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ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)制備基因修飾小鼠的改進(jìn)方法與流程

文檔序號:12412254閱讀:1159來源:國知局
本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域
,尤其涉及生物基因
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)制備基因修飾小鼠的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)
:ES基因打靶是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入ES細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的技術(shù)。將基因打靶后的ES細(xì)胞用顯微注射的辦法導(dǎo)入胚胎中就可以生產(chǎn)出基因修飾小鼠。該技術(shù)是最早實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)修飾的技術(shù),并在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)是唯一可以在基因組水平上進(jìn)行基因定點(diǎn)操作的技術(shù),由于該方法建立時(shí)間久、技術(shù)成熟度高、沒有脫靶效應(yīng)等優(yōu)勢,目前仍被廣泛認(rèn)為是一種理想的修飾與改造生物體遺傳物質(zhì)的方法。但在各種基因修飾新技術(shù)不斷出現(xiàn)的今天,與新誕生的CRISPR/Cas9等核酸酶基因修飾技術(shù)相比,基因修飾小鼠制備周期長成為該技術(shù)的最大不足。ES基因打靶技術(shù)制備基因修飾小鼠可以分為ES基因打靶和ES胚胎顯微注射獲取基因修飾小鼠(以下簡稱ES顯微注射)兩個(gè)階段。其周期長主要表現(xiàn)在ES顯微注射階段,因?yàn)橥ㄟ^傳統(tǒng)ES顯微注射獲得的往往都是嵌合體(只有部分細(xì)胞來源于基因修飾的ES細(xì)胞),不是真正意義上的基因修飾小鼠,需要再繁殖一代才能從后代中挑選出真正可穩(wěn)定遺傳的基因修飾小鼠,該過程至少增加了3個(gè)月的周期。雖然經(jīng)過幾十年的發(fā)展,ES顯微注射技術(shù)也已經(jīng)發(fā)展出一系列的不同方法,不僅可以產(chǎn)生嵌合體后代,也可以產(chǎn)生完全來自外源ES細(xì)胞的后代,但現(xiàn)有的方法都或多或少存在不同的問題。目前常用的ES顯微注射方法主要有以下幾種:(1)胚胎干細(xì)胞囊胚注射法(傳統(tǒng)ES顯微注射法):從上世紀(jì)80年代出現(xiàn)至今已有30多年的歷史,在相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)是基因敲除小鼠構(gòu)建的主要方法;(2)四倍體胚胎ES顯微注射法:該法能夠獲得100%來源于外源ES細(xì)胞的后代小鼠;(3)囊胚前胚胎的ES顯微注射方法:該方法有獲得100%來自外源ES后代的幾率。由于其比傳統(tǒng)四倍體胚胎ES顯微注射法簡單,且當(dāng)ES來源于近交系小鼠時(shí)獲得的后代也不容易致死,因此該法一誕生就受到廣泛關(guān)注,并被不斷優(yōu)化。上述方法雖然各有特色,但都存在不足:(1)胚胎干細(xì)胞囊胚注射法的缺點(diǎn)是一般只能產(chǎn)生嵌合體,很難獲得完全來源于外源ES細(xì)胞的小鼠,不是真正意義上的基因修飾小鼠,需要再繁殖一代才能從后代中挑選出真正可穩(wěn)定遺傳的基因修飾小鼠(且最多只占后代總數(shù)的50%),這個(gè)傳代過程會多耗時(shí)至少3個(gè)月,而且成功率較低(平均不足1/3);(2)四倍體胚胎ES顯微注射法的缺點(diǎn)是操作比較復(fù)雜,出生率較低,且當(dāng)ES來源于近交系小鼠時(shí)產(chǎn)生的后代往往死亡;(3)現(xiàn)有囊胚前胚胎ES注射法的缺點(diǎn)是獲得100%ES來源的小鼠效率較低,囊胚前胚胎獲取難度比囊胚大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明目的在于提高囊胚前胚胎ES注射法獲取100%ES來源基因修飾鼠的效率,著重在囊胚前胚胎的獲取方法、顯微注射方法、顯微注射后胚胎的體外培養(yǎng)等方面進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。本發(fā)明既能保證100%ES來源小鼠的得率,同時(shí)還大大縮減周期、降低成本。本發(fā)明提供的ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)制備基因修飾小鼠的改進(jìn)方法,包括如下步驟:(1)提供小鼠的2-細(xì)胞胚胎,(2)將所述的2-細(xì)胞胚胎在清洗若干次后,在37℃下5%CO2的條件下培養(yǎng)12-24小時(shí);(3)將步驟(2)培養(yǎng)的胚胎和準(zhǔn)備好的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移到同一注射皿中的液滴內(nèi),將所述注射皿放置在顯微鏡下進(jìn)行顯微注射;在高倍鏡下,用斜口的注射針連續(xù)吸多個(gè)ES細(xì)胞到注射針里,挑選形態(tài)較好的胚胎,將注射針的針頭插入胚胎的卵裂球間隙內(nèi),推動注射器,將注射針內(nèi)的ES細(xì)胞推到胚胎內(nèi),最后拔出針;(4)將注射后的胚胎轉(zhuǎn)移至改良胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí);(5)選取前述步驟(4)中發(fā)育良好的胚胎,移植到2.5d的代孕鼠子宮內(nèi);(6)當(dāng)代孕鼠產(chǎn)下小仔F0后,對出生小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和鑒定。優(yōu)選的,所述步驟(2)中,將所述的2-細(xì)胞胚胎在M2培養(yǎng)液滴中清洗多遍,接著將2-細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微滴培養(yǎng)皿中,然后用平衡好的M16培養(yǎng)液清洗2-細(xì)胞胚胎多遍后,最后將2-細(xì)胞胚胎放置于一個(gè)干凈液滴內(nèi)。優(yōu)選的,所述步驟(3)顯微注射具體包括如下步驟:S1.在高倍鏡下選擇單個(gè)ES細(xì)胞,用斜口的注射針連續(xù)吸多個(gè)細(xì)胞到注射針里,挑選形態(tài)較好的胚胎,用固定針吹吸胚胎,旋轉(zhuǎn)胚胎直至將一個(gè)較大間隙調(diào)節(jié)在3點(diǎn)方向。用固定針負(fù)壓固定胚胎,調(diào)節(jié)顯微鏡確定胚胎的邊緣,同時(shí)要確保胚胎固定牢固;S2.將注射針的尖端與胚胎的中心點(diǎn)安排在同一聚焦平面上,用注射針尖輕輕地接觸胚胎表面;S3.將注射針的針頭插入胚胎的卵裂球間隙內(nèi),緩慢推動油壓注射器,將注射針內(nèi)的ES細(xì)胞推到胚胎內(nèi),每個(gè)胚胎注射6-8個(gè)ES細(xì)胞;S4.注射完畢后將注射針緩慢拔出。優(yōu)選的,所述步驟(3)中注射皿中的液滴為注射液,所述步驟(4)中的改良胚胎培養(yǎng)基;它們的組分相同,如下組成:;其中NEAA(100×)的成分為:成分濃度(g/100mL)脯氨酸0.01-0.1丙氨酸0.01-0.1絲氨酸0.01-0.1甘氨酸0.01-0.1天冬酰胺0.05-0.5天冬氨酸0.05-0.5谷氨酸0.05-0.5;其中,所述小分子物質(zhì)為C、H、F、N、O、S類化學(xué)成分組成的氨基芳香烴類,其范圍在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。優(yōu)選的,所述小分子物質(zhì)選自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341組分中的兩種或兩種以上。優(yōu)選的,所述步驟(3)中注射皿中的液滴為注射液,所述步驟(4)中的改良胚胎培養(yǎng)基;它們的組分相同,如下組成:其中NEAA(100×)的成分為:成分濃度(g/100mL)脯氨酸(L-Proline)0.05-0.1丙氨酸(L-Alanine)0.05-0.1絲氨酸(L-Serine)0.05-0.1甘氨酸(Glycine)0.05-0.1天冬酰胺(Asparaginemonohydrate)0.05-0.4天冬氨酸(Asparticacid)0.05-0.4谷氨酸(Glutamicacid)0.05-0.4;其中,所述小分子物質(zhì)為C、H、F、N、O、S類化學(xué)成分組成的氨基芳香烴類,其范圍在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。優(yōu)選的,所述小分子物質(zhì)選自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341組分中的兩種或兩種以上。本發(fā)明中的胚胎培養(yǎng)基和注射液的組分中,NEAA(100×),表示為NEAA為100×的母液,即其應(yīng)用時(shí)最大稀釋配倍數(shù)為100倍;其在配方中的最大添加量為0.1-10×,即在總體積為100ml培養(yǎng)試劑中,添加NEAA為0.1-10ml。本發(fā)明中使用的顯微注射針為自行拉制,使用SUTTER公司的P-97拉針儀,將內(nèi)徑1mm的薄壁毛細(xì)管拉制為細(xì)長的尖錐形,用鍛針儀在毛細(xì)管內(nèi)徑為15-20μm處將尖錐的頭部斷開(確保斷口整齊),再用磨針儀將斷口處的斷面磨制為45°的角后備用。目前使用最多的基因修飾動物模型制備技術(shù)是囊胚ES顯微注射技術(shù),該技術(shù)由于其獲得的是嵌合體,不是真正意義上的基因修飾小鼠,需要再繁殖一代才能從后代中挑選出真正可穩(wěn)定遺傳的基因修飾小鼠(且最多只占后代總數(shù)的50%),這個(gè)傳代過程至少耗時(shí)3個(gè)月,而且成功率較低。本發(fā)明的顯微注射技術(shù)無論在小鼠出生率還是ES來源的小鼠比率上與傳統(tǒng)方法的效率不相上下,另外還可以直接大量產(chǎn)生100%ES來源小鼠;節(jié)省了至少3個(gè)月的時(shí)間;由于減少了一個(gè)中間環(huán)節(jié)而簡化了操作流程、增加了成功率。因此該技術(shù)具有省時(shí)、低成本、高效率的三大優(yōu)勢,是對現(xiàn)有技術(shù)的突破性改進(jìn)。改進(jìn)后的ES基因打靶技術(shù)在基因修飾小鼠制備效率上已經(jīng)接近CRISPR/Cas9等最新的核酸酶基因修飾技術(shù),可在基因修飾領(lǐng)域大大緩解CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)專利生效后對我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可能產(chǎn)生的沖擊。根據(jù)上述技術(shù)方案,可以得出本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別如表1所示,表1發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)比較:由此,可以得出本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)中的優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明胚胎獲取方法較傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn):降低了胚胎獲得的難度,提高了特定發(fā)育階段胚胎的得率。2、本發(fā)明顯微注射方法較傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn):降低了對設(shè)備的需求,只需要普通的顯微注射設(shè)備就能夠?qū)崿F(xiàn),無需采購價(jià)格昂貴的激光破膜儀和壓電破膜儀。3、本發(fā)明注射液配方較傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn):大幅提高了100%ES來源小鼠的比例,使得使用斜口針進(jìn)行囊胚前胚胎注射獲取高比例的100%ES來源小鼠成為可能。4、本發(fā)明注射后培養(yǎng)方法較傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn):大幅提高了100%ES來源小鼠的產(chǎn)率,使得用囊胚前胚胎ES注射法完全取代傳統(tǒng)的囊胚ES注射法成為可能。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整,未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1顯微注射方法對比1.1實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基:本實(shí)驗(yàn)所需注射液和胚胎培養(yǎng)基,按照表2配制。表2.注射液和胚胎培養(yǎng)基試劑名稱品牌貨號添加量氯化鈉NaCl上海展云化工7647-14-55.0g/L氯化鉀KCl上海展云化工7447-40-70.4/L氯化鈣CaCl2·2H2OSigmaC50800.5/L磷酸二氫鉀KH2PO4上海展云化工7778-77-00.5g/L硫酸鎂MgSO4·7H2O上海展云化工7487-88-90.2/L碳酸氫鈉NaHCO3上海展云化工144-55-820g/Lβ-巰基乙醇β-MercaptoethanolSigmaM31485mL/L轉(zhuǎn)鐵蛋白TransferrinPeproTechAF-200-020.02g/L葡萄糖SigmaG70210.5g/L乳酸鈉SigmaL70222.0mL/L乳酸鈣Sigmal20000.5g/L丙酮酸鈉SigmaP52800.05g/L乙二胺四乙酸鈉SigmaE16440.05g/L谷氨酰胺Sigma494190.1g/L牛血清白蛋白Amresco03320.05g/L胎牛血清BI04-002-1A7%HEPESSigmaH75233.5g/LNEAA(100×)Cyagen10201-1005×小分子物質(zhì)0.25g/L其中NEAA(100×)的成分為:成分濃度(mg/L)脯氨酸(L-Proline)1150丙氨酸(L-Alanine)890絲氨酸(L-Serine)1050甘氨酸(Glycine)750天冬酰胺(Asparaginemonohydrate)1320天冬氨酸(Asparticacid)1330谷氨酸(Glutamicacid)1470;其中,所述小分子物質(zhì)選自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341組分中的兩種或兩種以上。1.2實(shí)驗(yàn)分組:X1組為壓電破膜顯微注射;X2組為斜口針顯微注射1.3實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果按照顯微注射方法的不同分為2組,X1組使用壓電破膜儀輔助顯微操作,X2組使用斜口針顯微操作,其他實(shí)驗(yàn)操作步驟及條件都相同,均按本實(shí)驗(yàn)流程最優(yōu)方法進(jìn)行,每組的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下:表3統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果由上表可知在主要數(shù)據(jù)上用斜口針顯微注射都取得更好的結(jié)果。實(shí)施例2顯微注射液效果對比2.1實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基:M2培養(yǎng)基:購買于SIGMA公司,貨號為M7167;本發(fā)明注射液:配方如表2所示。2.2實(shí)驗(yàn)分組:M組為M2培養(yǎng)基;N組為本發(fā)明的注射液,配方如表2所示。2.3實(shí)驗(yàn)步驟按照實(shí)驗(yàn)操作流程,胚胎獲取和顯微注射方法都按照本發(fā)明方案的最優(yōu)方法進(jìn)行,其它步驟條件都相同,區(qū)別僅為:M組的注射液為M2培養(yǎng)基;N組的注射液為本發(fā)明表2的注射液。2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表4:表4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果從結(jié)果可以看出,本發(fā)明的注射液比M2培養(yǎng)基的100%ES來源的小鼠出生率高出近20%。實(shí)施例3.注射后的胚胎培養(yǎng)基對比試驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基:表5.NB培養(yǎng)基配方試劑名稱品牌貨號添加比例KnockoutDMEMGibco1082901870-95%N2(100×)Gibco175020480.1-10×B27(50×)Gibco175040440.1-10×NEAA(100×)注Cyagen10201-1000.1-10×GlutaMAX(100×)Gibco350500610.1-10×青鏈霉素(1000×)吉諾GNM151400.1-10×β-巰基乙醇SigmaM75220.01-0.8mM白血病抑制因子LIF普欣123-071-20ng/mL表6KSR培養(yǎng)基配方試劑名稱品牌貨號使用濃度KnockoutDMEMGibco1082901875-90%KSRGibcoN108280285-20%NEAA(100×)注Cyagen10201-1000.1-10×GlutaMAX(100×)Gibco350500610.1-10×青鏈霉素(100×)吉諾GNM151400.1-10×β-巰基乙醇SigmaM75220.01-0.8mM白血病抑制因子LIF普欣123-071-20ng/mL注:NEAA(100×)成分如下:成分濃度(mg/L)脯氨酸(L-Proline)1150丙氨酸(L-Alanine)890絲氨酸(L-Serine)1050甘氨酸(Glycine)750天冬酰胺(Asparaginemonohydrate)1320天冬氨酸(Asparticacid)1330谷氨酸(Glutamicacid)1470M16培養(yǎng)基:購買于SIGMA公司,貨號為M7292;KSOM培養(yǎng)基:購買于Millipore公司,貨號為MR-106-D;本發(fā)明培養(yǎng)基:按照表2成分配置。3.2實(shí)驗(yàn)分組:A組:不培養(yǎng);B組:M16培養(yǎng)基;C組:KSOM培養(yǎng)基;D組:KSR培養(yǎng)基;E組:NB培養(yǎng)基;F組:KSOM+4%NB;G組:本發(fā)明培養(yǎng)基。3.3實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果按照實(shí)驗(yàn)操作流程,胚胎獲取方法和顯微注射方法均按照本方案的最優(yōu)方法進(jìn)行,其它步驟條件都相同,區(qū)別僅為各組胚胎培養(yǎng)基不同,根據(jù)上述各組進(jìn)行試驗(yàn),最終每組的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下:表7統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果由上表可知注射后的胚胎若不經(jīng)短暫培養(yǎng),獲得100%ES來源小鼠數(shù)量極少甚至沒有;本方明與現(xiàn)有注射后的培養(yǎng)方法相比差異顯著,其100%ES來源小鼠出生率提高了10%。實(shí)施例4.本發(fā)明與傳統(tǒng)囊胚顯微操作效率對比4.1實(shí)驗(yàn)分組:Y1組:本發(fā)明的顯微注射方法;Y2組:傳統(tǒng)囊胚ES顯微注射4.2實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果本實(shí)驗(yàn)按照整個(gè)流程的最優(yōu)方式進(jìn)行,傳統(tǒng)的囊胚ES顯微注射則按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式進(jìn)行。當(dāng)代孕鼠產(chǎn)下小仔(F0)后,對出生小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和鑒定。根據(jù)胚胎供體小鼠為白色體毛,ES來源小鼠為黑色體毛的區(qū)別,將F0小鼠按毛色分為三類:白色小鼠(胚胎供體來源小鼠)、黑白雜色小鼠(嵌合體小鼠)和純黑色小鼠(100%ES來源小鼠),分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表11所示。表8統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果由于傳統(tǒng)囊胚ES顯微注射方式在F0代沒有100%ES來源的小鼠,只能用>80%嵌合率嵌合體小鼠來進(jìn)行比較,嵌合體不能穩(wěn)定遺傳若想獲得真正的基因修飾小鼠必須再交配一代,既浪費(fèi)了3-4個(gè)月的時(shí)間,又浪費(fèi)了生產(chǎn)成本與人力資源,而且成功率也不高。上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn),其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施,并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 
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