本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法。

背景技術(shù)：

作為天然免疫細(xì)胞中的重要淋巴細(xì)胞組分，自然殺傷細(xì)胞(Nature Killer Cell，NK細(xì)胞)擔(dān)任著對腫瘤和病原體胞內(nèi)感染細(xì)胞進(jìn)行免疫監(jiān)視的重要任務(wù)。體外擴(kuò)增NK細(xì)胞是NK細(xì)胞治療技術(shù)中一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，受到廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有的體外擴(kuò)增NK細(xì)胞技術(shù)種類多種多樣，目前主要的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)分為飼養(yǎng)細(xì)胞依賴和飼養(yǎng)細(xì)胞非依賴的兩種方式。其中飼養(yǎng)細(xì)胞非依賴的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)安全性較高，但是最終獲得細(xì)胞的純度不高，并且受到技術(shù)方法限制和供體個體差異的影響，難以達(dá)到一致的NK細(xì)胞擴(kuò)增純度。而NK細(xì)胞的純度則直接影響到細(xì)胞治療的效果，純度越高療效越好。

NK細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中除了NK細(xì)胞外，主要的雜細(xì)胞是CD3(Cluster Differentiation 3)陽性的細(xì)胞群體。傳統(tǒng)的提高NK細(xì)胞純度的方法為MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)磁珠分選技術(shù)。但是MACS磁珠分選技術(shù)會在NK細(xì)胞表面結(jié)合上磁珠，不能完全去除，存在可能的臨床應(yīng)用隱患，因而難以大規(guī)模應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種具有大規(guī)模應(yīng)用的前景的自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法。

一種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法，包括如下步驟：

提供CD3抗體溶液；

將所述CD3抗體溶液承裝在臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)，充分反應(yīng)后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器；

將待純化的自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物承裝在所述包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2h～4h后收集所述包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)的上清液；以及

對所述上清液進(jìn)行離心并保留細(xì)胞沉淀，洗滌所述細(xì)胞沉淀得到純化后的自然殺傷細(xì)胞。

在一個實(shí)施例中，所述CD3抗體溶液的溶質(zhì)為CD3單克隆抗體或CD3多克隆抗體；

所述CD3抗體溶液的濃度為100ng/mL～400ng/mL。

在一個實(shí)施例中，所述CD3抗體溶液的溶劑為PBS緩沖液或濃度為0.9g/100mL的NaCl溶液。

在一個實(shí)施例中，所述臨床級培養(yǎng)容器為培養(yǎng)表面未組織處理過的T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

在一個實(shí)施例中，所述充分反應(yīng)后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器的操作中，所述反應(yīng)的時間為8h～24h，所述反應(yīng)的溫度為2℃～8℃。

在一個實(shí)施例中，所述常規(guī)培養(yǎng)條件的溫度為37℃、5％CO₂。

在一個實(shí)施例中，所述對所述上清液進(jìn)行離心并保留細(xì)胞沉淀的操作中，所述離心的轉(zhuǎn)速為600rpm～1000rpm，所述離心的時間為5min～10min。

在一個實(shí)施例中，所述洗滌所述細(xì)胞沉淀的操作為：采用濃度為0.9g/100mL的NaCl溶液重懸所述細(xì)胞沉淀，接著600rpm～1000rpm離心5min～10min，保留洗滌干凈的細(xì)胞沉淀。

這種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法利用包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器承載自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物并培養(yǎng)，自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物中的CD3陽性的雜細(xì)胞會與CD3抗體結(jié)合從而附著在臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)壁，培養(yǎng)完成后收集臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)的上清即可得到純化后的自然殺傷細(xì)胞。相對于傳統(tǒng)的MACS磁珠分選技術(shù)，這種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法不會在純化后的自然殺傷細(xì)胞表面結(jié)合上磁珠之類的異物，具有大規(guī)模應(yīng)用的前景。

附圖說明

圖1為一實(shí)施方式的自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法的流程圖；

圖2為實(shí)施例1中自然殺傷細(xì)胞在純化前和純化后的細(xì)胞純度對比圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。

如圖1所示的一實(shí)施方式的一種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法，包括如下步驟：

S10、提供CD3抗體溶液。

CD3抗體溶液的溶質(zhì)可以為CD3單克隆抗體或CD3多克隆抗體。

CD3抗體溶液的濃度為100ng/mL～400ng/mL。

優(yōu)選的，CD3抗體溶液的濃度為100ng/mL～250ng/mL。

特別優(yōu)選的，CD3抗體溶液的濃度為200ng/mL。

CD3抗體溶液的溶劑為PBS緩沖液(pH為7.2～7.4)或生理鹽水。

生理鹽水為0.9g/100mL的NaCl溶液。

S20、將S10得到的CD3抗體溶液承裝在臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)，充分反應(yīng)后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器。

臨床級培養(yǎng)容器可以為培養(yǎng)表面未組織處理過的T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

充分反應(yīng)后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器的操作中，反應(yīng)的時間為8h～24h(優(yōu)選為12h)，反應(yīng)的溫度為2℃～8℃(優(yōu)選為4℃)。

S30、將待純化的自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物承裝在S20得到的包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2h～4h后收集包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)的上清液。

加入待純化的自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物前，先將表面包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器中的CD3抗體溶液移出，再承裝待純化的自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物。

常規(guī)培養(yǎng)條件的溫度為37℃、5％CO₂。

S40、對S30得到的上清液進(jìn)行離心并保留細(xì)胞沉淀，洗滌細(xì)胞沉淀得到純化后的自然殺傷細(xì)胞。

對上清液進(jìn)行離心并保留細(xì)胞沉淀的操作中，離心的轉(zhuǎn)速為600rpm～1000rpm，離心的時間為5min～10min。

洗滌細(xì)胞沉淀的操作為：采用生理鹽水(濃度為0.9g/mL的NaCl溶液)重懸細(xì)胞沉淀，接著600rpm～1000rpm離心5min～10min，保留洗滌干凈的細(xì)胞沉淀。

這種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法利用包被有CD3抗體的臨床級培養(yǎng)容器承載自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物并培養(yǎng)，自然殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)物中的CD3陽性的雜細(xì)胞會與CD3抗體結(jié)合從而附著在臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)壁，培養(yǎng)完成后收集臨床級培養(yǎng)容器內(nèi)的上清即可得到純化后的自然殺傷細(xì)胞。相對于傳統(tǒng)的MACS磁珠分選技術(shù)，這種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法不會在純化后的自然殺傷細(xì)胞表面結(jié)合上磁珠之類的異物，具有大規(guī)模應(yīng)用的前景。

此外，這種自然殺傷細(xì)胞的體外純化方法利用簡便易行的抗體粘附作用，將體外擴(kuò)增NK細(xì)胞培養(yǎng)體系中CD3⁺的非目標(biāo)細(xì)胞通過短時間的孵育選擇性去除，以提高NK細(xì)胞純度，獲得質(zhì)量更佳、安全性好的臨床用NK細(xì)胞，而成本可降低至現(xiàn)有基于MACS免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)的20％以下(分離1×10⁸cells約合需100元)。

以下為具體實(shí)施例。

實(shí)施例中采用藥物和儀器如非特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)選擇。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻(xiàn)、書本中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例1

將CD3單克隆抗體(購自Miltenyi Biotec)直接可溶性添加入1×PBS(Phosphate Buffer Solution)中，配制成濃度為100ng/mL的CD3單克隆抗體溶液。

將CD3單克隆抗體溶液承裝在培養(yǎng)表面未組織處理過的T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，4℃反應(yīng)12h后得到表面包被有CD3單克隆抗體的T175培養(yǎng)瓶。

將表面包被有CD3單克隆抗體的培養(yǎng)表面未組織處理過的T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的CD3單克隆抗體溶液移出，接著將待純化的NK細(xì)胞混合培養(yǎng)物30mL混勻后放入表面包被有CD3單克隆抗體的培養(yǎng)表面未組織處理過的T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5％CO₂培養(yǎng)3h后，收集培養(yǎng)表面未組織處理過的T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的上清液。

將上清液在1000rpm下離心5min，保留細(xì)胞沉淀。采用生理鹽水(濃度為0.9g/100mL的NaCl溶液)重懸細(xì)胞沉淀，接著600rpm離心510min，保留洗滌干凈的細(xì)胞沉淀即為純度提高的NK細(xì)胞。

對純化前及純化后的NK細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，純化前NK細(xì)胞純度為22.7％，純化后純度能達(dá)到73.8％，計(jì)算NK細(xì)胞得率為64％。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。