本發(fā)明具體涉及新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：巖藻多糖是一種硫酸化的褐藻雜多糖，生物活性具有廣譜性[Fitton,J.H.,Stringer,D.N.,andKarpiniec,S.S.(2015).TherapiesfromFucoidan:AnUpdate.MarinDrugs13,5920-5946.]。然而，由于多糖制劑具有異質(zhì)性且多糖制劑不能被標(biāo)準(zhǔn)化，在醫(yī)學(xué)上幾乎是不可能使用聚合物分子的。因此，如何從巖藻多糖中提取具有固定結(jié)構(gòu)和標(biāo)準(zhǔn)特性的低聚糖就成了一個(gè)難題。使用酶實(shí)現(xiàn)巖藻多糖的解聚作用并且提取出具有生物活性低聚糖，為其在藥劑學(xué)和整容整形中使用這類化合物提供了新的可能[Kusaykin,M.I.,Silchenko,A.S.,Zakharenko,A.M.,andZvyagintseva,T.N.(2016).Fucoidanases.Glycobiology26,3-12]。在混合物中使用巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，用來預(yù)防或者治療特應(yīng)性皮炎和濕疹[RU2586776C2，2016年6月10日]、胃腸道感染[WO2016139333A1，2016年9月9日]的說法已經(jīng)得到公開發(fā)表。有人建議使用新型N-巖藻聚糖硫酸酯低聚糖刺激血管[RU2559629C2，2015年8月10日]，并且將新型硫酸化低聚糖衍生物作為高效肝素結(jié)合蛋白抑制劑[RU2483074C2，2013年5月27日]加以使用?，F(xiàn)已得知，巖藻糖基化低聚糖可用于保護(hù)植物免受病原體之害[US6984630B1，10.01.2006]。與多步驟采取有機(jī)合成的方法制取硫酸化低聚糖相比，從巖藻多糖中通過酶制劑制取類似的低聚糖的獨(dú)特之處在于：更簡單可行，制取低聚糖的步驟從數(shù)量上來說更少，得到的反應(yīng)產(chǎn)物得率更高。最初，我們通過酶的水解作用從枯墨角藻(Fucusevanescens)中獲取到的是巖藻多糖低聚糖。為達(dá)到這一結(jié)果，我們把巖藻多糖和從福爾摩沙藻類(Formosaalgae)海洋微生物中獲取的原生巖藻多糖FFA混合在一起，放入0.015M磷酸鈉緩沖液，pH值為7.2，并在25℃的溫度環(huán)境人工培養(yǎng)72h。用75％的乙醇水溶液沉淀出高分子水解產(chǎn)物，10,000g離心30min，將上清液放在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，蒸餾水復(fù)溶后將上清液倒入含有P-6生物凝膠柱中，用水平衡，然后以0.7mL/min的速率洗脫巖藻糖基化低聚糖。把低分子量的低聚糖集中起來，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮和再次色譜分離。其結(jié)果是，通常得到的是結(jié)構(gòu)為A和B的二糖[希爾欽科A.C.，福爾摩沙藻類海洋微生物KMM3553T和海洋軟體動物蜘蛛螺中的巖藻多糖和褐藻膠裂解酶：化學(xué)副博士學(xué)位答辯論文。俄羅斯國家科學(xué)院遠(yuǎn)東分院太平洋生物有機(jī)化學(xué)研究所，符拉迪沃斯托克，2014年，第69頁]。但是結(jié)構(gòu)為A和B的二糖，受限于分子中巖藻糖殘基的數(shù)量和種類，應(yīng)用范圍較小。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供了一種新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，該巖藻聚糖硫酸酯低聚糖中的巖藻糖殘基(固定結(jié)構(gòu))的數(shù)量為4個(gè)或6個(gè)，擴(kuò)大了具有固定結(jié)構(gòu)的巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的數(shù)量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的制備方法。該方法是利用酶制劑在銅藻巖藻多糖溶液中制取巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，更簡單可行，反應(yīng)產(chǎn)物的得率更高。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的應(yīng)用。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，包括由四個(gè)巖藻糖殘基依次連接而成的鏈，巖藻糖殘基由1→3和1→4交替發(fā)生化合，硫酸基分布在第二巖藻糖殘基的C2和C3上，以及第三巖藻糖殘基的C2上。優(yōu)選的，上述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖還包括側(cè)鏈，側(cè)鏈由兩種非硫酸化的巖藻糖殘基通過1→2糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈通過1→4糖苷鍵連接在第三巖藻糖殘基上。優(yōu)選的，所述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，選自以下兩種：上述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的制備方法，包括如下步驟：將重組巖藻多糖酶FFA1和銅藻巖藻多糖溶液在Tris-HCl緩沖液中混合，得到混合液，保溫反應(yīng)、加熱滅酶、分離，得到分子式I和II的巖藻聚糖硫酸酯低聚糖。有人通過其他已知的方法可以制取出重組巖藻多糖酶FFA1[希爾欽科A.C.，福爾摩沙藻類海洋微生物KMM3553T和海洋軟體動物蜘蛛螺中的巖藻多糖和褐藻膠裂解酶：化學(xué)副博士學(xué)位答辯論文。俄羅斯國家科學(xué)院遠(yuǎn)東分院太平洋生物有機(jī)化學(xué)研究所，符拉迪沃斯托克，2014年，第110頁]。優(yōu)選的，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為7.0-7.5。優(yōu)選的，所述重組巖藻多糖酶FFA1和銅藻巖藻多糖的質(zhì)量比為0.01％-0.03％。優(yōu)選的，所述培育的方法為，在25℃-38℃的溫度范圍內(nèi)，培育72-75h。優(yōu)選的，所述加熱滅酶的溫度為95-105℃，加熱時(shí)間為5-10min。優(yōu)選的，其中所述分離步驟包括用沉淀劑沉淀大分子水解產(chǎn)物的步驟，所述沉淀劑為75％的乙醇水溶液或75％的丙酮水溶液。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述分離步驟還包括將沉淀大分子水解產(chǎn)物得到的沉淀物離心提取的步驟。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述離心提取的條件為：9000-10000g，離心時(shí)間20-30min。優(yōu)選的，所述分離步驟包括將提取沉淀物后的上層清液倒入陰離子交換吸附柱中，進(jìn)行梯度洗脫的步驟。進(jìn)一步優(yōu)選的，在所述陰離子交換吸附柱中，以碳酸氫銨作為洗脫劑，以1ml/min的洗脫速度進(jìn)行梯度洗脫。所述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可藥用鹽在作為巖藻多糖酶、巖藻糖苷酶和硫酸酯酶的基質(zhì)中的應(yīng)用。所述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可藥用鹽在制備用于預(yù)防或治療特應(yīng)性皮炎和濕疹、胃腸道感染的藥物中的應(yīng)用。一種藥物組合物，其包含治療有效量的上述新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可藥用鹽。優(yōu)選的，上述藥物組合物，其進(jìn)一步包含可藥用載體。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明中提供的新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖中的巖藻糖殘基(固定結(jié)構(gòu))的數(shù)量為4個(gè)或6個(gè)，擴(kuò)大了具有固定結(jié)構(gòu)的新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的數(shù)量，進(jìn)而擴(kuò)大了巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的使用范圍，為預(yù)防或治療特應(yīng)性皮炎和濕疹、胃腸道感染的藥物提供了更多的組分來源。利用本發(fā)明的方法可以制備出兩種新型巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，豐富了巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的種類。本方法簡單可行，反應(yīng)產(chǎn)物的得率更高。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1把重組巖藻多糖酶FFA1(1mg)放入pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液中，和5％的銅藻(Sargassumhorneri)巖藻多糖溶液混合在一起，將混合物在37℃的溫度條件下人工培養(yǎng)72h，然后加熱至100℃，加熱時(shí)間5min。生成的沉淀物用離心法進(jìn)行分離并棄去不用。在上層清液中加入乙醇，直到其濃度達(dá)到75％。形成的沉淀物(高分子成分)離心處理，9000g，離心時(shí)間20min。上層清液(低分子成分)被倒入到含有Q-瓊脂糖凝膠吸附劑的柱體中，用純水平衡。然后以1mL/min的速度，用碳酸氫銨對低聚糖進(jìn)行線性梯度洗脫。先操作得到分子式為II的硫酸化巖藻糖基化低聚糖，然后操作得到分子式為I的硫酸化巖藻糖基化低聚糖，隨后把得到的產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥，得到的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率占低分子成分總量的5-15％。實(shí)施例2把重組巖藻多糖酶FFA1(1mg)放入pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液中，和10％的銅藻(Sargassumhorneri)巖藻多糖溶液混合在一起，將混合物在37℃的溫度條件下人工培養(yǎng)75h，然后加熱至100℃，加熱時(shí)間10min。生成的沉淀物用離心法進(jìn)行分離并棄去不用。在上層清液中加入丙酮，直到其濃度達(dá)到75％。形成的沉淀物(高分子成分)加以離心處理，10000g，離心時(shí)間30min。上層清液(低分子成分)被倒入到含有Q-瓊脂糖凝膠吸附劑的柱體中，用純水平衡。然后以1mL/min的速度，用碳酸氫銨對低聚糖進(jìn)行線性梯度洗脫。先操作得到分子式為II的巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，然后操作得到分子式為I的巖藻聚糖硫酸酯低聚糖，隨后把得到的產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥，得到的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率占低分子成分總量的7-20％。得到的低聚糖的結(jié)構(gòu)用核磁共振光譜加以確定。在分子式為I的低聚糖的1H-光譜上，我們發(fā)現(xiàn)了四個(gè)不同的α-甲基-L-巖藻吡喃糖苷殘基發(fā)生了化學(xué)位移，這四個(gè)殘基在表格1中分別用字母a-d來表示。借助1DTOXY光譜和COSY光譜，可以確定出每一個(gè)殘基發(fā)生的化學(xué)位移，以及它們的化學(xué)序列。從HSQC-光譜中可以確定出1H化學(xué)位移和13C化學(xué)位移之間的關(guān)系。ROESY光譜表明，在d殘基H1和c殘基H4之間，c殘基H1和a殘基H3之間，b殘基H1和H3殘基及d殘基H4之間具有關(guān)聯(lián)性。在HMBC光譜上，可以觀察到，在d殘基С1和c殘基H4之間，c殘基С1和a殘基H3之間，b殘基С1和d殘基H3之間具有關(guān)聯(lián)性。同樣地，質(zhì)子d1,c1和b1相應(yīng)地分別與碳原子c4,a3和d3具有關(guān)聯(lián)性。在此基礎(chǔ)上可以得出結(jié)論，分子式為I的低聚糖具有一個(gè)碳架：α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp。表1分子式為I的巖藻糖基化低聚糖的化學(xué)位移(ppm)殘基H1H2H3H4H5H6a5.504.544.064.094.241.24b5.394.584.724.224.591.26c5.374.654.764.274.571.41d5.304.594.204.124.441.30C1C2C3C4C5C6a91.7474.6274.9970.4067.1216.65b95.8673.6176.3371.8167.7416.44c96.3273.6875.1680.5469.0716.85d99.9374.6274.4970.6268.2816.51根據(jù)700兆赫茲、308K條件下的1H光譜，丙酮2.225的化學(xué)位移可以測得各種化學(xué)位移。根據(jù)700兆赫茲、308K條件下的13С光譜，丙酮31.45的化學(xué)位移可以測得各種化學(xué)位移。通過同樣的方式，可以確定出分子式為II的低聚糖的結(jié)構(gòu)。1H-光譜顯示，存在六種不同的單糖殘基。1DTOXY光譜、COSY光譜和HSQC光譜都能夠確定出，每一種單糖殘基的質(zhì)子化學(xué)位移和碳化學(xué)位移。這些單糖殘基在圖表2中都有所體現(xiàn)。在ROESY光譜上可以觀察到，在a’殘基H1和d’殘基H4之間，在e’殘基H1和d’殘基H3之間，在d’殘基H1和c’殘基H4之間，在c’殘基H1和b’殘基H3之間，在f’殘基H1和a’殘基H2之間，都存在相關(guān)性。在HMBC光譜上，碳原子a’1,d’1,e’1,f’1,c’1分別和質(zhì)子d’4,c’4,d’3,a’2和b’3具有相關(guān)性，而質(zhì)子a’1,e’1,f’1,d’1，則和碳原子d’4,d’3,a’2,c’4分別具有相關(guān)性。此外，在HMBC光譜上可以觀察到，碳原子b’3和質(zhì)子c’1或者d’1具有相關(guān)性。表2分子式為II的巖藻糖基化低聚糖的化學(xué)位移(ppm)根據(jù)700兆赫茲、308K條件下的1H光譜，丙酮2.225的化學(xué)位移可以測得各種化學(xué)位移。根據(jù)700兆赫茲、308K條件下的13С光譜，丙酮31.45的化學(xué)位移可以測得各種化學(xué)位移。基于以上論述可以得出結(jié)論：分子式為II的低聚糖具有以下形式的支鏈結(jié)構(gòu)：硫酸鹽在單糖類殘基中的位置，可以通過將其質(zhì)子位移和巖藻糖(H1＝5,19,H2＝3,76,H3＝3,85,H4＝3,80,H5＝4,19,H6＝1,20)進(jìn)行對比加以確定，也可以通過將其碳原子位移與α-甲基-L-巖藻吡喃糖苷(C1＝100,5,C2＝69,0,С3＝70,6,С4＝72,9,С5＝67,5,С6＝16,5)進(jìn)行對比加以確定。根據(jù)巖藻糖H2在弱場0.8-0.9ppm的移動，和α-甲基-L-巖藻吡喃糖苷在弱場4-6ppm的移動，可以計(jì)算出，在位置2發(fā)生了硫酸鹽化作用。根據(jù)H3在弱場0.9-1.0ppm的移動，和C3在弱場4-6ppm的移動可以確定出，在位置3存在硫酸鹽。上述雖然對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3