本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及體外免疫細(xì)胞制劑的修飾方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多發(fā)性硬化(MS)是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)免疫炎性脫髓鞘/變性疾病，傾向于青壯年罹患，且呈慢性病程，反復(fù)發(fā)作，進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能障礙，甚至癱瘓，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。

迄今為止，MS尚無(wú)有效的治愈手段，主要是抑制炎性脫髓鞘病變進(jìn)展，防止急性期病變惡化及緩解期復(fù)發(fā)，對(duì)癥和支持療法以減輕神經(jīng)功能障礙帶來(lái)的痛苦。目前中國(guó)MS患者的治療更是困難重重，包括FAD批準(zhǔn)的用于治療該病的藥物，如β-干擾素(IFN-β)、醋酸格拉太咪爾(GA)、那他珠單抗(NTZ)、Fingolimod(FTY270)等(Deograciaset al.,2012)，雖能一定程度緩解癥狀，減少?gòu)?fù)發(fā)，但并非對(duì)所有患者均有效，且不能影響不可逆的功能障礙及疾病的進(jìn)展。此外，最重要的是這些藥物要么沒(méi)有進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，要么價(jià)格昂貴。而MS患者需要長(zhǎng)期或終生治療，昂貴的費(fèi)用使得絕大多數(shù)中國(guó)MS患者無(wú)法承受。因此，皮質(zhì)類(lèi)固醇仍然是目前中國(guó)MS患者的主要治療藥物，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)急性復(fù)發(fā)的恢復(fù)和縮短復(fù)發(fā)期病程，但不能改善恢復(fù)程度，長(zhǎng)期應(yīng)用不能防止復(fù)發(fā)，且可出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、糖尿病等(Minagar A.,2013)。

近幾年干細(xì)胞移植為神經(jīng)變性疾病的治療提供了廣闊的前景。造血干細(xì)胞(HSC)移植通過(guò)免疫重建，使CNS產(chǎn)生免疫耐受，以達(dá)到治療目的，但HSC移植只有在MS患者其他治療手段無(wú)效的情況下才考慮應(yīng)用。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是來(lái)源于神經(jīng)組織或能分化為神經(jīng)組織，具有自我更新能力和多向分化潛能的一類(lèi)細(xì)胞，已成為治療神經(jīng)變性疾病的熱點(diǎn)。隨著NSCs研究的深入，越來(lái)越多的理論和技術(shù)問(wèn)題有待進(jìn)一步完善和規(guī)范：①NSCs的來(lái)源選擇：NSCs在神經(jīng)組織中的位置比較深，獲得自體NSCs就會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的損傷；如果從胎兒體內(nèi)獲取NSCs，即使是流產(chǎn)的胎兒，也存在倫理問(wèn)題。②NSCs的數(shù)量：研究發(fā)現(xiàn)，NSCs對(duì)神經(jīng)行為功能改善有明顯的劑量依賴(lài)性，低于一定劑量，不能改善功能，而自體很難獲得足夠量的NSCs。③NSCs的免疫反應(yīng)：腦組織是一個(gè)相對(duì)免疫缺陷器官，NSCs具有低免疫原性的特點(diǎn)。在理論上，NSCs作為一種處于相對(duì)原始狀態(tài)的細(xì)胞，不表達(dá)成熟細(xì)胞抗原。然而，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，新分離的和傳代的NSCs細(xì)胞膜表面均有MHC I類(lèi)和II類(lèi)分子表達(dá)，說(shuō)明其仍然存在一定免疫原性，異體NSCs移植不可避免存在免疫排斥反應(yīng)。④NSCs的安全性：體外培養(yǎng)的NSCs因傳代過(guò)多而活力下降，生物學(xué)性狀部分改變，作為轉(zhuǎn)基因載體NSCs存在可能帶來(lái)潛在致病基因，甚至發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變等問(wèn)題，因此NSCs移植在體內(nèi)的成瘤性問(wèn)題及其增殖、分化和遷移等仍需長(zhǎng)期觀(guān)察(Joyce et al.,2010；Lukovicet al.,2015；Ratajczaket al.,2014)。

MS是以髓鞘特異性自身反應(yīng)性CD4⁺T細(xì)胞介導(dǎo)為主的自身免疫性疾病，一直以來(lái)Th1/Th2細(xì)胞反應(yīng)失衡被認(rèn)為在MS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Th1和Th2是CD4⁺T細(xì)胞分化的，功能和細(xì)胞因子分泌方式相反的2種輔助性T(Th)細(xì)胞。Th1可分泌致炎性細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、GM-CSF等，輔助細(xì)胞免疫，介導(dǎo)細(xì)胞毒作用；而IFN-γ、IL-1β等又可促進(jìn)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，使炎性病灶進(jìn)一步擴(kuò)大(Jiang et al.,2006)。Th2可分泌IL-4、IL-10、TGF-β等，輔助體液免疫，對(duì)Th1細(xì)胞的增殖呈負(fù)反饋效應(yīng)(Zhou et al.,2014)。在MS的病理過(guò)程中除Thl細(xì)胞外，由CD4⁺T細(xì)胞分化而來(lái)的Th17細(xì)胞似乎在MS中發(fā)揮更為重要作用。Th17細(xì)胞是獨(dú)立于Th1和Th2細(xì)胞的Th細(xì)胞亞群，分泌IL-17為細(xì)胞因子，后者是一種較強(qiáng)的致炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌，介導(dǎo)組織炎癥及破壞(Kanakasabai et al.,2011)。其中Thl和Th17是MS的主要參與者，其表達(dá)與MS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；而Th2細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或抑制性T細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、髓鞘保護(hù)作用，能改善MS發(fā)病的嚴(yán)重程度(Munegowda et al.,2011；Liu et al.,2013)。

另外，巨噬細(xì)胞作為外周免疫系統(tǒng)重要的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，具有激活T細(xì)胞，遷移，包圍死細(xì)胞及清除細(xì)胞碎片等多種生物學(xué)行為(Eroglu et al.,2010)。系列研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是一種具有可塑性和多功能的細(xì)胞群體，其表型和功能狀態(tài)可隨微環(huán)境的改變發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)極大的特質(zhì)性。近年來(lái)巨噬細(xì)胞的極化受到普遍關(guān)注，并受各種微環(huán)境信號(hào)的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)(Zhang et al.,2013)。Th1型細(xì)胞因子IFN-γ促使單核細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞分化。M1型巨噬細(xì)胞作為APC參與Th1和Th17T細(xì)胞激活，由此產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α則可進(jìn)一步使M1炎性巨噬細(xì)胞分化和激活，從而放大免疫炎性反應(yīng)。因此，M1型巨噬細(xì)胞在MS疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的促進(jìn)作用。M2型巨噬細(xì)胞則可由Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10等分化和激活，參與介導(dǎo)Th2細(xì)胞和CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，為改善EAE炎性反應(yīng)微環(huán)境，減少髓鞘脫失和神經(jīng)元變性奠定了細(xì)胞分子基礎(chǔ)(Mikitaet al.,2011；Jiang et al.,2014)。

總而言之，免疫炎性是介導(dǎo)MS發(fā)病的重要機(jī)制，基于此我們可以設(shè)想一種新的MS干預(yù)治療策略，即一種體外修飾免疫炎性細(xì)胞，使其功能發(fā)生逆轉(zhuǎn)，然后回輸?shù)闹委煼椒ā?/p>

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)與MS具有許多相似的臨床表現(xiàn)和病理過(guò)程，被認(rèn)為是探討MS治療策略的理想動(dòng)物模型。抑制Rho激酶(ROCK)表達(dá)目前被認(rèn)為是治療MS或神經(jīng)變性病的潛在藥物靶點(diǎn)。Fasudil作為選擇性ROCK抑制劑，大量研究表明其具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，減輕微血管通透性增加，減少炎癥細(xì)胞遷移及保護(hù)受損神經(jīng)元等功能。我們知道MS是一個(gè)復(fù)發(fā)-緩解，且需要長(zhǎng)期治療的慢性疾病，雖然Fasudil顯示了良好的治療效果，但迅速明顯的血管擴(kuò)張作用，口服生物利用度很差，藥物口服劑型的研發(fā)一直沒(méi)有成功，長(zhǎng)期使用的安全窗較小等因素限制了其在MS患者的臨床應(yīng)用。

針對(duì)MS的發(fā)生機(jī)制、治療現(xiàn)狀及Fasudil治療MS的優(yōu)缺點(diǎn)，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)：

1.一種體外修飾免疫細(xì)胞的方法，所述方法包括將免疫細(xì)胞用Fasudil體外修飾。

2.一種免疫細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞用Fasudil體外修飾。

3.一種制劑，所述制劑包含用Fasudil體外修飾的免疫細(xì)胞。

4.根據(jù)1所述的方法、2所述的免疫細(xì)胞或3所述的制劑，其中所述免疫細(xì)胞是T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。

5.根據(jù)1所述的方法、2所述的免疫細(xì)胞或3所述的制劑，其中所述免疫細(xì)胞分離自小鼠EAE模型。

6.一種用于治療神經(jīng)變性疾病的試劑盒，所述試劑盒中包含2所述的免疫細(xì)胞或3中所述的制劑。

7.根據(jù)6所述的試劑盒，所述神經(jīng)變性疾病包括多發(fā)性硬化。

8.2所述的免疫細(xì)胞或3所述的制劑在制備用于治療神經(jīng)變性疾病的試劑盒中的用途，所述治療包括將2所述的免疫細(xì)胞或3所述的制劑回輸入患者體內(nèi)的步驟。

9.根據(jù)8所述的用途，所述神經(jīng)變性疾病包括多發(fā)性硬化。

在本發(fā)明中，“致腦炎性免疫細(xì)胞”是指導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的免疫細(xì)胞。“治腦炎性免疫細(xì)胞”是指治療炎癥反應(yīng)的免疫細(xì)胞。

在本發(fā)明中，“免疫細(xì)胞”為一種總稱(chēng)，包括引起疾病的免疫炎性細(xì)胞和治療疾病的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞等。

具體而言，本發(fā)明提供了一種Fasudil體外修飾免疫炎性細(xì)胞，再靜脈回輸治療EAE的方法，該方法包括下列內(nèi)容：

(1)治腦炎性免疫細(xì)胞—Fasudil修飾的巨噬細(xì)胞治療EAE小鼠的方法及應(yīng)用：①建立MOG_35-55誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠慢性EAE模型；②免疫后第9天制備脾臟致腦炎性單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)；③磁珠分選致腦炎性巨噬細(xì)胞，以3×10⁶/ml與Fasudil(20μg/ml)或PBS，置5％CO₂培養(yǎng)箱37℃常規(guī)培養(yǎng)72h；④收集上述細(xì)胞，分析巨噬細(xì)胞經(jīng)Fasudil處理后的表型和功能，信號(hào)通路及相關(guān)蛋白測(cè)定，蛋白芯片分析，趨化因子和粘附分子測(cè)定，細(xì)胞移動(dòng)能力檢測(cè)，為后續(xù)體內(nèi)療效奠定依據(jù)；⑤建立MOG_35-55誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠慢性EAE模型，將Fasudil/PBS體外修飾的巨噬細(xì)胞(2×10⁷/200μl/只小鼠)洗碟去除Fasudil后，在免疫后第3天靜脈回輸，觀(guān)察其對(duì)EAE的治療效果。未經(jīng)Fasudil體外修飾的巨噬細(xì)胞設(shè)為對(duì)照。

(2)治腦炎性免疫細(xì)胞—Fasudil修飾的T細(xì)胞治療EAE小鼠的方法及應(yīng)用：①建立MOG_35-55誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠慢性EAE模型；②免疫后第9天制備脾臟致腦炎性MNCs；③磁珠分選致腦炎性T細(xì)胞，3×10⁶/ml與Fasudil(20μg/ml)或PBS、IL-2(20ng/ml)，置5％CO₂培養(yǎng)箱37℃常規(guī)培養(yǎng)72h；④收集上述細(xì)胞，分析T細(xì)胞經(jīng)Fasudil處理后的表型和功能，信號(hào)通路及相關(guān)蛋白測(cè)定，蛋白芯片分析，趨化因子和粘附分子測(cè)定，細(xì)胞移動(dòng)能力檢測(cè)，為后續(xù)體內(nèi)療效奠定依據(jù)；⑤建立MOG_35-55誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠慢性EAE模型，將Fasudil/PBS體外修飾的T細(xì)胞(2×10⁷/200μl/只小鼠)洗碟去除Fasudil后，在免疫后第3天靜脈回輸，觀(guān)察其對(duì)EAE的治療效果。未經(jīng)Fasudil體外修飾的T細(xì)胞設(shè)為對(duì)照。

附圖說(shuō)明

圖1.Fasudil修飾的巨噬細(xì)胞對(duì)EAE小鼠癥狀評(píng)分和體重的影響

圖2.Fasudil影響巨噬細(xì)胞水平

圖3.Fasudil影響IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子分泌

圖4.Fasudil影響NO水平

圖5.Fasudil修飾的T細(xì)胞對(duì)EAE小鼠癥狀評(píng)分和體重的影響

圖6.Fasudil影響T細(xì)胞水平

圖7.Fasudil影響IL-10、IL-17、IFN-γ細(xì)胞因子分泌

具體實(shí)施方式

1、動(dòng)物與材料

100只8-10周齡，雌性C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華公司。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽(MOG_35-55)由西安聯(lián)美生物科技有限公司制備；百日咳毒素(PTX)購(gòu)自ALEXIS公司；完全弗氏佐劑(CFA)，皂甙(saponin)，兔抗小鼠CD4抗體購(gòu)自Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌(TB)，PE標(biāo)記的IFN-γ、IL-10、IL-17、TGF-β、CD16/32、IL-12、CD40、CD206、CD14、精氨酸酶-1(Arg-1)抗體購(gòu)自BD公司；兔抗小鼠一氧化氮合酶(iNOS)抗體購(gòu)自EnZo公司；胎牛血清(BSA)購(gòu)自Gibco公司；IL-10、IFN-γ、IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-6測(cè)定ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；CD11b MicroBeads、T cell MicroBeads、LS分選柱購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；Fasudil購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)方法

(1)主動(dòng)免疫EAE模型的建立

清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠，無(wú)病源菌實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)一周。MOG_35-55溶液與TB和CFA按水劑和油劑等體積混合，用針管混合器反復(fù)抽推形成油包水樣乳白色抗原乳液，靜置后無(wú)水油分離為合格。小鼠按0.1ml/只分4點(diǎn)脊柱皮下注射抗原乳劑。免疫當(dāng)天和48小時(shí)內(nèi)分別腹腔注射500ng/只PTX以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

(2)分離純化脾臟致腦炎性MNCs

主動(dòng)免疫第9天EAE小鼠，無(wú)菌操作取脾臟，置于預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中，用一次性注射器針芯研磨，40μm尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心300×g，10min，棄上清，按2ml/管加入無(wú)菌雙蒸水裂解紅細(xì)胞，45s后按1ml/管加入2.7％NaCl恢復(fù)等滲，離心300×g，10min，棄上清，重懸，過(guò)濾去除細(xì)胞膜和碎片，用完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

(3)磁珠分選致腦炎性巨噬細(xì)胞

取致腦炎性MNCs加10ml PBS，離心300×g，10min，棄上清；每10⁷個(gè)細(xì)胞加90μl的buffer緩沖液(PBS緩沖液中加0.5％的BSA和1mM EDTA，調(diào)pH到7.2)和10μl的CD11b MicroBeads；充分混合后，置4℃反應(yīng)15min。10ml的buffer緩沖液，離心300×g，10min。每10⁸個(gè)細(xì)胞加500μl的buffer緩沖液，準(zhǔn)備上柱分選巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的分選屬陽(yáng)性選擇，將4ml結(jié)合CD11b MACS微珠的細(xì)胞懸液緩慢加入LS分選柱中，加3ml buffer緩沖液沖洗，將LS分選柱撤離磁場(chǎng)，用5ml buffer緩沖液快速加壓沖洗LS分選柱，收集巨噬細(xì)胞。

(4)磁珠分選致腦炎性T細(xì)胞

取致腦炎性MNCs加10ml PBS，離心300×g，10min，棄上清；每10⁷個(gè)細(xì)胞加40μl的buffer緩沖液和10μl的Biotin-Antibody Cocktail；充分混合后，4℃反應(yīng)10min。然后再加30μl的buffer緩沖液和20μl的Anti-Biotin MicroBeads，充分混合后置4℃反應(yīng)15min。然后，再加10ml的buffer緩沖液，離心300×g，10min。每10⁸個(gè)細(xì)胞加500μl的buffer緩沖液，準(zhǔn)備上柱分選T細(xì)胞。T細(xì)胞的分選屬陰性選擇，將上述細(xì)胞懸液緩慢加入LS分選柱中，收集T細(xì)胞。

(5)治療主動(dòng)免疫EAE小鼠

建立MOG_35-55誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠慢性EAE模型，致腦炎性巨噬細(xì)胞以3×10⁶/ml與Fasudil(20ug/ml)或PBS，置5％CO₂培養(yǎng)箱37℃常規(guī)培養(yǎng)72h；收集上述細(xì)胞，洗碟去除Fasudil后，按2×10⁷個(gè)細(xì)胞懸于200μl PBS中，腹腔注射至3天前經(jīng)過(guò)MOG_35-55誘導(dǎo)的EAE小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為主動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE模型+PBS-巨噬細(xì)胞(PBS-)(n＝8)組和主動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE模型+Fasudil-巨噬細(xì)胞(Fasudil-)(n＝8)組，免疫當(dāng)天和48小時(shí)內(nèi)各組小鼠分別腹腔注射PTX 500ng/只作為免疫增強(qiáng)劑。

建立MOG_35-55誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠慢性EAE模型，致腦炎性T細(xì)胞以3×10⁶/ml與Fasudil(20ug/ml)或PBS及IL-2(20ng/ml)，置5％CO₂培養(yǎng)箱37℃常規(guī)培養(yǎng)72h；收集上述細(xì)胞，洗碟去除Fasudil后，按2×10⁷個(gè)細(xì)胞懸于200μl PBS中，腹腔注射至3天前經(jīng)過(guò)MOG_35-55誘導(dǎo)的EAE小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為主動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE模型+PBS-T細(xì)胞(PBS-T)(n＝8)組和主動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE模型+Fasudil-T細(xì)胞(Fasudil-T)(n＝8)組，免疫當(dāng)天和48小時(shí)內(nèi)各組小鼠分別腹腔注射PTX 500ng/只作為免疫增強(qiáng)劑。

(6)臨床評(píng)分

被動(dòng)轉(zhuǎn)移或主動(dòng)免疫EAE模型，當(dāng)日開(kāi)始隔日測(cè)量體重；同時(shí)，采用Kono的5分制小鼠EAE評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行臨床評(píng)分。0分：無(wú)癥狀；1分：尾巴無(wú)力；2分：尾麻痹及輕微后肢無(wú)力；3分：尾麻痹及重度后肢無(wú)力；4分：尾麻痹及四肢麻痹；5分：瀕死或死亡。癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5分計(jì)。

(7)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)

各類(lèi)細(xì)胞懸于50μl 0.1％saponin/1％BSA-PBS破膜劑或1％BSA-PBS緩沖液中，分別加1μl抗體，包括PE-IFN-γ、IL-10、IL-17、TGF-β、CD16/32、IL-12、CD40、CD206、CD14抗體，室溫避光20min，PBS洗2次，加500μl PBS，流式細(xì)胞儀待檢。iNOS、Arg-1采用間接免疫熒光染色法檢測(cè)：細(xì)胞懸于50μl 0.1％saponin/1％BSA-PBS破膜劑(0.1％saponin/1％BSA-PBS)中，加1μl iNOS、Arg-1抗體，室溫避光20min，PBS洗滌后再加1μl的Alexa Flour 555標(biāo)記的相應(yīng)的二抗，室溫避光20min，PBS洗2次，加500μl PBS，流式細(xì)胞儀待檢。

(8)細(xì)胞因子檢測(cè)

參照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中INF-γ、IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。96孔板中分別加入100μl的INF-γ、IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6、IL-1β捕獲抗體，密封后4℃過(guò)夜；次日用洗滌緩沖液洗3次，向96孔板中分別加入200μl封閉液，室溫封閉1h；洗滌液洗滌3次，按100μl/孔加入待測(cè)上清液，每板設(shè)2個(gè)空白對(duì)照孔，各加入100μl DMEM不完全培養(yǎng)液，室溫下孵育2h；用洗滌緩沖液洗3次，各孔加入100μl的相應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體，室溫下孵育1h；洗滌緩沖液洗滌3次，加入100μl親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，室溫下孵育45min；用洗滌液清洗3次后，加入100μl酶作用底物，室溫孵育15～20min底物顯色后，加入50μl終止液，在450nm測(cè)定吸光度值，以不同細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度，表示為pg/ml。

(9)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 4統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。組間臨床癥狀評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)，其余組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用χ²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1、治腦炎性免疫細(xì)胞—Fasudil修飾的巨噬細(xì)胞可改善EAE小鼠臨床癥狀

PBS-組小鼠于免疫后第9日起相繼發(fā)病，其發(fā)病率、起始發(fā)病時(shí)間、平均高峰期評(píng)分見(jiàn)表1。與PBS-組相比，F(xiàn)asudil-組小鼠起病較晚(P<0.01)，累計(jì)臨床評(píng)分較輕(P<0.01)；各組小鼠臨床癥狀評(píng)分和體重變化結(jié)果顯示，F(xiàn)asudil-組小鼠臨床癥狀評(píng)分較低，體重減輕較小，見(jiàn)圖1。

表1各組小鼠的發(fā)病情況

與PBS-組比較，**P<0.01

2、Fasudil對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

主動(dòng)免疫第9天EAE小鼠，磁珠分選致腦炎性巨噬細(xì)胞，和/無(wú)Fasudil培養(yǎng)，作用72h后，觀(guān)察Fasudil對(duì)巨噬細(xì)胞亞型變化的影響。結(jié)果顯示(圖2)，體外Fasudil培養(yǎng)可明顯抑制M1型巨噬細(xì)胞CD16/32(P<0.01)、iNOS(P<0.01)、IL-12(P<0.01)的表達(dá)，并增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞IL-10(P<0.001)、CD14(P<0.05)的表達(dá)。

ELISA法檢測(cè)上清液中炎性細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示(圖3)，F(xiàn)asudil可減少巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，證實(shí)Fasudil修飾可抑制致腦炎性巨噬細(xì)胞的比例，減少體內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)。

我們進(jìn)一步用Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Nitrite水平，結(jié)果也顯示Fasudil修飾可降低NO的產(chǎn)生(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)Fasudil修飾可抑制M1炎性巨噬細(xì)胞表達(dá)。

3、治腦炎性免疫細(xì)胞—Fasudil修飾的T細(xì)胞可減輕EAE小鼠臨床癥狀

PBS-T細(xì)胞組小鼠于免疫后第11日起相繼發(fā)病，其發(fā)病率、起始發(fā)病時(shí)間、平均高峰期評(píng)分見(jiàn)表2。與PBS-T細(xì)胞組相比，F(xiàn)asudil-T細(xì)胞組小鼠起病較晚(P<0.01)，累計(jì)臨床評(píng)分較輕(P<0.01)；各組小鼠臨床癥狀評(píng)分和體重變化結(jié)果顯示，F(xiàn)asudil-T組小鼠臨床癥狀評(píng)分較低，體重減輕較小，見(jiàn)圖5。

表2各組小鼠的發(fā)病情況

與PBS-T細(xì)胞組比較，*P<0.05，**P<0.01

4、Fasudil對(duì)T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

主動(dòng)免疫第9天EAE小鼠，磁珠分選致腦炎性T細(xì)胞，和/無(wú)Fasudil培養(yǎng)，作用72h后，觀(guān)察Fasudil對(duì)T細(xì)胞亞型變化的影響。結(jié)果顯示(圖6)，體外Fasudil培養(yǎng)可明顯抑制IL-17(P<0.05)的表達(dá)，并增強(qiáng)IL-10(P<0.001)的水平。

ELISA法檢測(cè)上清液中T細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示(圖7)，F(xiàn)asudil可增強(qiáng)T細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10的水平，證實(shí)Fasudil修飾可調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的比例，促進(jìn)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。