本實用新型屬于生物工程實驗儀器設(shè)備的技術(shù)領(lǐng)域，涉及屬于PCR試劑的擴(kuò)增、熒光測量檢測技術(shù)，更具體地說，本實用新型涉及核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)的數(shù)據(jù)處理一體化的檢測裝置。

背景技術(shù)：

PCR技術(shù)(DNA Polymerase Chain Reaction：DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，最早是Khorana于1971年提出這個設(shè)想。美國科學(xué)家Kary Mullis等在1985年實現(xiàn)了這個設(shè)想，發(fā)明了具有劃時代意義的PCR技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)可以在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因在數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，便于肉眼能直接觀察和判斷。由于這種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，因此得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)可，Kary Mullis也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。

PCR是最常用的分子生物學(xué)手段之一。除去在基礎(chǔ)科研的領(lǐng)域，PCR在醫(yī)學(xué)臨床診斷、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)工程、遺傳科學(xué)、農(nóng)業(yè)選種育鐘研發(fā)，以及刑事檢定甄別中都是必不可少的，也是最權(quán)威可靠的技術(shù)。

DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：是通過熱循環(huán)反應(yīng)來擴(kuò)增DNA的技術(shù)。熱循環(huán)是指在固定的時間間隔內(nèi)溫度變化的循環(huán)。采用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，PCR可以用DNA的合成原料，脫氧核苷三磷酸合成大量的DNA拷貝。PCR反應(yīng)包括三步：變性、退火和延伸。變性是PCR循環(huán)的第一步，它將DNA堿基之間的氫鍵打開來熔解DNA雙鏈而產(chǎn)生單鏈DNA。退火則是將溫度降到足夠低，使寡聚核苷酸引物能夠結(jié)合到DNA模板上。在延伸過程中，DNA聚合酶將合成新的雙鏈DNA。經(jīng)多次熱循環(huán)后(每一循環(huán)擴(kuò)增一倍)，微量的DNA將得以擴(kuò)增到儀器檢測的濃度。

通常的PCR檢測技術(shù)有兩種：

第一種是多循環(huán)聚合反應(yīng)后，終產(chǎn)物(end-point analysis)由DNA電泳膠來檢測定量。缺點是因受電泳技術(shù)靈敏度的限制，這種方法只是“半定量”。

第二種方法是：利用熒光標(biāo)記的探針(fluorescent probes)，實時監(jiān)測聚合反應(yīng)在每一循環(huán)的產(chǎn)量變化。起始要擴(kuò)增模板的數(shù)量可由cycle threshold(Ct)值來推算得出。Ct值就是當(dāng)熒光值明顯高于背景本底時的循環(huán)數(shù)。

目前市場上銷售的real-time PCR試劑主要是基于熒光探針的TaqMan和基于SYBR Green 染料嵌合來測DNA雙鏈總量的兩種技術(shù)。該方法的局限在于：1、需要外源標(biāo)準(zhǔn)樣品或者內(nèi)源基因來標(biāo)準(zhǔn)化以繪定標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、非特異反應(yīng)引起的擴(kuò)增將影響Ct值的可信度。

研究人員發(fā)現(xiàn)以下三因子與聚合反應(yīng)成功與否有相關(guān)性：1、樣品的有限稀釋度；2、終產(chǎn)物總量；3、產(chǎn)物量與起始DNA濃度的帕松分布(Poisson distribution)關(guān)系。

通過調(diào)控和測量上述因子就可以推算出起始DNA的樣本濃度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型提供一種核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)的數(shù)據(jù)處理一體化檢測裝置，其目的是實現(xiàn)其檢測方法的更加方便、快捷和準(zhǔn)確。

為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型采取的技術(shù)方案為：

本實用新型的核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)檢測裝置，包括聚合反應(yīng)系統(tǒng)，所述的檢測裝置設(shè)置微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)，所述的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)由超聲波振動系統(tǒng)驅(qū)動；所述的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)上設(shè)置多個加樣孔；所述的超聲波振動系統(tǒng)產(chǎn)生振蕩，使所述的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)中的PR樣品與油滴混合形成油包裹微液滴后進(jìn)入所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)。

所有所述的加樣孔的規(guī)格一致，且每個所述的加樣孔均設(shè)有油庫、樣品庫和微液滴庫。所述的油庫、樣品庫和微液滴庫均為圓筒形，三者之間通過管道連接。

所述的檢測裝置設(shè)置智能溫控系統(tǒng)；所述的智能溫控系統(tǒng)對所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)的溫度進(jìn)行實時控制。

所述的智能溫控系統(tǒng)包括溫度采集器、溫度傳感器、單片機(jī)、多路模擬開關(guān)、A/D轉(zhuǎn)換器、D/A轉(zhuǎn)換器和顯示器。所述的溫度采集器、溫度傳感器集成為一個芯片固定裝置；所述的單片機(jī)通過信號線路與A/D轉(zhuǎn)換器、D/A轉(zhuǎn)換器和顯示器連接；所述的A/D轉(zhuǎn)換器與多路模擬開關(guān)通過信號線路連接；所述的D/A轉(zhuǎn)換器與驅(qū)動電路通過信號線路連接；所述的多路模擬開關(guān)和驅(qū)動電路均與芯片固定裝置連接。

所述的檢測裝置設(shè)置激光發(fā)射系統(tǒng)；所述的激光發(fā)射系統(tǒng)包含激光光源以及激發(fā)光整形器；所述的激發(fā)光整形器使得從所述的激光光源發(fā)出的線光源經(jīng)所述的激發(fā)光整形器整形后呈現(xiàn)一個面光源，對所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)的PR樣品進(jìn)行照射。

所述的檢測裝置設(shè)置熒光探測采集系統(tǒng)；所述的熒光探測采集系統(tǒng)包含和微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)相同孔數(shù)的探測器；所述的探測器探測方向與所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)的微通道一一對應(yīng)。

所述的檢測裝置設(shè)置信號分析系統(tǒng)，所述的熒光探測采集系統(tǒng)探測采集到的熒光信號傳送給所述的信號分析系統(tǒng)

所述的熒光探測采集系統(tǒng)包含光學(xué)透鏡、濾光片以及光電轉(zhuǎn)換器。

所述的檢測裝置設(shè)置廢液排出系統(tǒng)；所述的廢液排出系統(tǒng)為管狀，將反應(yīng)結(jié)束后的所有 廢液排除至廢液盒。

所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)包括微通道列、加熱絲；所述的加熱絲分別置于不同微通道列的底部；所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)按設(shè)定時間控制在不同的溫度區(qū)間進(jìn)行PR擴(kuò)增。

為了實現(xiàn)與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明目的，本實用新型還提供了以上所述的核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)的數(shù)據(jù)處理一體化檢測裝置的檢測方法，其技術(shù)方案是：

將油滴和PR樣本加入微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)，開啟超聲波振動系統(tǒng)，微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)開始振動，使油滴和PR樣本形成油包裹液滴并進(jìn)入聚合反應(yīng)系統(tǒng)；

然后開啟智能溫控系統(tǒng)，智能溫控系統(tǒng)使聚合反應(yīng)系統(tǒng)的溫度按設(shè)定時間控制在不同的溫區(qū)進(jìn)行PR擴(kuò)增；同時開啟激光發(fā)射系統(tǒng)和熒光探測采集系統(tǒng)，由信號分析系統(tǒng)進(jìn)行實時數(shù)據(jù)讀取和分析；

實驗結(jié)束后，開啟聚合反應(yīng)的閥門，使廢液從廢液排出系統(tǒng)流出，進(jìn)入廢液盒。

本實用新型采用上述技術(shù)方案，使微液滴的產(chǎn)生、聚合反應(yīng)以及熒光數(shù)據(jù)的讀取在一臺設(shè)備上進(jìn)行，避免了樣本的丟失，方便、準(zhǔn)確、快捷；溫控裝置可以對三個溫區(qū)進(jìn)行獨立設(shè)置，控制和實時顯示，能有效滿足對DNA進(jìn)行體外放大的溫度梯度的要求；易于快速實現(xiàn)PCR擴(kuò)增，顯著提高生物化學(xué)反應(yīng)的速度，既節(jié)省時間、提高了效率，又便于批量化、低成本生產(chǎn)；實現(xiàn)PCR擴(kuò)增循環(huán)微流控生物熒光進(jìn)行實時熒光信息反饋；減少了外圍設(shè)備，更加自動化、微型化，縮短了系統(tǒng)工作周期；避免了樣品信號采集的遺失。

附圖說明

附圖內(nèi)容及圖中標(biāo)記簡要說明如下：

圖1為本實用新型的微液滴流動型高通量核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)的數(shù)據(jù)處理一體化檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為圖1中的加樣孔示意圖；

圖3為圖1中的微通道列示意圖；

圖4為圖1中的激發(fā)光整形器示意圖；

圖5為圖1中的激光光源示意圖；

圖6是本實用新型中的智能溫控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中的標(biāo)記為：

A、微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)，B、超聲波振動系統(tǒng)，C、聚合反應(yīng)系統(tǒng)，D、智能溫控系統(tǒng)，E、激光發(fā)射系統(tǒng)，F(xiàn)、熒光探測采集系統(tǒng)，G、閥門，H、廢液排出系統(tǒng)，L、信號分析系統(tǒng)，M、廢液盒，a、加樣孔，b、微通道列，c、激發(fā)光整形器，d、激光光源，1、油庫，2、樣品庫，3、微液滴庫，4、微管道，5、短焦距透鏡，6、長焦距透鏡，7、激光電源，8、激光器，9、 光纖耦合器。

具體實施方式

下面對照附圖，通過對實施例的描述，對本實用新型的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員對本實用新型的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準(zhǔn)確和深入的理解。

如前所述，與聚合反應(yīng)成功與否有相關(guān)性的因素包括：1、樣品的有限稀釋度；2、終產(chǎn)物總量；3、產(chǎn)物量與起始DNA濃度的帕松分布(Poisson distribution)關(guān)系。通過調(diào)控和測量上述因子就可以推算出起始DNA的樣本濃度。

基于這一原理，本實用新型提供了如圖1所示的結(jié)構(gòu)，為一種微液滴流動型高通量核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)檢測裝置，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。該檢測裝置包括聚合反應(yīng)系統(tǒng)C。該檢測裝置涉及微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)、超聲波振動系統(tǒng)、聚合反應(yīng)系統(tǒng)、智能溫控系統(tǒng)、熒光探測采集分析系統(tǒng)和廢液排出系統(tǒng)等方面。該裝置包含了生物芯片技術(shù)、生物信息技術(shù)、計算機(jī)軟硬件技術(shù)以及微流控技術(shù)。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，實現(xiàn)核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)檢測裝置的檢測方法的方便、準(zhǔn)確、快捷發(fā)明目的，本實用新型采取的技術(shù)方案為：

如圖1所示，本實用新型的核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)檢測裝置，所述的檢測裝置設(shè)置微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A，所述的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A由超聲波振動系統(tǒng)B驅(qū)動；所述的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A上設(shè)置多個加樣孔a；所述的超聲波振動系統(tǒng)B產(chǎn)生振蕩，使所述的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A中的PCR樣品與油滴混合形成油包裹微液滴后進(jìn)入所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)C。

加樣孔a的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

超聲波振動系統(tǒng)B利用超聲波的高頻聲波產(chǎn)生振蕩。其實，該裝置不限于超聲波振動亦包含機(jī)械振動等各種振動方式。

微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A上設(shè)有256個加樣孔。系統(tǒng)上的加樣孔a可以是256個，也可以是96孔等不同數(shù)量。

所有所述的加樣孔a的規(guī)格一致，且每個所述的加樣孔a均設(shè)有油庫1、樣品庫2和微液滴庫3。所述的油庫1、樣品庫2和微液滴庫3均為圓筒形，三者之間通過管道連接。

管道為曲線形狀，液體在管道振動時，液滴在內(nèi)部流動，產(chǎn)生微液滴。

加樣孔a分為油庫和加樣槽，呈錐型，當(dāng)微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)振動時，PCR樣品和油庫內(nèi)的油進(jìn)行混合，產(chǎn)生油包裹微液滴。

如圖6所示，所述的檢測裝置設(shè)置智能溫控系統(tǒng)D；所述的智能溫控系統(tǒng)D對所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)C的溫度進(jìn)行實時控制。

所述的智能溫控系統(tǒng)D包括溫度采集器、溫度傳感器、單片機(jī)、多路模擬開關(guān)、A/D轉(zhuǎn)換器、D/A轉(zhuǎn)換器和顯示器。

所述的溫度采集器、溫度傳感器集成為一個芯片固定裝置；所述的單片機(jī)通過信號線路與A/D轉(zhuǎn)換器、D/A轉(zhuǎn)換器和顯示器連接；所述的A/D轉(zhuǎn)換器與多路模擬開關(guān)通過信號線路連接；所述的D/A轉(zhuǎn)換器與驅(qū)動電路通過信號線路連接；所述的多路模擬開關(guān)和驅(qū)動電路均與芯片固定裝置連接。

智能溫控系統(tǒng)D對聚合反應(yīng)系統(tǒng)C的溫度進(jìn)行實時控制。

所述的檢測裝置設(shè)置激光發(fā)射系統(tǒng)E；所述的激光發(fā)射系統(tǒng)E包含激光光源d以及激發(fā)光整形器c；所述的激發(fā)光整形器c使得從所述的激光光源d發(fā)出的線光源經(jīng)所述的激發(fā)光整形器c整形后呈現(xiàn)一個面光源，對所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)C的PCR樣品進(jìn)行照射。

激發(fā)光整形器c的結(jié)構(gòu)如圖4所示。激光光源d的結(jié)構(gòu)如圖5所示。

微管道4微通道是毛細(xì)血管裝液體通道，短焦距透鏡5在長焦距透鏡6的前面，二者之間的距離是二者的焦距之和；激光器8在短焦距透鏡5的前面，光纖耦合器9在短焦距透鏡5和激光器8之間。激光器8發(fā)出激光后通過光纖耦合器9對激光束進(jìn)行耦合，然后通過短焦距透鏡5和長焦距透鏡6進(jìn)行擴(kuò)束。

激光電源7為激光器8提供電源。

一個能夠發(fā)出連續(xù)的可見光的點狀發(fā)光源，如果它的光在空間中只向一個方向成線性傳播，那么這個發(fā)光點就被稱為線光源。

面光源是光束輸出后成一個面，而不是一條線。

所述的檢測裝置設(shè)置熒光探測采集系統(tǒng)F；所述的熒光探測采集系統(tǒng)F包含和微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A相同孔數(shù)的探測器；所述的探測器探測方向與所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)C的微通道一一對應(yīng)。

熒光檢測儀器是一個由電路、光路組成的多體系統(tǒng)，各個系統(tǒng)的協(xié)調(diào)配合實現(xiàn)穩(wěn)定檢測的基礎(chǔ)，是比較成熟的光學(xué)檢測設(shè)備。

所述的熒光探測采集系統(tǒng)F包含光學(xué)透鏡、濾光片以及光電轉(zhuǎn)換器。

所述的檢測裝置設(shè)置信號分析系統(tǒng)L，所述的熒光探測采集系統(tǒng)F探測采集到的熒光信號傳送給所述的信號分析系統(tǒng)L

所述的檢測裝置設(shè)置廢液排出系統(tǒng)H；所述的廢液排出系統(tǒng)H為管狀，將反應(yīng)結(jié)束后的所有廢液排除至廢液盒M。

所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)C包括微通道列b、加熱絲絕緣塑料；所述的加熱絲分別置于不同微通道列b的底部；所述的聚合反應(yīng)系統(tǒng)C溫度按設(shè)定時間控制在不同的溫度區(qū)間進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。

微通道列b的結(jié)構(gòu)如圖3所示。其中包括多個微管道4。

微通道列是毛細(xì)血管裝液體通道，加熱絲是曲線形金屬絲，加熱絲在微通道的下面。

綜上所述，本實用新型包括了：微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A、超聲波振動系統(tǒng)B、聚合反應(yīng)系統(tǒng)C、智能溫控系統(tǒng)D、激光發(fā)射系統(tǒng)D、熒光探測采集系統(tǒng)F、信號分析系統(tǒng)L和廢液排出系統(tǒng)H。

本實用新型的優(yōu)點是：

1、微液滴的產(chǎn)生、聚合反應(yīng)以及熒光數(shù)據(jù)的讀取在一個設(shè)備上進(jìn)行，避免了樣本的丟失，方便、準(zhǔn)確、快捷；

2、溫控裝置可以對三個溫區(qū)進(jìn)行獨立設(shè)置，控制和實時顯示，能有效滿足對DNA進(jìn)行體外放大的溫度梯度的要求；

3、易于快速實現(xiàn)PCR擴(kuò)增，顯著提高生物化學(xué)反應(yīng)的速度，即節(jié)省時間又提高了效率，便于批量化、低成本生產(chǎn)；

4、實現(xiàn)了PCR擴(kuò)增循環(huán)微流控生物熒光進(jìn)行實時熒光信息反饋；

5、減少了外圍設(shè)備，更加自動化、微型化，縮短了系統(tǒng)工作周期；

6、避免了樣品信號采集的遺失。

為了實現(xiàn)與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明目的，本實用新型還提供了以上所述的核糖核酸鏈?zhǔn)骄酆蠑U(kuò)增反應(yīng)檢測裝置的檢測方法，其技術(shù)方案是：

將油滴和PCR樣本加入微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A，開啟超聲波振動系統(tǒng)B，微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)A開始振動，使油滴和PCR樣本形成油包裹液滴并進(jìn)入聚合反應(yīng)系統(tǒng)C；

然后開啟智能溫控系統(tǒng)D，智能溫控系統(tǒng)D使聚合反應(yīng)系統(tǒng)C的溫度按設(shè)定時間控制在不同的溫區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時開啟激光發(fā)射系統(tǒng)E和熒光探測采集系統(tǒng)F，由信號分析系統(tǒng)L進(jìn)行實時數(shù)據(jù)讀取和分析；

實驗結(jié)束后，開啟聚合反應(yīng)的閥門G，使廢液從廢液排出系統(tǒng)H流出，進(jìn)入廢液盒M。

按照以上所述的方案，本實用新型的具體實現(xiàn)方式是：所述檢測裝置中的微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)上有256個加樣孔，利用超聲波的高頻聲波產(chǎn)生振蕩，使微液滴產(chǎn)生系統(tǒng)中的PCR樣品和油滴混合形成油包裹微液滴后進(jìn)入聚合反應(yīng)系統(tǒng)；通過溫控系統(tǒng)使聚合反應(yīng)系統(tǒng)的溫度按設(shè)定時間控制在不同的溫區(qū)(94℃、55℃、72℃)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；激光發(fā)射系統(tǒng)采用的是紫外光激發(fā)；熒光探測采集分析系統(tǒng)對樣品的熒光信號進(jìn)行收集、分析處理；實驗結(jié)束后廢液從廢液排出系統(tǒng)流出。

實驗結(jié)果表明：整個裝置可以實現(xiàn)微液滴的產(chǎn)生、聚合反應(yīng)、熒光數(shù)據(jù)的讀取分析以及 廢液排出等一系列功能，實驗方便、快捷。

上面結(jié)合附圖對本實用新型進(jìn)行了示例性描述，顯然本實用新型具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本實用新型的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實質(zhì)性的改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本實用新型的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本實用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。