、肝癌、包括小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌的肺癌、惡性腹膜積液、惡性胸腔積液、包括惡性黑色素瘤的皮膚癌、人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的腫瘤進(jìn)展、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌和血管外皮細(xì)胞瘤、間皮瘤、卡波氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)、包括骨瘤和肉瘤(如纖維肉瘤和骨肉瘤)的骨癌、女性生殖道癌(包括子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、卵巢(生殖細(xì)胞)癌和卵巢卵泡中的實體瘤、陰道癌、外陰癌和子宮頸癌)、乳腺癌(小細(xì)胞和導(dǎo)管)、陰莖癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和維爾姆斯氏腫瘤(wilms'tumor)。在一個實施方式中，所述癌癥是原發(fā)的。在一個實施方式中，所述癌癥是轉(zhuǎn)移性的。在一個實施方式中，所述癌癥是良性的。在一個實施方式中，所述癌癥是惡性的。

在一個實施方式中，待治療和/或預(yù)防的增生性病癥是腦癌。所述腦癌可以選自：間變性星形細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤、脈絡(luò)叢癌、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、彌漫性內(nèi)分泌神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胚胎發(fā)育不良的神經(jīng)上皮瘤、室管膜腫瘤、纖維性星形細(xì)胞瘤、巨細(xì)胞成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、大腦膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤(oligoastrocytoma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodendroglioma)、視神經(jīng)鞘膜腦膜瘤、兒科室管膜瘤、纖維性星形細(xì)胞瘤、成松果體細(xì)胞瘤、松果體細(xì)胞瘤、多型的間變的成神經(jīng)細(xì)胞瘤、多形性黃色星形細(xì)胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、蝶骨嵴腦膜瘤、室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤、亞室管膜瘤和三邊視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。因此，優(yōu)選地，所述腦癌是腫瘤(優(yōu)選為實體瘤)。所述腦癌可以是原發(fā)性癌癥(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤或神經(jīng)鞘瘤)或轉(zhuǎn)移性癌癥(即由于身體其他部位的癌癥引起的腦癌，如黑素瘤或肺癌)。

或者或除此之外，所述化合物可以與其它試劑(例如化學(xué)治療或免疫刺激藥物或治療劑)組合施用。

術(shù)語“聯(lián)合療法”或“輔助治療”在定義本發(fā)明化合物和一種或多種其它藥劑的用途中意圖包括在一種方案中以順序方式施用每種藥劑，提供所述藥物組合的有益效果，并且還旨在包括以基本上同時的方式共同施用這些藥劑，例如以具有固定比例的這些活性藥劑的單一制劑或以每種藥劑的多個分開的制劑。

本發(fā)明的各種實施方式，一種或多種式(i)化合物可以與一種或多種其它治療劑組合配制或施用。因此，本發(fā)明的各種實施方式，一種或多種式(i)化合物可與手術(shù)和/或其它已知的治療或治療劑(如其他抗癌劑，特別是化學(xué)治療劑、放射治療劑和/或佐劑或預(yù)防劑)包括在聯(lián)合治療方案中。

在商業(yè)用途、臨床評估和臨床前開發(fā)中有大量可用的抗腫瘤藥物，可通過聯(lián)合藥物化療選擇其用于癌癥或其他腫瘤的治療。這種抗腫瘤藥物分為幾個主要的類別，即抗生素型藥、抗代謝藥、激素劑、免疫劑、干擾素型藥和各種各樣的藥物?；蛘?，可以使用其它抗腫瘤藥物(例如金屬基蛋白酶抑制劑)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)知可用于聯(lián)合療法的合適的藥物。合適的試劑列于例如默克索引(merckindex)，化學(xué)百科全書(anencyclopediaofchemicals)，藥物和生物制劑(drugsandbiologicals)，第12版編，1996。

聯(lián)合方案可以包括活性劑，其在每種情況下酌情一起、依次或間隔施用。包括本發(fā)明化合物的活性劑的組合可以是協(xié)同的。

式(i)化合物的共同給藥可以通過式(i)化合物與化療劑或其他抗癌劑在相同單位劑量中實現(xiàn)，或式(i)化合物和化療劑或其他抗癌劑可以單獨(dú)和分散的單位劑量存在，在相同或相似的時間給藥。順序給藥可以要求的任何順序，并且當(dāng)施用第二種或后來的化合物時，特別是在需要累積或協(xié)同效應(yīng)的情況下，可能需要存在第一種或初始的化合物的持續(xù)的生理作用。

對于各種應(yīng)用，本發(fā)明的化合物可以用同位素、熒光或發(fā)光標(biāo)記物、抗體或抗體片段、任何其他親和標(biāo)記(如納米抗體、適體、肽等)、酶或酶底物進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的這些被標(biāo)記的化合物用于在體內(nèi)、離體、體外和原位(例如在組織切片中)通過放射自顯影定位受體的位置，以及作為正電子發(fā)射斷層掃描(pet)成像、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描(spect)等的放射性示蹤劑，以在活體或其他材料中表征那些受體。本發(fā)明的被標(biāo)記的化合物可用于治療、診斷和其它應(yīng)用，例如體內(nèi)和體外的研究工具，特別是本文公開的應(yīng)用。

應(yīng)當(dāng)理解，在本說明書中公開和定義的發(fā)明延伸到文本或附圖中提到或顯而易見的兩個或更多個個別特征的所有替代組合。所有這些不同的組合構(gòu)成了本發(fā)明的各種替代方面。

現(xiàn)在將參考實施例來更詳細(xì)地討論本發(fā)明的實施方式，這些實施例僅為了舉例并且不應(yīng)以任何方式認(rèn)為其限制本發(fā)明的范圍。

實施例

所有化學(xué)藥品均從sigma-aldrich(圣路易斯,密蘇里州,美國)獲得，除了購自frontiersscientific(洛根,猶他州,美國)的硼酸。使用cem-discover微波反應(yīng)器(坎普-林特福爾特，德國)進(jìn)行微波照射。在bruker“avance300”300mhznmr光譜儀(bruker公司，比爾里卡，馬薩諸塞州，美國)上獲得¹h-nmr光譜。d6-dmso或cdcl3得自劍橋同位素實驗室。在設(shè)有安捷倫1260無限二進(jìn)制泵(agilent1260infinitybinarypump)和集成真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器和二極管陣列檢測器(安捷倫科技，圣克拉拉，加利福尼亞，美國)的安捷倫系列1200lc系統(tǒng)上進(jìn)行高效液相色譜。使用40分鐘內(nèi)0至100％梯度的乙腈：水在安捷倫c18柱(粒徑：5μm，150×4.6mm內(nèi)徑)上以0.2ml/分的流速分析樣品。使用安捷倫6120四極桿質(zhì)譜儀分析洗脫樣品。使用安捷倫openlab色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)(cds)化學(xué)工作站版(chemstationedition)用于數(shù)據(jù)采集和處理。

從細(xì)胞信號技術(shù)(cellsignalingtechnology)公司(丹弗斯，馬薩諸塞州，美國)獲得針對bcl-2、parp(#95425)、第二抗兔(#7074)和抗小鼠(#7076)hrp連接的抗體的一抗。egfr(#sc03)和gapdh(#sc737179)抗體來自圣克魯斯生物技術(shù)(santacruzbiotechnology)公司(達(dá)拉斯，得克薩斯州，美國)。針對β-微管蛋白的抗體(#ab11308)購自艾博抗公司(abcam)。alexa488綴合的抗小鼠二抗和dapi(4’,6’-二氨基-2-苯基吲哚)來自生命科技公司(lifetechnologies)。cmpd1(#sc-203138)獲自圣克魯斯生物技術(shù)(santacruzbiotechnology)。紫杉醇和長春堿購自西格瑪公司(sigma)。

合成

化合物的制備另見方案1。

4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸4

將琥珀酸酐3(5.0g，50mmol)和溴苯2(48g，300mmol)冷卻至0℃。加入氯化鋁(13.3g，100mmol)，混合物在0℃，氮?dú)夥障聰嚢?小時。使反應(yīng)溫?zé)嶂潦覝?，并在氮?dú)夥障聰嚢?6小時。將反應(yīng)冷卻至0℃，加入濃hcl(125ml)，并在氮?dú)庀略贁嚢?小時。將反應(yīng)物過濾并用水(1l)洗滌以得到淺黃色固體，將其從甲苯中重結(jié)晶得到4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸4(12g，46.68mmol，93.4％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c10h9bro3計算：255.97,257.97；發(fā)現(xiàn)：258.0(11),257.0(98),256.0(12),255.0(100),213.0(18),211.0(17)(負(fù)離子).

hplc:tr＝24.4分鐘

¹hnmr(500mhz,d6-dmso)δ:2.59(2h,t,j＝6.5hz,ch2),3.21(2h,t,j＝6.5hz,ch2),7.88(2h,d,j＝8.8hz,arh),7.96(2h,d,j＝8.8hz,arh),12.19(1h,brs,oh)。

4-(4-溴苯基)丁酸5

將鋅(13.0g，200mmol)和氯化汞(1.00g，480mmol)與水(10ml)和濃hcl(0.6ml)一起攪拌5分鐘。傾出液體，連續(xù)加入甲苯(20ml)、濃hcl(20ml)和水(8ml)。加入4-(4-溴苯基)-4-氧代丁酸4(2.55g，10.5mmol)，在100℃加熱回流24小時，每6小時加入hcl(1ml)。使反應(yīng)冷卻至室溫，過濾并從有機(jī)層中除去溶劑，得到透明液體，冷卻后得到白色晶體。用硅膠色譜(乙酸乙酯：己烷，1:3)純化，得到4-(4-溴苯基)丁酸5(2.33g，9.63mmol，91.4％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c10h11bro2計算：241.99,243.99；發(fā)現(xiàn)：244.0(10),243.0(98),242.0(11),241.0(100)(負(fù)離子).

hplc:tr＝27.7分鐘

¹hnmr(300mhz,cdcl3)(δ/ppm)7.40(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.06(2h,d,j＝8.4hz,arh),2.63(2h,t,j＝7.8hz,ch2),2.36(2h,t,j＝7.2hz,ch2),1.97,(2h,dt,j＝7.2,7.8hz,ch2),未觀測到oh。

4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7(1-17)

將4-(4-溴苯基)丁酸4(0.5g，2.07mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)(1.07g，2.07mmol)溶于二甲基甲酰胺(10ml)中。加入二異丙基乙胺(710μl，4.14mmol)，在0℃下攪拌反應(yīng)30分鐘。加入4-氨基苯酚6(0.269mg，2.48mmol)，在室溫下攪拌反應(yīng)12小時。反應(yīng)物用水(90ml)稀釋，并用二氯甲烷(3×50ml)萃取產(chǎn)物。除去溶劑，產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度35:65至60:40)純化，得到4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7，為白色固體(350mg，1.05mmol，51％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c16h16brno2計算：333.04,335.04；發(fā)現(xiàn)：334.0(100),335.0(18),336.0(93),337.0(17).

hplc:tr＝28.2分鐘

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.59(1h,brs,nh),9.15(1h,brs,oh),7.47(2h,d,j＝8.1hz,arh),7.33(2h,d,j＝9.0hz,arh),7.18(2h,d,j＝8.4hz,arh),6.67(2h,d,j＝8.7hz,arh),2.59(2h,t,j＝7.8hz,ch2),2.24(2h,t,j＝7.2hz,ch2),1.85(2h,dt,j＝7.2,7.8hz,ch2)。

4-(4-(2-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺10(1-18)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7(100mg，0.3mmol)、(2-氟吡啶-3-基)硼酸8(50.9mg，0.361mmol)、碳酸鈉(63.8mg，0.6mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(17mg，0.015mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾?，并在密封管中?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度45:100至60:40)純化，得到4-(4-(2-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺10，為灰白色固體(40mg，0.11mmol，38％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c21h19fn2o2計算：350.14；發(fā)現(xiàn)：351.2(100),352.2(24).

hplc:tr＝26.1分鐘.

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.61(1h,brs,nh),9.12(1h,brs,oh),8.23(1h,d,j＝2.4hz,arh),8.09(1h,tt,j＝8.4hz,2.4,arh),7.54(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.47(4h,d,j＝8.7hz,arh),7.44(1h,d,j＝4.2hz,arh),6.68(2h,d,j＝8.7hz,arh),2.68(2h,t,j＝7.8hz,ch2),2.30(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.93(2h,dt,j＝7.8,7.5hz,ch2)。

4-(4-(2,6-二氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺12(1-22)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7(100mg，0.3mmol)、(2,6-二氟吡啶-3-基)硼酸11(50.9mg，0.36mmol)、碳酸鈉(63.8mg，0.6mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(17mg，0.015mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾撸⒃诿芊夤苤性?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度25:100至50:50)純化，得到4-(4-(2,6-二氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺12，為灰白色固體(30mg，0.08mmol,27％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c21h18f2n2o2計算：368.13；發(fā)現(xiàn)：369.1(100),370.1(23).

hplc:tr＝28.6分鐘.

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.62(1h,brs,nh),9.17(1h,brs,oh),8.29(1h,dt,j＝7.5,5.0hz,arh),7.52(2h,d,j＝6.6hz,arh),7.35(4h,m,arh),7.27(1h,dd,j＝8.4,2.7hz,arh),6.67(2h,d,j＝9hz,arh),2.67(2h,t,j＝7.8hz,ch2),2.29(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.91(2h,dt,j＝7.8,7.5hz,ch2)。

4-(4-(6-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺14(1-21)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7(100mg，0.299mmol)、(6-氟吡啶-3-基)硼酸13(50.96mg,0.359mmol)、碳酸鈉(63.8mg，0.600mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(17mg，0.015mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾撸⒃诿芊夤苤性?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度25:100至50:50)純化，得到4-(4-(6-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺14，為灰白色固體(30mg,0.09mmol,29％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c21h19fn2o2計算：350.14；發(fā)現(xiàn)：351.1(100),352.1(23).

hplc:tr＝26.8分鐘.

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.61(1h,brs,nh),9.16(1h,brs,oh),8.52(1h,d,j＝2.4hz,arh),8.25(1h,tt,j＝8.4hz,2.4,arh),7.64(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.34(4h,d,j＝8.7hz,arh),7.26(1h,dd,j＝4.2,3.0hz,arh),6.66(2h,d,j＝8.7hz,arh),2.66(2h,t,j＝7.8hz,ch2),2.28(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.90(2h,dt,j＝7.8,7.5hz,ch2)。

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(吡啶-3-基)苯基)丁酰胺16(1-38)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7(100mg，0.3mmol)、吡啶-3-基硼酸15(67.1mg,0.36mmol)、碳酸鈉(63.8mg，0.6mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(17mg，0.015mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾?，并在密封管中?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度25:100至50:50)純化，得到n-(4-羥基苯基)-4-(4-(吡啶-3-基)苯基)丁酰胺16，為灰白色固體(40mg,0.11mmol,35％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c21h20n2o2計算：332.15；發(fā)現(xiàn)：333.2(100),334.1(23).

hplc:tr＝17.3分鐘.

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.62(1h,brs,nh),9.16(1h,brs,oh),8.88(1h,s,arh),8.55(1h,d,j＝4.5hz,arh),8.05(1h,d,j＝7.8hz,arh),7.66(2h,d,j＝7.8hz,arh),7.48(1h,q,j＝4.8hz,arh),7.35(4h,d,j＝8.4hz,arh),6.67(2h,d,j＝8.7),2.68(2h,t,j＝6.9hz,ch2),2.29(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.92(2h,dt,j＝6.9,7.5hz,ch2)。

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(2-甲氧基嘧啶-5-基)苯基)丁酰胺18(1-19)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺7(100mg，0.299mmol)、(2-甲氧基嘧啶-5-基)硼酸17(55.25mg,0.359mmol)、碳酸鈉(63.8mg，0.600mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(17mg，0.015mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾?，并在密封管中?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。反應(yīng)通過薄層色譜法確定具有低轉(zhuǎn)化率，因此用如前所述微波照射再加熱20分鐘。除去溶劑，產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度25:100至50:50)純化，得到4-(4-(6-氟吡啶-3-基)苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺18，為灰白色固體(3mg，0.08mmol，3％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c21h21n3o3計算：363.16；發(fā)現(xiàn)：364.2(100),365.2(24).

hplc:tr＝24.3分鐘.

4-(4-溴苯基)-n-苯基丁酰胺20

將4-(4-溴苯基)丁酸5(0.5g，2mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)(1.07g，2.07mmol)溶于二甲基甲酰胺(10ml)中。加入二異丙基乙胺(710μl，4.14mmol)，在0℃下攪拌反應(yīng)30分鐘。加入苯胺19(225.0μl，2.47mmol)，將反應(yīng)物在室溫下攪拌12小時。然后將反應(yīng)物用水(90ml)稀釋，產(chǎn)物用二氯甲烷(3×50ml)萃取。除去溶劑，產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度20:80至40:60)純化，得到4-(4-溴苯基)-n-苯基丁酰胺20，為白色固體(500mg,1.57mmol,76％)。

ms(esi-四極桿)m/z:c16h16brno計算：317.04,319.04；發(fā)現(xiàn)：318.1(100),319.1(19),320.1(96),321.1(17),340.0(33),341.0(6),342.0(33),343.0(5).

hplc:tr＝35.7分鐘.

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.85(1h,brs,nh),7.57(2h,d,j＝7.5hz,arh),7.46(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.27(2h,t,j＝8.1hz,arh),7.18(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.01(1h,t,j＝7.2hz,arh),2.60(2h,t,j＝7.2hz,ch2),2.30,(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.87(2h,dt,j＝7.2,7.5hz,ch2)。

4-(4-(2-氟吡啶-3-基)苯基)-n-苯基丁酰胺21(1-20)

將4-(4-溴苯基)-n-苯基丁酰胺20(100mg，0.314mmol)、(2-氟吡啶-3-基)硼酸8(52.8mg,0.377mmol)、碳酸鈉(66.7mg，0.628mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(17mg，0.015mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾?，并在密封管中?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度30:100至60:40)純化，得到4-(4-(2-氟吡啶-3-基)苯基)-n-苯基丁酰胺21，為黃色固體(30mg,0.11mmol,38％)。

ms(esi-四極桿)m/z：c21h19fn2o:334.15；發(fā)現(xiàn)335.2(100),336.2(23),357.2(14).

hplc:tr＝31.1分鐘.

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.85(1h,brs,nh),8.22(1h,d,j＝4.8hz,arh),8.09(1h,ddd,j＝10.2,4.8,1.8hz,arh),7.56(4h,m,arh),7.36(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.28(2h,t,j＝8.4hz,arh),7.01(1h,t,j＝7.2hz,arh),2.68(2h,t,j＝7.5hz,ch2),2.35,(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.94(2h,q,j＝7.5,7.5hz,ch2)。

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(嘧啶-5-基)苯基)丁酰胺(1-01)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺(100mg，0.3mmol)、嘧啶-5-基硼酸(44.8mg,0.361mmol)、碳酸鈉(64mg，0.6mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(21mg,0.018mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾?，并在密封管中?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱10分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(乙酸乙酯：己烷，梯度35:75至85:15)純化，得到n-(4-羥基苯基)-4-(4-(嘧啶-5-基)苯基)丁酰胺，為灰白色固體(20mg,0.06mmol,20％)。

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.61(1h,brs,nh),9.16(1h,brs,oh),9.13(3h,m,arh),7.74(2h,d,j＝8.1hz,arh),7.38(4h,m,arh),6.66(2h,d,j＝8.7hz,arh),2.68(2h,t,j＝7.2hz,ch2),2.29(2h,t,j＝7.2hz,ch2),1.92(2h,m,ch2)。

4-(4'-(氨基甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)-n-(4-羥苯基)丁酰胺(1-07)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺(101mg,0.3mmol)、(4-(氨基甲基)苯基)硼酸(71mg，0.38mmol)、叔丁醇鉀(75mg，0.45mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(27mg,0.02mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾撸⒃诿芊夤苤性?30℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱30分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過硅膠色譜法(甲醇：二氯甲烷，梯度5:95至15:85)純化，得到4-(4'-(氨基甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺，為灰白色固體(30mg,0.08mmol,30％)。

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.62(1h,brs,oh),7.57(4h,m,arh),7.34(6h,m,arh),6.67(2h,d,j＝8.7hz,arh),3.75(2h,s,ch2),2.64(2h,t,j＝7.5hz,ch2),2.28(2h,t,j＝7.5hz,ch2),1.896(2h,m,ch2)。

n-(4-羥基苯基)-4-(4-(喹啉-3-基)苯基)丁酰胺(1-08)

將4-(4-溴苯基)-n-(4-羥基苯基)丁酰胺(105mg,0.31mmol)、喹啉-3-基硼酸(65mg，0.38mmol)、碳酸鈉(55mg，0.52mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(21mg,0.018mmol)溶于乙醇：水(4:1v/v，2ml)中。將溶液用氮?dú)獯祾?，并在密封管中?20℃下用微波照射(動力調(diào)節(jié)50w起始，壓力不受控制)加熱60分鐘。將反應(yīng)冷卻，除去溶劑，得到黃色固體。產(chǎn)物通過快速硅膠色譜(乙酸乙酯：己烷，60分鐘內(nèi)梯度0：100至100：0)純化，得到n-(4-羥基苯基)-4-(4-(喹啉-3-基)苯基)丁酰胺，為灰白色固體(30mg，0.08mmol，25％)。

¹hnmr(400mhz,d6-dmso)(δ/ppm)9.61(1h,brs,nh),9.25(1h,s,arh),9.11(1h,brs,oh),8.62(1h,s,arh),8.05(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.82(2h,d,j＝8.4hz,arh),7.77(1h,t,j＝8.0hz,arh),7.61(1h,m,arh),7.38(4h,m,arh),6.67(2h,d,j＝8.8hz,arh),2.70(2h,t,j＝7.6hz,ch2),2.31(2h,t,j＝7.6hz,ch2),1.95(2h,m,ch2)。

生物學(xué)評價

u87和u251細(xì)胞系通過澳大利亞細(xì)胞銀行(cellbank)從歐洲細(xì)胞株/微生物保藏中心(europeancollectionofcellcultures)(ecacc)獲得。從其原籍實驗室獲得u87-egfrviii細(xì)胞系(nishikawa等人，1994，procnatlacadsciusa91：7727-7731)，并通過免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測egfr擴(kuò)增和突變。細(xì)胞在37℃和5％co2下在補(bǔ)充有10％fbs(西格瑪-奧德里奇)的dmem培養(yǎng)基(生命科技公司的英杰生命技術(shù)有限公司(invitrogenbylifetechnologies)，卡爾斯巴德，加利福尼亞，美國)中培養(yǎng)。原發(fā)性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤球(rn1，經(jīng)典的；wk1，間充質(zhì)的)衍生自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本(day等，2013，癌癥5：357-371；day等人，2013，癌細(xì)胞23：238-248)，保持在補(bǔ)充有egf和fgf(均為生命科技公司)的stempronsc無血清培養(yǎng)基中，并在基質(zhì)膠包被的燒瓶上生長(pollard等人，2009，細(xì)胞干細(xì)胞(cellstemcell)4：568-580)。

本發(fā)明化合物的ec50值。

在處理72小時后使用阿爾瑪藍(lán)(alamarblue)測定法確定細(xì)胞活力(表2)。在graphpadprism版本5上使用非線性回歸計算ec50值。使用chembiodraw軟件計算clogp值。結(jié)果是一式三份的三次獨(dú)立實驗的平均值±sem。

表2.本發(fā)明化合物的ec50值

進(jìn)一步分析

如圖1所示，sc-38降低了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的活力，并且是選擇性細(xì)胞毒性的。用sc-38(10nm-10μm)處理細(xì)胞72小時。將細(xì)胞進(jìn)行活力測試(左，阿爾瑪藍(lán)活力測定，英杰公司)和收獲的上清液用于生物發(fā)光細(xì)胞毒性分析(右，toxilight^tm生物測定試劑盒，龍沙集團(tuán)(lonza))。

如圖2所示，sc-38對惡性細(xì)胞是選擇性有毒的。細(xì)胞用sc-38(1μm)處理72小時，并進(jìn)行活力測定(阿爾瑪藍(lán)，mtt或pi染色)以確定惡性(u87，原發(fā)性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤)和非惡性(小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)細(xì)胞的活力。

如圖3所示，化合物1-18容易穿過bbb。balb/c小鼠腹腔內(nèi)注射測試的抑制劑(10mg/kg)，并在30分鐘和60分鐘收集腦。使用腦勻漿物進(jìn)行固相萃取，并用hplc測定測試化合物的量。拉帕替尼(lapatinib)數(shù)據(jù)來自polli，j.w.等人，“外排和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在n-{3-氯-4-[(3-氟芐基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲基磺?；?乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(gw572016，拉帕替尼)處方和藥物相互作用中的作用(theroleofeffluxanduptaketransportersinn-{3-chloro-4-[(3-fluorobenzyl)oxy]phenyl}-6-[5-({[2-(methylsulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-quinazolinamine(gw572016,lapatinib)dispositionanddruginteractions)”，藥物代謝與處置(drugmetabolismanddisposition)36,695-701(2008)。

如圖4所示，sc-38誘導(dǎo)u87和u87viii細(xì)胞凋亡。u87(圖4，a-b)和u87viii(圖4，c-d)細(xì)胞用sc-38處理48小時，并用annexin-fitc/7-aad染色。使用muse細(xì)胞分析儀(密理博公司)顯現(xiàn)凋亡細(xì)胞。結(jié)果是3次獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試計算統(tǒng)計顯著性(**p<0.01,***p<0.001)。

還進(jìn)行了用sc-38處理后的u87和u87viii細(xì)胞中parp切割的蛋白質(zhì)印跡分析(參見圖5)。u87(泳道1-3)和u87viii(泳道4-6)細(xì)胞用1和5μm的sc-38處理48小時。顯示3個獨(dú)立實驗的代表性印跡(圖5a)。gapdh用作加載對照。定量化parp切割并將其對gapdh進(jìn)行歸一化(表示為倍數(shù)變化)，參見圖5b。結(jié)果是來自3個獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,***p<0.001,****p<0.0001)。

如圖6所示，化合物1-08在u87和u87viii細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用化合物1-08處理u87(圖6，a-b)和u87viii(圖6，c-d)細(xì)胞48小時，并用annexin-fitc/7-aad染色。使用muse細(xì)胞分析儀(密理博公司)顯現(xiàn)凋亡細(xì)胞。結(jié)果是來自三個獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試計算統(tǒng)計顯著性(***p<0.001)。

化合物1-08處理u87和u87viii細(xì)胞后，還進(jìn)行了細(xì)胞中parp切割的蛋白質(zhì)印跡分析(圖7)。u87(泳道1-3)和u87viii(泳道4-6)細(xì)胞用1和5μm化合物1-08處理48小時。顯示3個獨(dú)立實驗的代表性印跡(參見圖7a)。gapdh用作加載對照。定量化parp切割并將其對gapdh進(jìn)行歸一化(表示為倍數(shù)變化)，參見圖7b。結(jié)果是來自3個獨(dú)立實驗的平均值±sem。先后使用單因素方差分析和dunnet后測試確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,****p<0.0001)。

還測試了在u87、u87viii和u251中sc-38處理對bcl-2家族蛋白的影響(參見圖8)。用sc-38(1和5μm)處理u87(泳道1-3)、u87viii(泳道4-6)和u251(泳道7-9)細(xì)胞24小時，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，其中使用gapdh作為加載對照。代表性印跡示于圖8a，并且對gapdh的量化歸一化示于圖8b-e中，顯示為倍數(shù)變化。結(jié)果是來自三次獨(dú)立實驗的平均值±sem，且使用不配對t-檢驗(unpairedt-test)確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001)。

還研究了在u87、u87viii和u251中化合物1-08處理對bcl-2家族蛋白的影響(參見圖9)。用化合物1-08(1和5μm)處理u87(泳道1-3)、u87viii(泳道4-6)和u251(泳道7-9)細(xì)胞24小時，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，其中g(shù)apdh用作加載對照。代表性印跡示于圖9a，且定量化示于圖9b-e，顯示為相對蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果為來自2次獨(dú)立實驗的平均值±sem，且使用未配對t-檢驗確定統(tǒng)計顯著性(*p<0.05,**p<0.01)。

化合物1-08在10和50μm下的激酶分布由proqinase公司(弗里堡,德國)進(jìn)行。使用放射蛋白激酶測定(活性測定)和非放射adp-glo^tm測定(普洛麥格公司(promega)，麥迪遜，威斯康辛，美國)分別測量387個蛋白激酶和13個脂質(zhì)激酶的激酶活性。結(jié)果顯示在表3中(僅列出前10個激酶，且在所有測試的激酶中選擇性評分描述抑制超過50％的激酶的部分)。

表3.化合物1-08的激酶組結(jié)果

在10μm時，化合物1-08以51％的水平抑制mertk。其他幾種激酶在50μm濃度下被抑制。

還研究了化合物1-08對微管蛋白聚合和有絲分裂紡錘體形成的影響。根據(jù)制造商的說明書，使用微管蛋白聚合測定試劑盒(cytoskeleton公司，科羅拉多州，美國)，在55μl的最終體積中進(jìn)行基于熒光的微管蛋白聚合測定。在37℃下將豬腦微管蛋白與測試化合物(紫杉醇、長春堿和化合物1-08)一起溫育，并使用fluostaromega酶標(biāo)儀(bmglabtech公司，奧爾滕貝格，德國；在355nm激發(fā)和在460nm發(fā)射)測量熒光。與對照相比，紫杉醇增強(qiáng)微管蛋白聚合，而長春堿和化合物1-08以劑量依賴性方式抑制微管蛋白聚合(圖10a)。為了測試化合物1-08是否在體內(nèi)改變微管，用化合物1-08處理u87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，并通過β-微管蛋白的免疫熒光染色測定對微管的影響?；衔?-08(1和5μm)對u87細(xì)胞的處理導(dǎo)致微管的分解(圖10b)和多核細(xì)胞數(shù)量的劑量依賴性增加(圖10b和10c)。由化合物13誘導(dǎo)的微管解聚的結(jié)果是擾亂的紡錘體組裝(圖10d)。在經(jīng)歷有絲分裂的未經(jīng)處理的u87細(xì)胞中，微管組裝成雙極紡錘體(對照圖)。然而，化合物1-08的處理導(dǎo)致有缺陷的紡錘體形成和染色體錯位。這些結(jié)果表明化合物1-08是破壞有絲分裂紡錘體形成并引起多核細(xì)胞形成的微管蛋白解聚劑。

還研究了sc-38和化合物1-08、1-18和1-38在采用取自患者的神經(jīng)膠質(zhì)瘤球的細(xì)胞活力測定中的作用。代表經(jīng)典亞型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的rn1神經(jīng)膠質(zhì)瘤球?qū)χ委煼磻?yīng)最為敏感(圖11，其中sc-38被稱為“cmpd1”，化合物1-08被稱為“化合物13”，化合物1-18被稱為“化合物7”，和化合物1-38被稱為“化合物10”)。sc-38和化合物1-08減弱rn1神經(jīng)膠質(zhì)瘤球的活力，ec50分別為0.26和0.54μm(圖11a)。sc-38也有效地減弱間充質(zhì)wk1神經(jīng)膠質(zhì)瘤球的生長(ec50＝0.91μm，圖11b)。在間充質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤球中，當(dāng)與化合物1-08(ec50＝3.82μm)相比時，化合物1-18更有效(ec50＝2μm)。