本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種CAR新分子及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免疫抗癌的新型治療方法。它是運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑對從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，導(dǎo)入特定的外源基因，并擴(kuò)增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來激發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員一直致力于開發(fā)新的細(xì)胞免疫療法，以提高細(xì)胞免疫療法的效果，并降低其副作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種CAR新分子及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物具有下式所示的結(jié)構(gòu)：car-(IRES)-f其中，car表示嵌合抗原受體編碼多核苷酸序列；IRES表示內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(Internalribosomeentrysite,IRES)；f表示功能性融合蛋白編碼序列，所述功能性融合蛋白包括細(xì)胞因子或其活性片段，和/或所述細(xì)胞因子的受體或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞因子為IL15。在另一優(yōu)選例中，所述功能性融合蛋白由IL15受體sushi片段和IL15融合形成。在另一優(yōu)選例中，所述核酸構(gòu)建物具有下式所示的結(jié)構(gòu)：嵌合抗原受體編碼多核苷酸序列-(IRES)-IL15受體sushi片段編碼多核苷酸序列-L–IL15多核苷酸編碼序列，其中“-”表示連接相鄰核苷酸的磷酯鍵或任選地接頭肽編碼多核苷酸序列，“L”表示任選地接頭肽編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述IRES序列為SEQIDNO.31中的第21位-605位。在另一優(yōu)選例中，f為編碼SEQIDNO.22、33、35所示多肽的多核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述核酸構(gòu)建物為DNA或RNA。在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性靶向腫瘤細(xì)胞表明抗原，優(yōu)選地包括各種實(shí)體瘤和固體腫瘤的細(xì)胞表面抗原，例如c-Met、HER2、CD19等。在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性靶向c-Met抗原。在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)樘禺愋园邢騝-Met抗原的單鏈抗體(scFV)。在另一優(yōu)選例中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)樘禺愋园邢騝-Met抗原的抗體,其親和力為0.1-20nM，0.64-12.5nM,更加優(yōu)選地1-2nM。在另一優(yōu)選例中，所述單鏈抗體(scFV)的重鏈可變區(qū)如SEQIDNO.6所示。在另一優(yōu)選例中，所述單鏈抗體(scFV)的輕鏈可變區(qū)如SEQIDNO.7所示。在另一優(yōu)選例中，所述單鏈抗體(scFV)的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)如下式所示：scFV－H-TM－S－CD3ζ其中，scFV為特異性靶向c-Met抗原的單鏈抗體；H為絞鏈區(qū)；TM為跨膜結(jié)構(gòu)域；S為共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)，所述共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)包括源自CD28的共刺激分子，和/或源自4-1BB的共刺激分子；CD3ζ為源于CD3ζ的胞漿信號傳導(dǎo)序列。在另一優(yōu)選例中，H的序列如SEQIDNO.9所示。在另一優(yōu)選例中，TM的序列如SEQIDNO.11所示。在另一優(yōu)選例中，所述源自CD28的共刺激分子的序列如SEQIDNO.17所示。在另一優(yōu)選例中，所述源自4-1BB的共刺激分子的序列如SEQIDNO.13所示。在另一優(yōu)選例中，CD3ζ的序列如SEQIDNO.15所示。在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域如SEQIDNO.8所示。在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的序列如SEQIDNO.1、或3所示。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的編碼所述CD8α的鉸鏈區(qū)核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.9所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.10所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQIDNO.9所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的編碼所述CD8α的跨膜區(qū)的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.11所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.12所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.12所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQIDNO.11所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的編碼所述4-1BB(CD137)共刺激分子的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.13所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.14所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.14所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQIDNO.13所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的編碼所述CD28共刺激分子的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.17所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.18所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.18所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQIDNO.17所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的編碼所述CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.15所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.16所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.16所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQIDNO.15所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.1、或3所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.2、或4所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.2、或4所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且編碼SEQIDNO.1、或3任一所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car中包含選自下組的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.1、或3所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.29、或30所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.29、或30所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且編碼SEQIDNO.1、或3任一所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述核酸構(gòu)建物為分離的。在另一優(yōu)選例中，car中還包括編碼前導(dǎo)序列(引導(dǎo)序列，信號肽)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car的序列如SEQIDNO.2、或4所示。在另一優(yōu)選例中，所述IL15包括野生型的IL15和突變型的IL15，或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述IL15受體包括野生型的IL15受體和突變型的IL15受體，或其活性片段(如野生型或突變型的IL15受體α亞基)。在另一優(yōu)選例中，car的序列和所述IL15或所述IL15受體和IL15融合蛋白之間通過IRES序列連接。在另一優(yōu)選例中，所述IRES序列為序列如SEQIDNO.31、32、34中的第21-605位多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car-(IRES)-f中包含選自下組的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.1和22所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.29和31所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.29或31所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且編碼SEQIDNO.1或22所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car-(IRES)-f中包含選自下組的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.1和33所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.29和32所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.29或32所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且編碼SEQIDNO.1或33所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，car-(IRES)-f中包含選自下組的核酸序列：(A)編碼如SEQIDNO.1和35所示多肽的多核苷酸；(B)序列如SEQIDNO.29和34所示的多核苷酸；(C)核苷酸序列與SEQIDNO.29或和34所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且編碼SEQIDNO.1或34所示氨基酸序列的多核苷酸；(D)與(A)-(C)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述載體為慢病毒載體。本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明第二方面所述的載體或染色體中整合有外源的本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為分離的細(xì)胞，和/或所述細(xì)胞為基因工程化的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為T細(xì)胞或NK細(xì)胞。本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物、本發(fā)明第二方面所述的載體、或本發(fā)明第三方面所述的細(xì)胞。本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物、本發(fā)明第二方面所述的載體、或本發(fā)明第三方面所述的細(xì)胞的用途，用于制備治療腫瘤的藥物或制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括c-Met陽性腫瘤。本發(fā)明的第六方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發(fā)明本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物、本發(fā)明第二方面所述的載體、或本發(fā)明第三方面所述的細(xì)胞、或本發(fā)明第四方面所述的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述疾病為腫瘤。本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備CAR修飾的細(xì)胞(如CAR-修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞)的方法，所述方法包括步驟：將本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物、本發(fā)明第二方面所述的載體導(dǎo)入待修飾的細(xì)胞內(nèi)，從而獲得所述CAR修飾的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為T細(xì)胞或NK細(xì)胞。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了質(zhì)粒JX005(實(shí)施例3)和JX006(實(shí)施例4)酶切鑒定。實(shí)施例3挑選5個(gè)克隆(lanes1-5)，實(shí)施例4挑選3個(gè)克隆(lanes6-8)分別用BamH1和EcoRI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明實(shí)施例3和實(shí)施例4分別得到了正確的克隆。M：DNA分子量標(biāo)記。圖2顯示了質(zhì)粒JX007(實(shí)施例5)和JX008(實(shí)施例6)酶切鑒定。實(shí)施例5挑選3個(gè)克隆(lanes1-3)，實(shí)施例6挑選3個(gè)克隆(lanes4-6)分別用EcoRI和SalI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明實(shí)施例5和實(shí)施例6分別得到了正確的克隆。M：DNA分子量標(biāo)記。圖3顯示了本發(fā)明CAR分子結(jié)構(gòu)示意圖(JX007和JX008)。左，表達(dá)JX007的T,NK細(xì)胞，帶有細(xì)胞內(nèi)4-1BB信號，特異結(jié)合c-Met陽性腫瘤細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞因子IL15，能顯著殺傷腫瘤細(xì)胞，對c-Met陰性或低表達(dá)細(xì)胞也沒有毒性。右，表達(dá)JX008的T,NK細(xì)胞，帶有細(xì)胞內(nèi)4-1BB信號，特異結(jié)合c-Met陽性腫瘤細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞因子IL15受體sushi片段和IL15的融合分子(IL15Rashushi-L-IL15),該融合分子增強(qiáng)了IL15因子的活性(受體和細(xì)胞因子反式激活作用)，能極顯著殺傷腫瘤細(xì)胞，對c-Met陰性或低表達(dá)細(xì)胞也沒有毒性。這兩個(gè)CAR的活性結(jié)果表明，本發(fā)明CAR新分子通過結(jié)合c-Met靶向腫瘤細(xì)胞，通過特異的細(xì)胞因子、細(xì)胞因子和受體在腫瘤細(xì)胞周圍微環(huán)境聚集殺死腫瘤細(xì)胞，而不殺傷正常(非c-Met陽性，或c-Met低表達(dá))細(xì)胞。圖4顯示了本發(fā)明CAR分子對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。圖4a，轉(zhuǎn)染空載體(不表達(dá)CAR)的T細(xì)胞和表達(dá)本發(fā)明CAR分子JX005,JX006,JX007,JX008的T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞按3：1比例時(shí)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。圖4b，同樣條件下，對c-Met非陽性的細(xì)胞HepG2沒有殺傷作用。具體實(shí)施方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞或NK細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)CAR和IL-15、和/或IL-15受體，能夠顯著提高抗腫瘤活性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的核酸構(gòu)建物及其在CAR-T和/或者CAR-NK細(xì)胞治療腫瘤中的運(yùn)用。該CAR核酸構(gòu)建物由抗人c-Met單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)組成的單鏈可變區(qū)(singlechainFv，scFv)表達(dá)序列,人CD8α鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)表達(dá)序列,人4-1BB胞內(nèi)區(qū)和/或人CD28胞內(nèi)區(qū)表達(dá)序列、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)表達(dá)序列、人IL-15Ra表達(dá)序列、人IL-15表達(dá)序列結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。該嵌合抗原受體(CAR)表達(dá)核酸構(gòu)建物可用于修飾T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，修飾后的T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞),NK細(xì)胞(CAR-NK細(xì)胞)能用于c-Met陽性的腫瘤患者的治療，包括消化道癌癥、如胃癌、腸道癌癥，肺癌，肝癌，黑色素瘤、膽囊癌、前列腺癌，膀胱癌、腎癌、卵巢癌等癌癥的治療。在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。因本發(fā)明的公開，相關(guān)的內(nèi)容為本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的。除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種優(yōu)化的c-Met靶向性的嵌合抗原受體及其制法和應(yīng)用，所述嵌合抗原受體的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域N端到C端依次為抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈可變區(qū)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明還提供的嵌合抗原受體，其特定的輕鏈可變區(qū)-重鏈可變區(qū)順序的排布，膜外絞鏈區(qū)長度的調(diào)節(jié)，和信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的調(diào)整能夠顯著提高抗原結(jié)合受體的活性，極大的提高了對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。嵌合抗原受體本發(fā)明提供了包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(CAR)。胞外結(jié)構(gòu)域包括靶向特異性結(jié)合元件(也稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分。共刺激分子為淋巴細(xì)胞對抗原的有效應(yīng)答所需要的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。在CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可并入接頭。如本文所用的，術(shù)語“接頭”通常指起到將跨膜結(jié)構(gòu)域連接至多肽鏈的胞外結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。接頭可包括0-300個(gè)氨基酸，優(yōu)選地2至100個(gè)氨基酸和最優(yōu)選地3至50個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)過基因工程改造以表達(dá)CAR的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)，其顯示顯著的抗腫瘤性質(zhì)。本發(fā)明的CAR還可以包括胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域具有融合至T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈(例如，CD3ζ)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CAR當(dāng)在T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，能夠基于抗原結(jié)合特異性改變抗原識別。示例性抗原為c-Met。然而，本發(fā)明不限于靶向c-Met。相反地，本發(fā)明包括任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當(dāng)其結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原時(shí)，影響腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，并導(dǎo)致患者的腫瘤負(fù)荷縮小或消除?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與來自共刺激分子和ζ鏈中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與4-1BB(CD137)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、和CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的c-Met靶向性CAR包括包含本發(fā)明特定信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(CD8的跨膜區(qū)、4-1BB和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成)。與其他方式的c-Met靶向性CAR相比，本發(fā)明的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域顯著增加了抗腫瘤活性和CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)持久性。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體(CAR)的氨基酸序列如下：JX005:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.1)其中，第1‐238位為結(jié)合c‐Met的scFv編碼序列；第239‐285位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第286‐307位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第308‐349位為4‐1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第350‐461位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列；其編碼多核苷酸序列如下：GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG(SEQIDNO.2)，其中，第1‐714位為結(jié)合c-Met的scFv編碼序列；第715‐855位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第856‐921位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第922‐1047位為4‐1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第1048‐1383位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體(CAR)的氨基酸序列如下：JX006:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.3)該序列第1‐238位為結(jié)合c-Met的scFv編碼序列；第239‐285位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第286‐307位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第308‐348位為CD28胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第349‐390位為4‐1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第391‐502位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列；其編碼多核苷酸序列如下：GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCCGGTCCAAGCGGTCCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG(SEQIDNO.4)第1‐714位為結(jié)合c-Met的scFv編碼序列；第715‐855位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第856‐921位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第922‐1044位為CD28胞內(nèi)區(qū)編碼序列(無色)；第1045‐1170位為4‐1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第1171‐1506位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列?？乖翱乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域c-Met抗原間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換(MET)基因編碼受體酪氨酸激酶c-Met(或稱為Met)。c-Met與其配體肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)結(jié)合，引起受體酪氨酸磷酸化并通過激活下游信號通路PI3K和AKT、STAT3或者RAS和MAPK等發(fā)揮功能。Met在部分晚期惡性腫瘤中過度活化，擴(kuò)增，突變等，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分裂、遷移和侵潤。研究表明c-Met基因擴(kuò)增,過表達(dá)，活性改變等可能是這部分惡性腫瘤的驅(qū)動癌基因。這些腫瘤包括消化道癌癥、如胃癌、腸道癌癥，肺癌，肝癌，黑色素瘤、膽囊癌、前列腺癌，膀胱癌、腎癌、卵巢癌等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述c-Met抗原的氨基酸序列如下：>NP_001120972.1(hepatocytegrowthfactorreceptorisoformapreproprotein[Homosapiens])MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS(SEQIDNO.5)在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR包括被稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶-特異性結(jié)合元件。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原為c-Met。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向c-Met。優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榘邢騝-Met的抗體，優(yōu)選為靶向c-Met的scFV。在另一優(yōu)選例中，所述抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如下：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO.6)。在另一優(yōu)選例中，所述抗體氫鏈可變區(qū)的氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK(SEQIDNO.7)。在本發(fā)明的CAR中，可以使用0-20個(gè)(優(yōu)選為2-15個(gè))氨基酸的肽接頭連接在抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間，從而形成作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(scFv)氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO.8)。絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)對于絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)(跨膜結(jié)構(gòu)域)，CAR可被設(shè)計(jì)以包括融合至CAR的胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些例子中，可選擇跨膜結(jié)構(gòu)域，或通過氨基酸置換進(jìn)行修飾，以避免將這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，從而最小化與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用?？缒そY(jié)構(gòu)域可源于天然來源或合成來源。在天然來源中，該結(jié)構(gòu)域可源于任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)為CD8a的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，CD8a的絞鏈區(qū)包括以下氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY(SEQIDNO.9)；其編碼多核苷酸序列如下：ACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTAC(SEQIDNO.10)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，CD8a的跨膜區(qū)包括以下氨基酸序列IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQIDNO.11),其編碼多核苷酸序列如下:ATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGC(SEQIDNO.12)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域本發(fā)明的CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或另外的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是造成其中已放置CAR的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化的原因。術(shù)語“效應(yīng)子功能”指的是細(xì)胞的專有功能。例如，T細(xì)胞的效應(yīng)子功能可為包括細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞溶解活性或輔助活性。因此術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指的是轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號并指導(dǎo)細(xì)胞實(shí)施專有功能的蛋白部分。盡管通常可使用整個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在很多例子中，不必使用整個(gè)鏈。就使用細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，這種截短部分可用于代替完整的鏈，只要它轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號。術(shù)語細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域因此指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。用于本發(fā)明的CAR的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選例子包括T細(xì)胞受體(TCR)的胞漿序列和協(xié)同行動以在抗原受體結(jié)合后開始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共受體，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)以本身包括CD3-ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或可與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容中有用的任何其他期望的胞漿結(jié)構(gòu)域(一個(gè)或多個(gè))聯(lián)合。例如，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可包括CD3ζ鏈部分和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴細(xì)胞對抗原的有效應(yīng)答所需的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。優(yōu)選地，包括CD28、和/或4-1BB(CD137)等。本發(fā)明的CAR的胞漿信號傳導(dǎo)部分內(nèi)的胞漿信號傳導(dǎo)序列可以隨機(jī)或以規(guī)定的順序相互連接。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選長度在2和10個(gè)氨基酸，可形成該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)以包括CD28、和/或4-1BB的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(共刺激分子)以及CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，4-1BB的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域(共刺激分子)包含如下氨基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQIDNO.13)；其編碼核苷酸序列如下：AAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG(SEQIDNO.14)。優(yōu)選地，CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域包含如下氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.15)；其編碼核苷酸序列如下：CGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGG(SEQIDNO.16)在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，CD28的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域(共刺激分子)包含如下氨基酸序列:RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQIDNO.17)；其編碼核苷酸序列如下CGGTCCAAGCGGTCCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGTCC(SEQIDNO.18)當(dāng)本發(fā)明的CAR同時(shí)包含CD28的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和4-1BB的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域時(shí)，兩者之間可通過0-20個(gè)(優(yōu)選為2-15個(gè))氨基酸的肽接頭連接。載體和細(xì)胞修飾本發(fā)明包括包含CAR序列的DNA構(gòu)建體，其中該序列包括可操作地連接至信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核酸序列的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的CAR的示例性的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括抗c-MetscFv、CD8鉸鏈和跨膜區(qū)、CD28和/或4-1BB以及CD3ζ胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQIDNO:2、4中提出的核酸序列。編碼期望分子的核酸序列可通過利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，從包含該基因的細(xì)胞和組織中直接分離?？蛇x地，感興趣的基因可被合成生產(chǎn)。本發(fā)明也提供了其中插入本發(fā)明的DNA的載體。源于逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載體是實(shí)現(xiàn)長期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因?yàn)樗鼈冊试S轉(zhuǎn)基因長期、穩(wěn)定的整合并且其在子細(xì)胞中增殖。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兛赊D(zhuǎn)導(dǎo)非增殖的細(xì)胞，諸如肝細(xì)胞。它們也具有低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。簡單概括，通常通過可操作地連接編碼CAR多肽或其部分的核酸至啟動子，并將構(gòu)建體并入表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)編碼CAR的天然或合成核酸的表達(dá)。該載體適合于復(fù)制和整合真核細(xì)胞。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和啟動子。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體也可利用標(biāo)準(zhǔn)的基因傳遞方案，用于核酸免疫和基因療法?；騻鬟f的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見例如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通過引用全文并入。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了基因療法載體。該核酸可被克隆入許多類型的載體。例如，該核酸可被克隆入如此載體，其包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測序載體。進(jìn)一步地，表達(dá)載體可以以病毒載體形式提供給細(xì)胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)和其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊，產(chǎn)品說明書中進(jìn)行了描述。可用作載體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機(jī)體中起作用的復(fù)制起點(diǎn)、啟動子序列、方便的限制酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美國專利號6,326,193)。已經(jīng)開發(fā)許多基于病毒的系統(tǒng)，用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便的平臺。可利用在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對象細(xì)胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用慢病毒載體。額外的啟動子元件，例如增強(qiáng)子，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開始的頻率。通常地，這些位于起始位點(diǎn)上游的30-110bp區(qū)域中，盡管最近已經(jīng)顯示許多啟動子也包含起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔經(jīng)常是柔性的，以便當(dāng)元件相對于另一個(gè)被倒置或移動時(shí)，保持啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性才開始下降。取決于啟動子，表現(xiàn)出單個(gè)元件可合作或獨(dú)立地起作用，以起動轉(zhuǎn)錄。合適的啟動子的一個(gè)例子為即時(shí)早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列為能夠驅(qū)動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動子序列。合適的啟動子的另一個(gè)例子為延伸生長因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限于類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒即時(shí)早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，諸如但不限于肌動蛋白啟動子。進(jìn)一步地，本發(fā)明不應(yīng)被限于組成型啟動子的應(yīng)用。誘導(dǎo)型啟動子也被考慮為本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動子的使用提供了分子開關(guān)，其能夠當(dāng)這樣的表達(dá)是期望的時(shí)，打開可操作地連接誘導(dǎo)型啟動子的多核苷酸序列的表達(dá)，或當(dāng)表達(dá)是不期望的時(shí)關(guān)閉表達(dá)。為了評估CAR多肽或其部分的表達(dá)，被引入細(xì)胞的表達(dá)載體也可包含可選擇的標(biāo)記基因或報(bào)道基因中的任一個(gè)或兩者，以便于從通過病毒載體尋求被轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群中鑒定和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其他方面，可選擇的標(biāo)記可被攜帶在單獨(dú)一段DNA上并用于共轉(zhuǎn)染程序。可選擇的標(biāo)記和報(bào)道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以便能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的可選擇標(biāo)記包括例如抗生素抗性基因，諸如puromycin等。將基因引入細(xì)胞和將基因表達(dá)入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在表達(dá)載體的內(nèi)容中，載體可通過在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細(xì)胞，例如，哺乳動物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。例如，表達(dá)載體可通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞。將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包括載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。見例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)。將感興趣的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是慢病毒載體，比如通過慢病毒感染動物細(xì)胞將外援基因帶入細(xì)胞，已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細(xì)胞的方法。其他病毒載體可源自逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見例如美國專利號5,350,674和5,585,362。在使用非病毒傳遞系統(tǒng)的情況下，示例性傳遞工具為脂質(zhì)體。考慮使用脂質(zhì)制劑，以將核酸引入宿主細(xì)胞(體外、離體(exvivo)或體內(nèi))。在另一方面，該核酸可與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中，散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)，經(jīng)與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相關(guān)聯(lián)的連接分子附接至脂質(zhì)體，陷入脂質(zhì)體，與脂質(zhì)體復(fù)合，分散在包含脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)聯(lián)合，作為懸浮液包含在脂質(zhì)中，包含在膠束中或與膠束復(fù)合，或以其他方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與組合物相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)、脂質(zhì)/DNA或脂質(zhì)/表達(dá)載體不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述載體為慢病毒載體。優(yōu)選地，所述載體中還包括信號肽編碼序列。優(yōu)選地，所述信號肽序列連接在所述抗原結(jié)核結(jié)構(gòu)域核酸序列的上游。優(yōu)選地所述信號肽為CD8α信號肽MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQIDNO.19)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，將編碼本發(fā)明CAR的載體導(dǎo)入T細(xì)胞或NK細(xì)胞中從而構(gòu)建出了本發(fā)明CAR修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，經(jīng)本發(fā)明CAR修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞還表達(dá)外源的IL15和/或IL15受體(如IL15受體-接頭肽-IL15融合分子)，或它們的活性片段。白細(xì)胞介素interleukin15(IL15)是一種細(xì)胞因子，與其受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。IL15受體有三個(gè)亞基，分別為IL15受體α(IL15Rα)、IL15Rβ(CD122)和γ(也稱CD132)。IL15Rα細(xì)胞外區(qū)域?yàn)榻Y(jié)合IL15的部分，其中的區(qū)域Sushi結(jié)構(gòu)域與IL15結(jié)合可發(fā)揮IL15的生物學(xué)功能。由于IL15Rα與IL2受體α不同,因而導(dǎo)致IL15可能在免疫治療中有不同IL2的作用效果。IL15和IL15Rα結(jié)合，除自身細(xì)胞被激活外，因?yàn)镮L15Rα的介導(dǎo)，還可以將信號傳遞到另一個(gè)細(xì)胞激活細(xì)胞活性。這些活性包括選擇性地?cái)U(kuò)增CD8+T細(xì)胞，NK細(xì)胞等，而且不像IL2那樣活化調(diào)節(jié)T細(xì)胞，從而在抗腫瘤免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮不同的功能。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，向?qū)氡景l(fā)明的CAR基因序列的T細(xì)胞或NK細(xì)胞中，導(dǎo)入外源的IL15基因和/或IL15受體基因能夠顯著提高修飾細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。所述外源的IL15基因編碼野生型的IL15、突變型的IL15或其活性片段；所述IL15受體基因編碼野生型的IL15受體、突變型的IL15受體或其活性片段(如野生型或突變型的IL15受體α亞基)，其中所述IL15受體的活性片段至少包括IL15受體α亞基的Sushi結(jié)構(gòu)域的一部分(優(yōu)選地，77個(gè)氨基酸的sushi片段)。細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體/細(xì)胞因子融合蛋白：本發(fā)明CAR分子表達(dá)細(xì)胞因子IL15,或細(xì)胞因子IL15Rsushi片段和IL15融合蛋白分子,兩者之間以G4S序列連接。特別地，細(xì)胞因子IL15Rsushi片段和IL15融合蛋白分子可以模擬IL15分子和表達(dá)IL15R的細(xì)胞結(jié)合所產(chǎn)生的反式激活作用。本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IL15Rsushi片段和IL15融合蛋白的CAR能更加特異的殺傷CAR抗原陽性的腫瘤細(xì)胞。本實(shí)施例中選取表達(dá)c-Met陽性的腫瘤細(xì)胞MNK45。而對c-Met非表達(dá)細(xì)胞HepG2沒有殺傷毒性?？梢允褂?-20個(gè)氨基酸的肽接頭連接,例如(G4S)n(n＝1-5),連接IL15Rsushi片段和IL15分子。IL15,IL15R-(G4S)n-IL15的編碼區(qū)通過IRES序列和CAR分子中的CD3zeta(ζ)連接。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，外源的IL15基因和/或IL15受體基因以及本發(fā)明的CAR編碼基因構(gòu)建在同一個(gè)載體中，并被導(dǎo)入T或NK細(xì)胞內(nèi)?；蛘咄庠吹腎L15基因和/或IL15受體基因以及本發(fā)明的CAR編碼基因各自獨(dú)立的包含在不同的載體內(nèi)，并被獨(dú)立地以任意順序?qū)隩或NK細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)外源的IL15基因和IL15受體基因同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，外源的IL15基因和IL15受體基因可以分別構(gòu)建獨(dú)立的載體，或者外源的IL15基因和IL15受體基因構(gòu)建在同一載體中，或者外源的IL15基因和IL15受體基因以及本發(fā)明的CAR基因一起構(gòu)建在同一載體中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，IL-15的氨基酸序列如下：P40933.1|IL15_HUMANMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.20)其編碼核苷酸序列如下(NCBI，CR542007.1人IL15核苷酸序列)：ACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCT(SEQIDNO.21)；IL-15分子活性片段的一個(gè)優(yōu)選地例子如下：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.22)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，IL-15受體的氨基酸序列如下(NCBI數(shù)據(jù)庫序列)：MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQIDNO.23)其中，IL15Rα結(jié)構(gòu)域sushi區(qū)域?yàn)榈?6-142位氨基酸；其編碼核苷酸序列如下：ATGGCCCCGCGGCGGGCGCGCGGCTGCCGGACCCTCGGTCTCCCGGCGCTGCTACTGCTGCTGCTGCTCCGGCCGCCGGCGACGCGGGGCATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGAGACCCTGCCCTGGTTCACCAAAGGCCAGCGCCACCCTCCACAGTAACGACGGCAGGGGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGAAAAGAGCCCGCAGCTTCATCTCCCAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGAACCACAGAGATAAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCCTCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGTGGCTATCTCCACGTCCACTGTCCTGCTGTGTGGGCTGAGCGCTGTGTCTCTCCTGGCATGCTACCTCAAGTCAAGGCAAACTCCCCCGCTGGCCAGCGTTGAAATGGAAGCCATGGAGGCTCTGCCGGTGACTTGGGGGACCAGCAGCAGAGATGAAGACTTGGAAAACTGCTCTCACCACCTA(SEQIDNO.24)治療性應(yīng)用本發(fā)明包括用慢病毒載體(Lentivirus,LV)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞、NK細(xì)胞)。例如，LV編碼將特異性抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與4-1BB和/或CD28、以及CD3-ζ組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合的CAR。因此，在一些例子中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞或NK細(xì)胞可引起CAR-介導(dǎo)的T-細(xì)胞應(yīng)答。因此，本發(fā)明也提供了刺激對哺乳動物的靶細(xì)胞群或組織的T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括以下步驟：施用給哺乳動物表達(dá)CAR的T細(xì)胞、NK細(xì)胞，其中CAR包括特異性地與預(yù)定標(biāo)靶相互作用的結(jié)合部分，包括例如人CD3ζ的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ζ鏈部分，和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。優(yōu)選地，在CAR修飾的細(xì)胞中同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞因子IL15、或IL15R片段和IL15的融合分子，以產(chǎn)生反式激活作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一類細(xì)胞療法，其中T細(xì)胞或NK細(xì)胞被基因修飾以表達(dá)本發(fā)明的CAR，和將修飾的細(xì)胞注入需要其的接受者中。注入的細(xì)胞能夠殺死接受者的腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR-T或NK細(xì)胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)展并可持續(xù)延長的時(shí)間量。另外，CAR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可為過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR-修飾T或NK細(xì)胞誘導(dǎo)對CAR中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性的免疫應(yīng)答。例如，抗c-Met的CAR-T或NK細(xì)胞引起抗表達(dá)c-Met的腫瘤細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。盡管本文公開的數(shù)據(jù)具體公開了包括抗-c-MetscFv、CD8鉸鏈和跨膜區(qū)、CD28和/或4-1BB以及CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的慢病毒載體，但本發(fā)明應(yīng)被解釋為包括對構(gòu)建體組成部分中的每一個(gè)的任何數(shù)量的變化?？芍委煹陌┌Y包括CAR抗原表達(dá)陽性腫瘤，本發(fā)明優(yōu)選c-Met陽性的腫瘤，包括c-Met陽性的，如消化道癌癥、如胃癌、腸道癌癥，肺癌，肝癌等。本發(fā)明的CAR-修飾T或NK細(xì)胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內(nèi)療法的疫苗類型。優(yōu)選地，哺乳動物為人。通常地，如本文所述活化和擴(kuò)展的細(xì)胞可用于治療和預(yù)防無免疫應(yīng)答的個(gè)體中產(chǎn)生的疾病。本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞可被單獨(dú)施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分諸如IL-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群結(jié)合施用。本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞可和其它腫瘤治療方法，特別是免疫療法，免疫檢查點(diǎn)抗體PD-L1,PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用。簡單地說，本發(fā)明的藥物組合物可包括如本文所述的靶細(xì)胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制用于靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病癥、和患者疾病的類型和嚴(yán)重度——盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗(yàn)確定。當(dāng)指出“免疫學(xué)上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時(shí)，待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定，其考慮患者(對象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度和病癥的個(gè)體差異?？赏ǔＶ赋觯喊ū疚拿枋龅腡細(xì)胞的藥物組合物可以以104至109個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量，優(yōu)選105至106個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量(包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值)施用。T細(xì)胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細(xì)胞可通過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)(見例如Rosenberg等，NewEng.J.ofMed.319:1676，1988)施用。對于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監(jiān)測患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié)治療由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。對象組合物的施用可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，利用本文描述的方法或本領(lǐng)域已知的其他將T細(xì)胞擴(kuò)展至治療性水平的方法活化和擴(kuò)展的細(xì)胞，與任何數(shù)量的有關(guān)治療形式結(jié)合(例如，之前、同時(shí)或之后)施用給患者，所述治療形式包括但不限于用以下試劑進(jìn)行治療：所述試劑諸如抗病毒療法、西多福韋和白細(xì)胞介素-2、阿糖胞苷(也已知為ARA-C)或?qū)S患者的那他珠單抗治療或?qū)εＦぐ_患者的厄法珠單抗治療或?qū)ML患者的其他治療。本發(fā)明的T細(xì)胞可與以下結(jié)合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和FK506，抗體或其他免疫治療劑。本發(fā)明的細(xì)胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環(huán)磷酰胺結(jié)合(例如，之前、同時(shí)或之后)而施用給患者。施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病癥的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐實(shí)施。通常，每次治療或每個(gè)療程，可將1×106個(gè)至1×1010個(gè)本發(fā)明經(jīng)修飾的T或NK細(xì)胞，通過例如靜脈回輸?shù)姆绞?，施用于患者。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)首次提供了一種以c-Met抗原為靶點(diǎn)的嵌合抗原受體，且顯示出了顯著的腫瘤抑制效果；且對c-Met抗原陰性或表達(dá)低的細(xì)胞沒有殺傷作用。(2)首次發(fā)現(xiàn)在CAR修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞內(nèi)，隨CAR一起表達(dá)外源的IL15和/或IL15受體能夠顯著提高腫瘤抑制活性。(3)用抗c-Met抗體輕、重鏈構(gòu)建scFV，在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了具有顯著腫瘤抑制活性的CAR。(4)本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IL15、或IL15Rsushi片段和IL15融合蛋白的CAR能更加特異的殺傷CAR抗原陽性的腫瘤細(xì)胞。對抗原陰性或表達(dá)低的細(xì)胞沒有殺傷作用。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如美國Sambrook.J等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。其中，293T購自ProCell,MKN45購自Biovec質(zhì)粒載體細(xì)胞菌種基因保藏中心，pBabe-puro載體，病毒載體購自優(yōu)寶生物。實(shí)施例1用于本發(fā)明CAR分子中的scFv序列來源本發(fā)明CAR分子中的scFv序列源于抗人c-Met抗體?？赏ㄟ^免疫小鼠，脾細(xì)胞融合、雜交瘤篩選得到。該方法為本領(lǐng)域熟知。即通過免疫小鼠，得到小鼠來源抗人c-Met單克隆細(xì)胞株，將結(jié)合活性(和人c-Met的親和力KD)從0.1nM到10uM不同的細(xì)胞株分別提取cDNA，得到結(jié)合活性不同的抗人c-Met單克隆抗體，包括抗c-Met抗體輕、重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。從抗人c-Met單克隆細(xì)胞株得到鼠源抗c-Met單克隆抗體輕、重鏈序列，分別用抗體數(shù)據(jù)庫(例如v-base；NCBIIgBlast；IMGT等)進(jìn)行同源性分析，選擇人抗體種序列(germline),并避免序列中存在糖基化，脫酰胺化，氧化等敏感位點(diǎn)。構(gòu)建人源化抗體模型，篩選和人c-Met的親和力KD可以從0.1nM到10uM不等的人源化抗c-Met抗體分子(參見表1)。KD用抗c-Met抗體在GE公司Biacore3000儀器檢測來評估。詳細(xì)操作方法參考Biocaore儀器和GE公司提供的CM5芯片(GELifeSciencescatalog#BR-1000-12)和配套試劑使用說明進(jìn)行。即固定Anti-IgG抗體的芯片捕獲待檢測的抗體，PBS緩沖液稀釋his標(biāo)記抗原作為流動相。數(shù)據(jù)用BiaEvaluation4.0軟件擬合分析，得到抗原抗體結(jié)合力KD。表1可用于本發(fā)明CAR分子的抗c-Met抗體檢測分子(抗體)KD(nM)X0011.62X0020.64X0031.2X0042.0X00512.5通過免疫得到的鼠源，后人源化的抗人c-Met抗體分子的輕、重鏈序列通過設(shè)計(jì)linker連接輕、重鏈的可變區(qū)；或來源于已經(jīng)在臨床的人抗c-Met抗體分子包括LY2875358(專利WO2010059654A1)，陽性對照分子X001；Onartuzumab(MetMab；RG-3638；RO-5490258)等的部分序列，設(shè)計(jì)成scFv序列，均可設(shè)計(jì)成用于本發(fā)明CAR分子中的腫瘤細(xì)胞結(jié)合部分，例如以下序列，通過GGGGS(SEQIDNO.25)等接頭(linker)，比如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.26)連接得到本發(fā)明scFv區(qū)域。用于本發(fā)明的X1scFv(X001)的序列信息如下：輕鏈序列：XL1:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK(SEQIDNO.7)；其編碼核苷酸序列為：GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(SEQIDNO.27)重鏈序列：XH1:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO.6)其編碼核苷酸序列為：CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGT(SEQIDNO.28)實(shí)施例2：本發(fā)明其它序列選定除scFc序列外，其它序列可以從美國國立醫(yī)學(xué)圖書館網(wǎng)站http://www.pubmed.comGenBank數(shù)據(jù)庫中搜索得到。人CD8α信號肽、人CD8α鉸鏈區(qū)、CD8α跨膜區(qū)、人CD28胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入元件(IRESelements)、人IL15,人IL15受體alpha(IL15Ra)野生型和突變/sushi部分(US2014/01314；WO2007/046006)等蛋白序列。所有序列均根據(jù)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到氨基酸序列，以保證在編碼氨基酸序列不變的情況下更適合人類細(xì)胞表達(dá)。實(shí)施例3：JX005表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建JX005表達(dá)質(zhì)粒全基因合成完整以下DNA序列如下：tctaggcgccggccggatccGGCGCCGGCCGGATCCGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGGCCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGGTGAGATCCCAGTGTGGTGaattcgccagcacag，SEQIDNO.29其中，第106-819位為結(jié)合c-Met的scFv編碼序列；第820-960位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第961-1026位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第1027-1152位為4-1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第1153-1488位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列。上述序列編碼的氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.1)該序列第1-238位為結(jié)合c-Met的scFv編碼序列；第239-285位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第286-307位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第308-349位為4-1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第350-461位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列。將pBABEpuro質(zhì)粒用BamHI和EcoRI雙酶切線性化，純化備用。重組轉(zhuǎn)化用ClontechLaboratories,Inc.的In-FusionHDcloning試劑盒，按操作說明書進(jìn)行，具體如下：2ul5xIn-FusionHDEnzymePremix5ngpBABEpuro線性化質(zhì)粒15ng上述合成的JX005基因用dH2O補(bǔ)齊終體積10ul50℃反應(yīng)15min后置于冰上。取5ul反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選5個(gè)克隆分別用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定(見圖1，泳道1-5,為代表結(jié)果pJX005)?？寺¤b定正確后，挑選正確的克隆提取質(zhì)粒備用。質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白分子為人源化抗人c-Met抗體(實(shí)施例1)scFv序列、人CD8α鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、4-1BB胞內(nèi)區(qū)、CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)的組合。實(shí)施例4：JX006表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建JX006表達(dá)質(zhì)粒全基因合成完整DNA序列如下：tctaggcgccggccggatccGGCGCCGGCCGGATCCGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGGCCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGTGTCCTCCTCCGTGTCCTCCATCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGGTGTACTCCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCGGGTGAACCCCAACCGGCGGGGCACCACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCCGGGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGCGGTCCCTGCGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGCCAACTGGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGTACTACCACCCCCGCCCCCCGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTGTCCCTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCCGGTCCAAGCGGTCCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCCGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGGGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCCTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGGGTGAAGTTCTCCCGGTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGCGGGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGCGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGGTGAGATCCCAGTGTGGTGgaattcgccagcacag,SEQIDNO.30第106-819位為結(jié)合c-Met的scFv編碼序列；第820-960位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第961-1026位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第1027-1149位為CD28胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第1150-1275位為4-1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第1276-1611位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列。上述序列編碼的氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.3)該序列第1-238位為scFv編碼序列；第239-285位為人CD8α鉸鏈區(qū)編碼序列；第286-307位為人CD8α跨膜區(qū)編碼序列；第308-348位為CD28胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第349-390位為4-1BB胞內(nèi)區(qū)編碼序列；第391-502位為CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)編碼序列。重組轉(zhuǎn)化用ClontechLaboratories,Inc.的In-FusionHDcloning試劑盒，按操作說明書進(jìn)行，具體如下：2ul5xIn-FusionHDEnzymePremix5ngpBABEpuro線性化質(zhì)粒(同實(shí)施JX005)15ng上述合成的JX006基因用dH2O補(bǔ)齊終體積10ul50℃反應(yīng)15min后置于冰上。取5ul反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選3個(gè)克隆分別用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定(圖1，泳道6-8，為代表JX006的結(jié)果)。3個(gè)克隆均為正確，挑選正確克隆提取質(zhì)粒。質(zhì)粒表達(dá)的蛋白由人源化抗人c-Met抗體scFv序列、人CD8α鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、CD28胞內(nèi)區(qū)、4-1BB胞內(nèi)區(qū)、CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū)組合構(gòu)成。實(shí)施例5：JX007表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建全基因合成完整如下DNA序列如下：GATCCCAGTGTGGTGaattcGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGCCACCATGAGGATCTCCAAGCCCCACCTGCGGTCCATCTCCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACTCCCACTTCCTGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGTCCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGTCCGACGTGCACCCCTCCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTCCGGCGACGCCTCCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACTCCCTGTCCTCCAACGGCAACGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCCTGAgtcgaccctgtggaat(SEQIDNO.31)其中，第21-605位為IRES序列(下劃線部分)，第699-1040位為人IL15編碼序列；上述序列編碼的IL15氨基酸序列(野生型)為：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.22)將表達(dá)JX005質(zhì)粒pJX005用EcoRI和SalI雙酶切線性化，純化備用。重組轉(zhuǎn)化用ClontechLaboratories,Inc.的In-FusionHDcloning試劑盒，按操作說明書進(jìn)行，具體如下：2ul5xIn-FusionHDEnzymePremix8ngpJX005線性化質(zhì)粒15ng上述合成的基因用dH2O補(bǔ)齊終體積10ul50℃反應(yīng)15min后置于冰上。取5ul反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選三個(gè)克隆分別用EcoRI和SalI雙酶切鑒定(圖2，泳道1-3代表結(jié)果為pJX007)。克隆鑒定正確后，挑選正確克隆提取質(zhì)粒。質(zhì)粒表達(dá)的區(qū)域包括JX005的全部序列(人源化抗人c-Met抗體scFv、人CD8α鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、4-1BB胞內(nèi)區(qū)、CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū))、IRES和野生型IL-15分子編碼區(qū)。表達(dá)產(chǎn)物蛋白序列如下：JX007DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.1)和NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.22)實(shí)施例6：JX008表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建JX008.1表達(dá)質(zhì)粒全基因合成如下DNA序列：GATCCCAGTGTGGTGaattcGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGCCACCATGGCCCCCCGGCGGGCCCGGGGCTGCCGGACCCTGGGCCTGCCCGCCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCGGCCCCCCGCCACCCGGGGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCGAGGGCCGGATCACCTGCCCCCCCCCCATGTCCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCCCTGTACTCCCGGGAGCGGTACATCTGCAACTCCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACCTCCTCCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCCTCCCTGAAGTGCATCCGGGACCCCGCCCTGGTGCACCAGCGACCAGCTCCACCTTCAGGTGGATCAGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGTGGATCAGGAGGAGGTGGTTCTCTGCAGAACTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGTCCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGTCCGACGTGCACCCCTCCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTCCGGCGACGCCTCCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACTCCCTGTCCTCCAACGGCAACGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCCTGAgtcgaccctgtggaat(SEQIDNO.32)其中，第21-605位為IRES序列(下劃線部分)；第738-1370位為人IL15Rαsushi片段和IL15(野生型)編碼序列。上述序列編碼的人IL15Rαsushi片段(野生型)和IL15(野生型)氨基酸序列為：ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.33)JX008表達(dá)質(zhì)粒全基因合成以下DNA序列：GATCCCAGTGTGGTGaattcGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGCCACCATGGCCCCCCGGCGGGCCCGGGGCTGCCGGACCCTGGGCCTGCCCGCCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCGGCCCCCCGCCACCCGGGGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCGAGGGCCGGATCACCTGCCCCCCCCCCATGTCCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCCCTGTACTCCCGGGAGCGGTACATCTGCAACTCCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACCTCCTCCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCCTCCCTGAAGTGCATCCGGGACCCCGCCCTGGTGCACCAGCGACCAGCTCCACCTTCAGGTGGATCAGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGTGGATCAGGAGGAGGTGGTTCTCTGCAGAACTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGTCCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGTCCGACGTGCACCCCTCCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCTCCCTGGAGTCCGGCGACGCCTCCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACGACTCCCTGTCCTCCAACGGCAACGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCTCCTGAgtcgaccctgtggaat(SEQIDNO.34)其中，第21-605位為IRES序列(下劃線部分)；738-1370位為人IL15Rα(sushi片段)和IL15(突變型)編碼序列；上述序列編碼的人IL15Rα(sushi片段)和IL15(突變型)氨基酸序列為：ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.35)將表達(dá)JX005的質(zhì)粒pJX005用EcoRI和SalI雙酶切線性化，純化備用。重組轉(zhuǎn)化用ClontechLaboratories,Inc.的In-FusionHDcloning試劑盒，按操作說明書進(jìn)行，具體如下：2ul5xIn-FusionHDEnzymePremix8ngpJX005線性化質(zhì)粒15ng上述合成的pJX008或JX008.1基因用dH2O補(bǔ)齊終體積10ul50℃反應(yīng)15min后置于冰上。取5ul反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選三個(gè)克隆用分別EcoRI和SalI雙酶切鑒定(圖2，泳道4-6為pJX008的代表結(jié)果)?？寺¤b定均為正確后，挑選正確的克隆提取質(zhì)粒。質(zhì)粒表達(dá)的序列為JX005(即人源化抗人c-Met抗體scFv序列、人CD8α鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、4-1BB胞內(nèi)區(qū)、CD3zeta(ζ)胞內(nèi)信號區(qū))、IRES,和IL-15Rαsushi部分以及野生型IL-15或突變型IL-15分子組合構(gòu)成。具體序列為：JX008DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.1)和ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.35)JX008.1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.1)和ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQIDNO.33)實(shí)施例7：人PBMC的分離人抗凝濃縮白細(xì)胞，50ml/袋轉(zhuǎn)移到有150mlPBS的無菌瓶中。取6個(gè)50ml離心管，每管加入15毫升人淋巴細(xì)胞分離液(StemCell,Cat#:7851)，再加入稀釋后的血液35ml輕輕加到淋巴細(xì)胞分離液表面。常溫離心，2000RPM/500g，20分鐘。由于升速降速都很慢，大概共需要40-50分鐘。小心吸除廢液至交界面上方1厘米左右，再用10ml一次性移液管吸出交界面細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入無菌PBS至50毫升。常溫離心，200g，10分鐘。棄上清，彈散細(xì)胞，將同一個(gè)供者來源的PBMC混在一起，加入50mlPBS,500g離心10分鐘。棄上清，用含2ug/mlDNAseI的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。20％DMSO，80％FBS，1x107/管液氮凍存或用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例8：從人PBMC中分別分離T細(xì)胞和NK細(xì)胞實(shí)施例7中得到的PBMC用StemCell提供的T細(xì)胞，NK細(xì)胞分離試劑盒分別提取T細(xì)胞和NK細(xì)胞。操作步驟按照StemCell試劑盒提供的手冊進(jìn)行。用StemCellEasySepKit,Cat:18051提取CD3+T細(xì)胞。將上述實(shí)施例中得到的PBMC離心，重懸于1x108細(xì)胞/ml,按100ul/ml的量加入cocktail,混勻，RT15min；混勻磁珠，按50ul/ml的量加入上述細(xì)胞/cocktail,RT10min；加入1640培養(yǎng)基至總體積2.5ml,用pipet混打幾次后置于磁鐵，RT5min.棄上清，余下的為CD3+T細(xì)胞。用StemCellEasySepKit,Cat:19055從上述PBMC中分離NK細(xì)胞用于本發(fā)明CAR活性檢測。將上述實(shí)施例中得到的PBMC離心，重懸于5x107細(xì)胞/ml,按50ul/ml的量加入cocktail,混勻，RT10min；混勻磁珠30sec，按100ul/ml的量加入上述細(xì)胞/cocktail,RT5min；加入1640培養(yǎng)基至總體積2.5ml,置于磁鐵，RT2.5min.收集上清為NK細(xì)胞。實(shí)施例9：表達(dá)本發(fā)明CAR分子JX005；JX006；JX007；JX008,JX008.1的人T細(xì)胞和NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性檢測表達(dá)本發(fā)明的CAR分子的人T細(xì)胞，NK細(xì)胞能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞。下面以T細(xì)胞為例子進(jìn)行說明。表達(dá)本發(fā)明CAR分子的NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞操作只需將T細(xì)胞置換為上述分離的NK細(xì)胞。T細(xì)胞增值：取上述實(shí)施例中分離的T細(xì)胞，1x106/ml在100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RPMI1640(InvitrogenCat.No.12633-012,添加2mLL-glutamin,10％FBS,100U/mlpenicillin/streptomycin)加入Dynabeads人T-細(xì)胞激活因子CD3/CD28按1：1比例添加，同時(shí)加入30u/ml的人IL-2因子。5％CO2,37℃.每周2次計(jì)數(shù)細(xì)胞，待到細(xì)胞密度到2.5x106/ml的時(shí)候，傳代擴(kuò)培，繼續(xù)添加30u/ml的人IL-2因子。培養(yǎng)好的T細(xì)胞可以用5％DMSO凍存，或直接進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄病毒制備：293T細(xì)胞(購自ProCell)培養(yǎng)在100mm培養(yǎng)皿中，DMEM培養(yǎng)基加10％FBS，到培養(yǎng)皿面積40％覆蓋時(shí)候開始轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。取5個(gè)100mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)好的293T,移除原培養(yǎng)基，分別加入10ml新鮮的培養(yǎng)基，和1)6ugpBABEpuro(空載體，購自優(yōu)寶生物)、6ugpENV(購自優(yōu)寶生物),6ugpGSVG(購自優(yōu)寶生物),6ugpGP質(zhì)粒(購自優(yōu)寶生物)和Fugene6混合物(購自Invitrogen)；2)6ugpJX005(實(shí)施例3)、6ugpENV,6ugpGSVG,6ugpGP質(zhì)粒和Fugene6混合物；3)6ugpJX006(實(shí)施例4)、6ugpENV,6ugpGSVG,6ugpGP質(zhì)粒和Fugene6混合物；4)6ugpJX007(實(shí)施例5)、6ugpENV,6ugpGSVG,6ugpGP質(zhì)粒和Fugene6混合物；5)6ugpJX008或pJX008.1(實(shí)施例6)、6ugpENV,6ugpGSVG,6ugpGP質(zhì)粒和Fugene6混合物。24小時(shí)后，移除培養(yǎng)基，換成6mlT細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI1640)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收集上清，過濾備用。表達(dá)本發(fā)明CAR分子的T細(xì)胞制備：取上述培養(yǎng)增值中的T細(xì)胞，離心，按1x107/孔轉(zhuǎn)到6-well細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別加入上述制備好的6ml病毒:空載體、pJX005、pJX006、pJX007、pJX008、pJX008.1。24小時(shí)后，更換成正常的T細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI1640)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集表達(dá)JX005、JX006、JX007、JX008、JX008.1和對照(空載體)的T細(xì)胞，準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。表達(dá)本發(fā)明CAR分子的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)前一天，將腫瘤細(xì)胞，即目標(biāo)細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)MKN45為表達(dá)本發(fā)明CAR結(jié)合抗原的腫瘤細(xì)胞),和對照細(xì)胞(沒有本發(fā)明CAR結(jié)合抗原表達(dá)的HepG2肝細(xì)胞系)按5000個(gè)每孔，鋪在96-well板上。實(shí)驗(yàn)開始，取上述準(zhǔn)備好的表達(dá)JX005、JX006、JX007、JX008、JX008.1和對照(空載體)的T細(xì)胞，按照T細(xì)胞：目標(biāo)細(xì)胞比例為1：1、3：1、10：1加入混合、檢測。實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)只有目標(biāo)細(xì)胞，只有T細(xì)胞，沒有任何細(xì)胞的對照孔。表達(dá)本發(fā)明分子的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性檢測：用CCK8試劑盒(上海同仁化學(xué)提供)檢測T細(xì)胞殺傷目標(biāo)細(xì)胞活性。每孔加入10％體積的CCK8試劑(參考產(chǎn)品說明書)，孵育4小時(shí)后，讀取OD450值。表達(dá)本發(fā)明分子的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性結(jié)果：表2表達(dá)本發(fā)明分子的CAR-T細(xì)胞對抗原特異表達(dá)的腫瘤細(xì)胞和非抗原表達(dá)的細(xì)胞的殺傷活性#：空載體，即轉(zhuǎn)染了沒有CAR表達(dá)的T細(xì)胞。將該細(xì)胞用于對照，其讀值減除背景值后為100，表達(dá)本發(fā)明CAR的T細(xì)胞讀值同樣減除背景值后，相對于100，數(shù)值減少即代表本發(fā)明CAR-T分子對c-Met陽性腫瘤細(xì)胞(MKN45)和c-Met陰性細(xì)胞(HepG2)的殺傷效果。T檢驗(yàn):StudentT檢驗(yàn)。NA:不適用。表2結(jié)果表明，表達(dá)本發(fā)明CAR新分子的T細(xì)胞(JX005，JX006，JX007，JX008)和表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞MKN45以1：1，3：1，10：1的不同比例混合后，JX005，JX006，JX007，JX008均能殺傷腫瘤細(xì)胞。殺傷效果隨CAR-T細(xì)胞比例加大，殺傷作用明顯。特別是，JX007，JX008在和腫瘤細(xì)胞比例1：1，3：1時(shí)候，已經(jīng)能顯著(P<0.05)殺傷腫瘤細(xì)胞；在10：1的比例下，JX006,JX007能顯著殺死腫瘤細(xì)胞(P<0.05)，而JX008殺死作用極為顯著(P<0.01)。同樣的條件下，表達(dá)本發(fā)明CAR-T分子不殺傷沒有抗原表達(dá)的肝細(xì)胞系HepG2(差異不顯著)，表明本發(fā)明的CAR表達(dá)T細(xì)胞的殺傷作用是靶向特異的。表達(dá)本發(fā)明CAR新分子JX008.1(實(shí)施例6)的T細(xì)胞和表達(dá)c-Met抗原的腫瘤細(xì)胞MKN45以不同比例混合(實(shí)施例9)，意外發(fā)現(xiàn)以10：1的比例混合后，JX008.1能極顯著殺死腫瘤細(xì)胞(P<0.01)。同樣的條件下，不殺傷沒有抗原表達(dá)的肝細(xì)胞系HepG2(無顯著差異)，表明表達(dá)本發(fā)明的CAR新分子JX008.1表達(dá)T細(xì)胞的殺傷作用是靶向特異的。此外，將實(shí)施例9中JX005,JX006,JX007,JX008中的scFV換成實(shí)施例1中X005的輕、重鏈構(gòu)建的scFV同樣能殺死c-Met陽性MKN45細(xì)胞。當(dāng)T細(xì)胞和MKN45以10：1的比例時(shí)，殺傷細(xì)胞效率為14.8％，13.4％,27.7％和32％.同樣的條件下，對腫瘤抗原c-Met陰性，低表達(dá)肝細(xì)胞系HepG2無殺傷作用(均無顯著差異)，表明本發(fā)明的CAR新分子表達(dá)T細(xì)胞的殺傷作用是靶向特異的。綜合上述結(jié)果，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)CAR新分子針對c-Met特異抗原的抗體/抗原結(jié)合分子，親和力在1.62-12.5nM范圍內(nèi)，用4-1BB,和/或CD28作為共刺激因子，都能對靶細(xì)胞有特異的殺傷作用，但殺傷作用不足夠顯著，對非c-Met細(xì)胞沒有毒性。意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明新分子設(shè)計(jì)帶有細(xì)胞因子IL15,或IL15Rsushi-L-IL15后，特別是帶有IL15Rsushi-L-IL15(野生型或突變型)后(JX008，JX008.1)對靶細(xì)胞的特異殺傷作用極為顯著，且對非靶向細(xì)胞沒有毒性。因此，這些新的CAR分子可用于c-Met陽性的腫瘤病人細(xì)胞治療，能提高療效，降低脫靶帶來的非特異殺傷副作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海健信生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種CAR新分子及其在腫瘤治療中的應(yīng)用<130>P2016-1725<160>35<170>PatentInversion3.5<210>1<211>461<212>PRT<213>人工序列<400>1AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysSerValSerSerSerValSerSerIle202530TyrLeuHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeu354045IleTyrSerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGln65707580ProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnValTyrSerGlyTyrPro859095LeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysGlyGlyGlyGly100105110SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuVal115120125GlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSerValLysValSer130135140CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyrTyrMetHisTrpVal145150155160ArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMetGlyArgValAsnPro165170175AsnArgArgGlyThrThrTyrAsnGlnLysPheGluGlyArgValThr180185190MetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyrMetGluLeuArgSer195200205LeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgAlaAsnTrp210215220LeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerThrThr225230235240ThrProAlaProArgProProThrProAlaProThrIleAlaSerGln245250255ProLeuSerLeuArgProGluAlaCysArgProAlaAlaGlyGlyAla260265270ValHisThrArgGlyLeuAspPheAlaCysAspIleTyrIleTrpAla275280285ProLeuAlaGlyThrCysGlyValLeuLeuLeuSerLeuValIleThr290295300LeuTyrCysLysArgGlyArgLysLysLeuLeuTyrIlePheLysGln305310315320ProPheMetArgProValGlnThrThrGlnGluGluAspGlyCysSer325330335CysArgPheProGluGluGluGluGlyGlyCysGluLeuArgValLys340345350PheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrLysGlnGlyGlnAsnGln355360365LeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAspValLeu370375380AspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLysProArgArg385390395400LysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMet405410415AlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArgArgArgGly420425430LysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAsp435440445ThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg450455460<210>2<211>1383<212>DNA<213>人工序列<400>2gacatccagatgacccagtccccctcctccctgtccgcctccgtgggcgaccgggtgacc60atcacctgctccgtgtcctcctccgtgtcctccatctacctgcactggtaccagcagaag120cccggcaaggcccccaagctgctgatctactccacctccaacctggcctccggcgtgccc180tcccggttctccggctccggctccggcaccgacttcaccctgaccatctcctccctgcag240cccgaggacttcgccacctactactgccaggtgtactccggctaccccctgaccttcggc300ggcggcaccaaggtggagatcaagggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggc360ggcggctcccaggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcccggcgcctcc420gtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactactacatgcactgggtg480cggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggccgggtgaaccccaaccggcggggc540accacctacaaccagaagttcgagggccgggtgaccatgaccaccgacacctccacctcc600accgcctacatggagctgcggtccctgcggtccgacgacaccgccgtgtactactgcgcc660cgggccaactggctggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtccagtactacc720acccccgccccccggccccccacccccgcccccaccatcgcctcccagcccctgtccctg780cggcccgaggcctgccggcccgccgccggcggcgccgtgcacacccggggcctggacttc840gcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgtcc900ctggtgatcaccctgtactgcaagcggggccggaagaagctgctgtacatcttcaagcag960cccttcatgcggcccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgctcctgccggttcccc1020gaggaggaggagggcggctgcgagctgcgggtgaagttctcccggtccgccgacgccccc1080gcctacaagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggccggcgggaggag1140tacgacgtgctggacaagcggcggggccgggaccccgagatgggcggcaagccccggcgg1200aagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctac1260tccgagatcggcatgaagggcgagcggcggcggggcaagggccacgacggcctgtaccag1320ggcctgtccaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccc1380cgg1383<210>3<211>502<212>PRT<213>人工序列<400>3AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysSerValSerSerSerValSerSerIle202530TyrLeuHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeu354045IleTyrSerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGln65707580ProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnValTyrSerGlyTyrPro859095LeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysGlyGlyGlyGly100105110SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuVal115120125GlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSerValLysValSer130135140CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyrTyrMetHisTrpVal145150155160ArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMetGlyArgValAsnPro165170175AsnArgArgGlyThrThrTyrAsnGlnLysPheGluGlyArgValThr180185190MetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyrMetGluLeuArgSer195200205LeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgAlaAsnTrp210215220LeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerThrThr225230235240ThrProAlaProArgProProThrProAlaProThrIleAlaSerGln245250255ProLeuSerLeuArgProGluAlaCysArgProAlaAlaGlyGlyAla260265270ValHisThrArgGlyLeuAspPheAlaCysAspIleTyrIleTrpAla275280285ProLeuAlaGlyThrCysGlyValLeuLeuLeuSerLeuValIleThr290295300LeuTyrCysArgSerLysArgSerArgLeuLeuHisSerAspTyrMet305310315320AsnMetThrProArgArgProGlyProThrArgLysHisTyrGlnPro325330335TyrAlaProProArgAspPheAlaAlaTyrArgSerLysArgGlyArg340345350LysLysLeuLeuTyrIlePheLysGlnProPheMetArgProValGln355360365ThrThrGlnGluGluAspGlyCysSerCysArgPheProGluGluGlu370375380GluGlyGlyCysGluLeuArgValLysPheSerArgSerAlaAspAla385390395400ProAlaTyrLysGlnGlyGlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeu405410415GlyArgArgGluGluTyrAspValLeuAspLysArgArgGlyArgAsp420425430ProGluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeu435440445TyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIle450455460GlyMetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyr465470475480GlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMet485490495GlnAlaLeuProProArg500<210>4<211>1506<212>DNA<213>人工序列<400>4gacatccagatgacccagtccccctcctccctgtccgcctccgtgggcgaccgggtgacc60atcacctgctccgtgtcctcctccgtgtcctccatctacctgcactggtaccagcagaag120cccggcaaggcccccaagctgctgatctactccacctccaacctggcctccggcgtgccc180tcccggttctccggctccggctccggcaccgacttcaccctgaccatctcctccctgcag240cccgaggacttcgccacctactactgccaggtgtactccggctaccccctgaccttcggc300ggcggcaccaaggtggagatcaagggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggc360ggcggctcccaggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcccggcgcctcc420gtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactactacatgcactgggtg480cggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggccgggtgaaccccaaccggcggggc540accacctacaaccagaagttcgagggccgggtgaccatgaccaccgacacctccacctcc600accgcctacatggagctgcggtccctgcggtccgacgacaccgccgtgtactactgcgcc660cgggccaactggctggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtccagtactacc720acccccgccccccggccccccacccccgcccccaccatcgcctcccagcccctgtccctg780cggcccgaggcctgccggcccgccgccggcggcgccgtgcacacccggggcctggacttc840gcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgtcc900ctggtgatcaccctgtactgccggtccaagcggtcccggctgctgcactccgactacatg960aacatgaccccccggcggcccggccccacccggaagcactaccagccctacgcccccccc1020cgggacttcgccgcctaccggtccaagcggggccgga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