本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種哈蟆油真?zhèn)舞b別的方法及專用引物。

背景技術(shù)：

哈蟆油(Ranae oviductus)為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得。具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功效，用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血。是一種集食用藥用于一身的名貴中藥材。由于多方面原因?qū)е鹿∮蛧?yán)重的供不應(yīng)求，致使偽品充斥于市。目前市場(chǎng)上的偽品哈蟆油主要有黑龍江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油4類，其它偽品類型少見。2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定哈蟆油的鑒別方法為性狀鑒定、高效液相色譜法鑒定及膨脹度測(cè)定法，但這些方法易受人為因素、環(huán)境條件或藥材本身的限制，實(shí)踐中哈蟆油的鑒定仍感到十分困難。

隨著分子生藥學(xué)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)在哈蟆油藥材的鑒別中得到不斷的應(yīng)用，很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒別方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鑒別方法，從模板的提取、PCR反應(yīng)到最終結(jié)果分析，單個(gè)樣品的鑒定步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且需要電泳檢測(cè)或序列分析比對(duì)，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別的使用。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)已成為中藥材傳統(tǒng)鑒別方法的有益補(bǔ)充。有關(guān)哈蟆油的PCR鑒別方法已有報(bào)道，但是由于哈蟆油藥材本身遇水膨脹，給哈蟆油的DNA提取帶來極大的困難，提取過程復(fù)雜，成功率低，制約了該方法的深入應(yīng)用。

快速PCR在保證PCR反應(yīng)特異性和準(zhǔn)確性的前提下，通過縮短反應(yīng)時(shí)間來達(dá)到快速檢測(cè)目的，尤其是和熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率，有望實(shí)現(xiàn)中藥材的現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)?？焖貾CR技術(shù)和產(chǎn)物熒光檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)，對(duì)引物設(shè)計(jì)有嚴(yán)格的要求。為達(dá)到快速擴(kuò)增的目的，設(shè)計(jì)引物時(shí)上下游引物距SNP位點(diǎn)盡可能近，PCR產(chǎn)物應(yīng)盡可能短；引物Tm值與延伸溫度接近，以減少PCR反應(yīng)的升降溫溫差。為達(dá)到使用熒光檢測(cè)的目的，引物設(shè)計(jì)應(yīng)避免引物二聚體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，這就要求引物質(zhì)量要好，擴(kuò)增過程中無引物二聚體的產(chǎn)生；使用的酶質(zhì)量要好，能有效抑制引物二聚體的形成；有些情況下引物二聚體是不可避免的，可以通過調(diào)整酶、引物用量、加入PCR增強(qiáng)劑等方法，減少其對(duì)熒光檢測(cè)結(jié)果的影響。

近年來，快速PCR方法已成功用于金銀花，蛇類，太子參，人參、西洋參等中藥材的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于哈蟆油真?zhèn)舞b別的引物對(duì)。

本發(fā)明提供的引物對(duì)，為能擴(kuò)增出DNA片段A的引物對(duì)；

所述DNA片段A是以哈蟆油為模板，用序列1和序列2所示引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增得到的產(chǎn)物。

上述引物對(duì)中，所述DNA片段A的核苷酸序列為序列5；

或，所述引物對(duì)由引物1和引物2組成；

所述引物1為如下1)或2)：

1)為序列1所示的單鏈DNA分子；

2)為序列1刪除和/或增加和/或改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA分子；

所述引物2為如下3)或4)：

3)為序列2所示的單鏈DNA分子；

4)為序列2刪除和/或增加和/或改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA分子。

本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助哈蟆油的PCR試劑。

上述PCR試劑中，包括上述的引物對(duì)、DNA聚合酶和dNTP。

上述PCR試劑中，

所述引物對(duì)中每條引物在所述PCR試劑中的濃度均為2nmol/l；

和/或，各個(gè)dNTP在所述PCR試劑中的濃度具體為2.5nmol/l；

和/或，所述DNA聚合酶具體為SpeedStar HS Taq DNA聚合酶或Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定哈蟆油的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，，包括上述的引物或上述的PCR試劑。

上述DNA片段A也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的引物或上述的PCR試劑或上述的試劑盒或上述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍：

(A1)鑒定或輔助鑒定哈蟆油；

(A2)鑒別或輔助鑒別哈蟆油；

(A3)鑒別或輔助鑒別哈蟆油及其偽品；

(A4)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品是否為哈蟆油；

(A5)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品是哈蟆油還是其偽品。

本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否為哈蟆油的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有權(quán)利要求6所述的DNA片段A；如果含有，則待測(cè)樣品為或候選為哈蟆油；如果不含有，則待測(cè)樣品不為或候選不為哈蟆油。

上述方法中，

所述檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有DNA片段A的方法包括如下步驟：

1)用上述的引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

2)用如下a或b檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：

a、向所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入DNA熒光染料，紫外檢測(cè)，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有熒光，則待測(cè)樣品含有所述DNA片段A，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無熒光，則待測(cè)樣品不含有所述DNA片段A；

b、檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小，若大小為520-530bp，則所述待測(cè)樣品含有所述DNA片段A，若大小不為520-530bp，則所述待測(cè)樣品不含有所述DNA片段A。

上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)樣品的基因組DNA；

所述PCR擴(kuò)增條件為90℃3s，62℃20s，32個(gè)循環(huán)。

所述DNA片段A的核苷酸序列為序列表中序列5。

所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1。

所述PCR試劑由上述的引物對(duì)、DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液和水組成。

所述偽品具體為黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油和/或牛蛙油。

本項(xiàng)研究基于快速PCR方法對(duì)哈蟆油及其常見混偽品(黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油)進(jìn)行鑒別研究，有效的提高哈蟆油鑒別反應(yīng)效率，為哈蟆油藥材的鑒別提供更加符合實(shí)際需要、簡(jiǎn)便快捷的方法。

上述待測(cè)樣品通過堿裂解法獲得DNA，整個(gè)提取過程僅需5min即可完成，為后續(xù)快速PCR方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過對(duì)位點(diǎn)特異性PCR進(jìn)行條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在40min內(nèi)簡(jiǎn)單、快速、直觀的鑒別哈蟆油及其常見混偽品的目的，有助于實(shí)現(xiàn)哈蟆油藥材現(xiàn)場(chǎng)、準(zhǔn)確、快速鑒定。本研究對(duì)哈蟆油常見的4種蛙類混偽品進(jìn)行了鑒別研究，對(duì)于哈蟆油非蛙類的偽品如：鱈魚精巢及瓊脂蛋白胨、馬鈴薯加工品沒有涉及，因此本研究所建立方法對(duì)于非蛙類偽品的適用性有待于進(jìn)一步研究。

附圖說明

圖1為mcb398/mcb869通用引物擴(kuò)增。

圖2為引物篩選電泳圖。

圖3為樣品驗(yàn)證圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中藥材為收集不同產(chǎn)地中國(guó)林蛙10批、黑龍江林蛙4批、黑斑蛙4批、中華大蟾蜍4批，牛蛙2批、哈蟆油3批、牛蛙油1批。所有基原動(dòng)物按傳統(tǒng)加工方法分別制成哈蟆油、黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另選取哈蟆油藥材3批進(jìn)行快速PCR方法研究。樣品分別采自吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、江蘇、湖南、四川等地。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料

下述實(shí)施例中部分儀器如下：S1000型梯度PCR儀(Bio-rad公司)；ETC811型PCR儀(東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)；22R型高速冷凍微量離心機(jī)(Beckman公司)；ZH-2型漩渦震蕩器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；MM400型球磨機(jī)(Retsch公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；310型凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)，2000C型分光光度計(jì)(NanoDrop公司)。

下述實(shí)施例中部分試劑如下：瓊脂糖(西班牙Biowestagarose)；Gelred購(gòu)自Biotium公司；SpeedStar HS TaqDNA聚合酶、r Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNAMarker購(gòu)自TaKaRa公司；Transfast Taq DNA聚合酶購(gòu)自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶購(gòu)自Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ購(gòu)自Invitrogen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

實(shí)施例1、哈蟆油真?zhèn)舞b別引物的設(shè)計(jì)和方法的建立

一、基于Cytb序列的哈蟆油位點(diǎn)特異性鑒別引物設(shè)計(jì)

從GenBank中下載得到中國(guó)林蛙、黑龍江林蛙、黑斑蛙、中華大蟾蜍、牛蛙Cyt b序列。測(cè)序所得序列使用軟件CodonCode Aligner校對(duì)拼接，去除引物區(qū)，將下載和測(cè)序獲得序列使用BioEdit軟件進(jìn)行比對(duì)，篩選出哈蟆油特有的變異位點(diǎn)，根據(jù)變異位點(diǎn)使用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在引物3′末端倒數(shù)第二位引入人為錯(cuò)配。設(shè)計(jì)出2對(duì)鑒別引物，別命名為155S-F/155S-R(擴(kuò)增片段約為530bp，序列5)，698S-F/698S-R(擴(kuò)增片段約為105bp)，序列見表2。引物由Invitrogen公司合成。

表2 引物及PCR反應(yīng)條件

二、哈蟆油真?zhèn)舞b別方法的建立

1、基因組DNA提取及檢測(cè)

稱取10mg研磨好的表1所示的藥材粉末，使用堿裂解法提取總DNA，采用10％的Chelex-100進(jìn)行純化，并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度。

將濃度稀釋為20ng·μL^-1，于-20℃保存?zhèn)溆谩＿x擇通用引物mcb398和mcb869對(duì)哈蟆油及其混偽品樣品進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列及擴(kuò)增程序見表2。

PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

結(jié)果如圖1所示，M:DL2000Marker；1-13：哈蟆油；14-17：黑龍江林蛙油；18-21：蟾蜍油；22-25：黑斑蛙油；26-27：牛蛙油；28：陰性對(duì)照；表明提取的DNA可以滿足PCR反應(yīng)的要求。

2、引物的優(yōu)化

根據(jù)引物的Tm值及產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)置PCR反應(yīng)的初始反應(yīng)條件如下：

20μL PCR反應(yīng)體系：2.0μL 10×buffer，1.6μL dNTPs(2.5mmol·L-1)，0.5μL上游及下游引物(10mmol·L-1)，0.1μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL(約20ng)模板DNA，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)在S1000型PCR儀上進(jìn)行，初始反應(yīng)程序見表2。

上述上游及下游引物分別為155S-F/155S-R和698S-F/698S-R。

反應(yīng)結(jié)束后取PCR反應(yīng)產(chǎn)物6μL，加入2μL 6×Loading buffer混勻后于Gelred染色的1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

結(jié)果如圖2所示，A為698S-F/698S-R擴(kuò)增電泳圖，其中，左到右的泳道分別為M：Marker；1，2：哈蟆油；3：黑龍江林蛙油；4：黑斑蛙油；5：蟾蜍油；6：牛蛙油；B為155S-F/155S-R擴(kuò)增電泳圖，其中，左到右的泳道分別為M：Marker；1，2：哈蟆油；3：黑龍江林蛙油；4：黑斑蛙油；5：蟾蜍油；6：牛蛙油,可以看出，設(shè)計(jì)的2對(duì)位點(diǎn)特異性鑒別引物中，155S-F/155S-R的PCR擴(kuò)增特異性較698S-S/698S-R引物好，故本研究選取155S-F/155S-R作為哈蟆油及其偽品的鑒別引物，具體方法如下：

用155S-F/155S-R擴(kuò)增待測(cè)樣本，若得到155S-F/155S-R對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)樣本為或候選為哈蟆油，若未得到該擴(kuò)增產(chǎn)物，則為或候選為哈蟆油偽品。155S-F/155S-R對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為530bp，530bp擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列5。

3、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

在位點(diǎn)特異性PCR引物設(shè)計(jì)中人為的引入了錯(cuò)配位點(diǎn)，因此要求嚴(yán)格的反應(yīng)條件，兼顧快速PCR的擴(kuò)增效率，本文采用兩步法，30個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上依次對(duì)退火溫度、循環(huán)數(shù)、變性溫度、變性時(shí)間、退火時(shí)間、引物用量、dNTP用量、哈蟆油模板DNA用量進(jìn)行考察。

20μL PCR反應(yīng)體系：2.0μL 10×buffer(TaKaRa公司，RR070A)，1.6μL dNTPs，0.5μL 155S-F，0.5μL 155S-R，0.2μL DNA聚合酶，1μL(約20ng)模板DNA，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。

上述Taq酶種類分別如下：rTaq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Phanta Max Super-Fidel ity DNA聚合酶，Transfast Taq DNA聚合酶；

上述各條引物在反應(yīng)體系中的終濃度分別為2、3、5pmol/L；

上述dDNP在反應(yīng)體系中的終濃度分別為2.5nmol、4nmol/L。

上述模板DNA在反應(yīng)體系中的終濃度分別為10—60ng；

上述PCR擴(kuò)增采用不同PCR儀分別如下：S1000型PCR儀(Bio-rad公司)，ETC811型PCR儀(東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，

上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序如下：95，90，88，86℃變性5，3，1s；65，64，62，61，60℃退火20，18，16，10s；35，32，30，28個(gè)循環(huán)。

結(jié)果如下，①在退火溫度60-64℃，哈蟆油擴(kuò)增條帶隨溫度的升高逐漸減弱，62℃時(shí)目的條帶亮度較強(qiáng)，混偽品均未檢出條帶，熒光檢測(cè)結(jié)果與電泳結(jié)果一致，故本研究選擇62℃作為退火延伸溫度。②當(dāng)循環(huán)數(shù)≥30時(shí)，哈蟆油樣品可以得到目的條帶，但是循環(huán)數(shù)為30時(shí)，熒光檢測(cè)結(jié)果不明顯，兼顧擴(kuò)增產(chǎn)量與反應(yīng)時(shí)間，故本文選擇32次循環(huán)。③當(dāng)變性溫度≥88℃時(shí)，可以得到目的條帶，隨著變性溫度的降低，PCR成功率隨著降低，但是88℃時(shí)條帶弱，故選擇90℃作為變性溫度。④變性時(shí)間為3s時(shí)仍然可以進(jìn)行有效擴(kuò)增，故選擇3s作為變性時(shí)間。⑤退火延伸時(shí)間對(duì)擴(kuò)增成功率有著重要影響，退火時(shí)間超過18s時(shí)才能獲得有效的擴(kuò)增，此次選擇20s為退火時(shí)間。⑥當(dāng)引物用量在2-5nmol時(shí)，哈蟆油樣品有目的條帶，但是隨著引物用量的提高，正品與混偽品的熒光檢測(cè)結(jié)果區(qū)別越不顯著，這可能是生成了引物二聚體，影響到熒光檢測(cè)結(jié)果，故本文選擇其用量為2nmol。⑦當(dāng)dNTP用量為2.5nmol時(shí)，能夠擴(kuò)增出明顯的條帶，隨著其用量的增加條帶逐漸變?nèi)酰虼藢⑵溆昧慷?.5nmol，引物和dNTP用量均不宜太高，這與學(xué)者報(bào)道相符。⑧當(dāng)模板用量10—60ng時(shí)均只有哈蟆油樣品擴(kuò)增出單一的目的條帶，熒光檢測(cè)結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

采用以上反應(yīng)條件分別使用四種快速DNA聚合酶，其中SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶均能實(shí)現(xiàn)對(duì)哈蟆油的真?zhèn)舞b別，r Taq DNA聚合酶，Transfast Taq DNA聚合酶未能得到有效擴(kuò)增。使用不同廠家型號(hào)的PCR儀對(duì)哈蟆油及同屬近緣種樣品進(jìn)行快速PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：S1000型PCR儀(Bio-rad公司)，ETC811型PCR儀(東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，電泳檢測(cè)后均可獲得樣品的特異性目的條帶，反應(yīng)條件優(yōu)化見表3。

表3 哈蟆油PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

注：“+”表示條帶亮；“±”表示條帶暗；“－”表示無條帶。

表中，1：哈蟆油；2：黑龍江林蛙油；3：黑斑蛙油；4：蟾蜍油；5：牛蛙油。HS Taq為SpeedStar HSTaq DNA聚合酶，Phanta為Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，TransTaq為Transfast Taq DNA聚合酶，rTaq為TaKa Ra r Taq DNA聚合酶。S1000為Bio-rad公司PCR儀(完成時(shí)間為29min)，ETC811為東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司型PCR儀(完成時(shí)間為31min)。

綜合以上優(yōu)化結(jié)果，確定哈蟆油快速PCR鑒別方法中的最佳反應(yīng)體系如下:

PCR反應(yīng)體系為20μL：2.0μL 10×buffer，1.0μL dNTPs(2.5mmol·L-1)，0.2μL上游及下游引物(終濃度為2nmol)，0.1μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL(約20ng)模板DNA，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。

最佳PCR反應(yīng)參數(shù)為90℃3s，62℃20s，32個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例2、哈蟆油真?zhèn)舞b別引物的應(yīng)用

提取表1的各個(gè)藥材的基因組DNA作為模板，用上述實(shí)施例1中的二的3的最佳反應(yīng)體系和最佳PCR反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若得到155S-F/155S-R對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)樣本為或候選為哈蟆油，若未得到該擴(kuò)增產(chǎn)物，則為或候選為哈蟆油偽品。

用如下兩種方法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：

1)向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μL 100×SYBR GreenⅠ，并于365nm紫外波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)綠色熒光為陽性擴(kuò)增產(chǎn)物；可以看出，哈蟆油樣品均顯示出明亮綠色熒光，而偽品不發(fā)出熒光。

2)電泳檢測(cè)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

155S-F/155S-R對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為530bp，進(jìn)一步測(cè)序530bp擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列5。

結(jié)果如圖3所示，M：Marker；1-13：哈蟆油；14-17：黑龍江林蛙油；18-21：黑斑蛙油；22-25：蟾蜍油；26-28：牛蛙油29：陰性對(duì)照；哈蟆油正品均擴(kuò)增出目的條帶，混偽品均無條帶。

序列表

<110> 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

<120> 哈蟆油真?zhèn)舞b別的方法及專用引物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gatgtaaaca acggctgacc a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggggataagg ttgataggg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gttcctccat caaacaggct ca 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggtgtaac tacggggtcg 20

<210> 5

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gggcttcgga tgttacaagc cgacagatct ttaaaggaaa agtaggggtg gaaggagact 60

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