專利名稱:一組引物及其設計方法和在單核苷酸多態(tài)性檢測中的應用的制作方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及一組引物,尤其是一組利用PCR擴增和RFLP相關聯(lián)的技術(shù)對待擴增基因片段上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進行檢測分型的引物及其應用。
背景技術(shù):
隨著人類基因組計劃的完成,人們對基因功能的研究便不斷的加強,并發(fā)現(xiàn)在人類基因組的DNA序列中每600個堿基中便有一個堿基是有多態(tài)性的,即人們常說的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP),并且發(fā)現(xiàn)這些位點含有重要的遺傳學信息(Nila,P.Anthony,J.B.David,A.H.Wade,A.Barrett,J.M.Doshi,C.R.Hacker,C.R.Kautzer,D.H.Lee,C.M.David,P.M.Bich,T.N.Nguyen,M.C.Norris,J.B.Sheehan,N.S.David,S.R.P.Stokowski,D.J.Thomas,M.O.Trulson,K.R.Vyas,K.A.Frazer,S.P.A.Fodor,D.R.C.(2001)Blocks of Limited Haplotype DiversityRevealed by High-Resolution Scanning of Human Chromosome.Science,21,1719-23.)。SNPs尤其是cSNPs是反映個體遺傳特征的十分有效的標記,并被作為連鎖分析的遺傳標記用于基因的定位與基因診斷,不同的研究者相繼發(fā)現(xiàn)并應用了許多不同的實驗方法,其中Brian,W.K.,Matthew,F(xiàn).,Reyna,F(xiàn).,Richard,M.K and Francis,B.(2002)Single nucleotide polymorohismseeking long term association with complex disease.Nucleic Acids Res.,30,3295-3311.提到的PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restrictionfragment length polymorphism,聚合酶鏈式反應一限制性片段長度多態(tài)性)是較簡潔并且相對經(jīng)濟的一種技術(shù),但是在這一技術(shù)中需要在SNP位點的周圍能有某個已經(jīng)商業(yè)化的限制性內(nèi)切酶的酶切位點,但是大多數(shù)的SNP位點卻沒有相應的限制性內(nèi)切酶的識別序列。
目前市場上比較成熟而且比較經(jīng)濟的限制性內(nèi)切酶有Hind III、EcoR I或者Bam H I等,而且這些限制性內(nèi)切酶的活性較高,其他一些限制性內(nèi)切酶大多存在價格昂貴或者酶切活性較低等不足。雖然有些報道,例如Xiao,J.H.,Hu,F(xiàn).Xu.,H.Y.(1999)Provincial distribution of three HIV-1 resistantpolymorphisms(CCR5-Δ32,CCR2-64I,and SDF1-3’A)in China.Science inChina(Series C).29,556-560,對某些SNP位點周圍的一個或者兩個堿基進行改造,從而人為形成某個酶的切點,但是在這種情況下所形成的切點所需要的酶很大情況下是稀有的酶,這些酶的價格往往比較的高而且酶切效率也較低,而且對于不同SNP的引物而言,由于3’端的序列的差異因而需要不同的PCR擴增條件,需要實驗者針對不同的引物嘗試不同的PCR擴增條件,這又增加了實驗者的負擔同時由于需要嘗試不同的PCR條件從而還浪費了很多的DNA資源。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在于公開一組引物,尤其是一組可通過PCR和RFLP相關聯(lián)對待測基因片段上的SNP進行檢測分型的一組引物及其設計方法和應用。以解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有限制性酶切位點難以檢測的SNP,或者是可用于檢測的限制性內(nèi)切酶價格昂貴的缺點。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的本發(fā)明所采取的方法是對PCR-RFLP中PCR引物進行改造來解決當RFLP中所涉及的限制性內(nèi)切酶價格昂貴實驗成本較高以及對不同的位點需要嘗試不同的PCR擴增條件等問題;同時利用“巢式”PCR反應的原理對模板進行擴增,對擴增片段利用較常見且價格便宜的限制性內(nèi)切酶進行切割,通過酶切片段電泳顯示,判斷該位點是野生型還是突變型。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的PCR引物,有兩種引物對構(gòu)成第一種引物對中的上下游引物和模板完全配對;第二種對引物對的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配對,而另外一條和模板DNA不完全配對,與模板不完全配對的引物包含兩個部分第一部分為引物的和模板相關部分,位于引物的5’端;第二部分為和限制性內(nèi)切酶識別序列相關部分,位于引物的3’端,并且其序列和模板不完全配對。上述引物的總長度在15-35bp之間,優(yōu)選的為25-30bp。其中與模板不完全配對的那條引物,其與模板DNA相配對的部分為10-30bp,優(yōu)選的為20-25bp,與模板DNA不相配對的部分為3-5bp,優(yōu)選的為4-5bp。
PCR擴增時根據(jù)模板序列和限制性內(nèi)切酶識別的核苷酸序列的差異,應用本發(fā)明時可以使用一對第一種引物對和一對第二種引物對的混合(第一組引物),也可以僅使用兩對第二種引物對(第二組引物)。如SNP位點的任意一側(cè)的4-5個鹼基中有一個或兩個鹼基與限制性內(nèi)切酶的識別序列不相配對時,PCR擴增時使用一對第一種引物對和一對第二種引物對;如在SNP位點周圍鹼基中有三個或四個鹼基和限制性內(nèi)切酶識別序列不配對,則選用兩對第二種引物對。所述的限制性內(nèi)切酶優(yōu)選的為Hind III,EcoRI或者Bam H I中的一種。
具體的針對某一待檢基因片段的擴增引物在具體實施方式
中詳細列出。
本發(fā)明的引物可用于待檢基因片段中單核苷酸的多態(tài)性位點檢測,尤其是在突變位點周圍大約30個堿基內(nèi)沒有其他的單一位點突變。而SNP位點的差異和一些疾病相關,因而可用于疾病相關基因的定位和疾病診斷和疾病篩選,因而可利用本發(fā)明中的引物及相關的PCR-RFLP進行疾病診斷試劑盒的研制開發(fā)。
使用本發(fā)明的引物,關聯(lián)PCR和RFLP進行SNP檢測分型,具體包括如下步驟1.引物設計分析模板中SNP位點周圍的序列特征,如SNP位點的任意一側(cè)的4-5個鹼基中有一個或兩個鹼基與限制性內(nèi)切酶的識別序列不相配對時,PCR擴增時使用一對第一種引物對和一對第二種引物對;如在SNP位點周圍鹼基中有三個或四個鹼基和限制性內(nèi)切酶識別序列不配對,則選用兩對第二種引物對。
2.PCR和RFLP關聯(lián)檢測(1)PCR反應(a)當用到第一組或第二組引物中的一對引物時步驟如下將5-15ng模板、PCR引物各1-30pmol、高溫聚合酶1-5U,2μl緩沖液,混合反應,反應條件為90-98℃,30秒,50-60℃30秒,72℃45秒,循環(huán)1-40次;此法所用高溫聚合酶可以是Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pfu聚合酶等。
(b)當用到第一組或者第二組引物中的兩對引物時步驟如下此時本發(fā)明方法涉及兩次PCR反應,分別使用兩組不同的引物,第一次PCR反應步驟為將5-15ng模板、第一對PCR引物各1-30pmol、高溫聚合酶1-5U,2μl高溫聚合酶緩沖液,混合反應,反應條件為90-98℃30秒,50-60℃30秒,72℃45秒,循環(huán)1-30次;此法所用高溫聚合酶可以是Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pfu聚合酶等。
第二次PCR反應步驟為將第一次PCR反應產(chǎn)物稀釋1-100倍,取1-10μl作為模板、第二對PCR引物各1-30pmol、高溫聚合酶1-5U,2μl緩沖液,混合反應,反應條件為90-98℃30秒,50-60℃30秒,72℃45秒,循環(huán)1-30次;此法所用高溫聚合酶可以是Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pfu聚合酶等。
(2)RFLP反應將最終PCR產(chǎn)物取1-10μl,1-20μl緩沖反應液,限制性內(nèi)切酶1-10U,25-65℃,孵育1-10小時,此法所用的限制性內(nèi)切酶可以是Hind III,EcoR I或者Bam H I等。如果樣本是SNP位點的某一特定分型,則其PCR產(chǎn)物序列將與限制性內(nèi)切酶識別序列一致,則產(chǎn)物可以被該酶切成較小片段;如果樣本是SNP位點的另一分型,則其PCR產(chǎn)物序列將與限制性內(nèi)切酶識別序列不一致,則產(chǎn)物不能被該酶切成較小片段。
3.結(jié)果檢測取酶切產(chǎn)物1-5μl與1-10μl上樣緩沖液混合,通過0.5-3.0%的瓊脂糖凝膠電泳讀取結(jié)果。
本發(fā)明的引物不但可以用于PCR和RFLP關聯(lián)單個SNP位點檢測分型,還可以用于PCR和RFLP關聯(lián)對多個SNP位點檢測分型,以及用于單個SNP位點和多個SNP位點檢測分型的試劑盒。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果1.本發(fā)明解決了用PCR和RFLP關聯(lián)對SNP檢測分型中出現(xiàn)的無法找到限制性內(nèi)切酶的識別序列即酶切位點的問題;2.本發(fā)明解決了在用PCR和RFLP關聯(lián)對SNP檢測分型中出現(xiàn)酶切位點所涉及的限制性內(nèi)切酶的價格表較昂貴實驗成本比較高的問題;3.本發(fā)明解決了在用PCR和RFLP關聯(lián)對SNP檢測分型中出現(xiàn)的對不同的位點需要嘗試不同的PCR擴增條件的不足;4.本發(fā)明利用“巢式”PCR解決了模板DNA資源浪費的問題。
5.根據(jù)SNP相關的遺傳性疾病的說明,利用本發(fā)明,在檢測連鎖分析的遺傳標記SNP用于基因的定位與基因診斷上如兒童性早熟,成人多囊腎,心血管疾病和神經(jīng)性疾病等將有很好的效果。
圖1為將7份已知樣本以本發(fā)明方法處理后的電泳結(jié)果。
圖2為以CYP3A4(Gene ID#2242280)為例,將其序列改造為限制性內(nèi)切酶Barn H I的識別位點GGATCC,改造后的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果。
圖3為單位點檢測分型。
圖4為多位點檢測分型。
具體實施例方式
實施例11.引物的設計當SNP位點附近序列只有2個位點和已知酶的識別序列不一致時以GnRH(rs1567126)基因上位點之一為例進行說明,該位點附近的序列為3’G/TTGCGTGGAA GGCTGCTCCA GCCAGCACTG GTCCTATGGACTGCGCCCTG GAGG 5’,引物設計如下該序列和限制性內(nèi)切酶Hind III的識別序列5’AAGCTT 3’有2個不配對的堿基分別在3’末端的第5位和6位,上面序列用橫線標出部分,在設計和模板不完全配對的一條引物時,引物的第二部分便根據(jù)Hind III能識別的序列將這兩個堿基5位G改為A,第6位堿基T改為A。
2.當SNP位點附近序列有3個位點和已知酶的識別序列不一致時以CYP3A4*1B例,針對此序列和限制性內(nèi)切酶Hind III的識別序列進行改造限制性內(nèi)切酶Hind III識別序列為AAGCTTCYP3A4*1B位點附近的序列為5’TGG CAT AAA ATC TAT TAAATC TGT TCT CCT C/TTC TCT C 3’其中和限制性內(nèi)切酶Hind III識別序列不相同的堿基有3個,橫線標出,第二對引物中和模板DNA不完全配對的引物中改造的一個堿基下劃線標出,另外一條不完全和模板DNA配對的引物改造剩余的兩個堿基的引物下劃線標出。
圖3為將6份已知樣本以本發(fā)明方法處理后的電泳結(jié)果,泳道6為CYP3A4*1B位點純合子AA,泳道4則為該位點雜合子GA,其余泳道的為該位點GG純合子,此結(jié)果與已知情況相符。
實施例2對一個SNP位點進行檢測以GnRH(Gene ID rs 1567126)位點為例,具體實施步驟如下1.引物設計按照實施例1的方法進行引物設計,結(jié)果如下
2.PCR反應條件兩次PCR第一次PCR反應針對第一對引物以及從人外周血中提取的DNA為模板,電泳定量模板的濃度為5-15ng/μl。20μl的反應體系中反應混合液為200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,200μM dGTP,2mM MgCl2,2U Taq DNA聚合酶,上下游引物各30Pmol,反應條件為94℃30秒,56℃30秒,72℃45秒,循環(huán)30次;第二次PCR反應20μl的反應體系中反應混合液為200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,200μM dGTP,2mM MgCl2,2U Taq DNA聚合酶,第一次PCR產(chǎn)物稀釋5倍后取1μl作為模板,第二對引物各1-30pmol,第二對引物中的一條引物的3’末端含2個和模板不配對的堿基。反應條件采用兩步退火94℃30秒,67℃10秒,56℃30秒,72℃45秒,循環(huán)30次;3.PCR產(chǎn)物酶切,即RFLP的檢測將最終PCR產(chǎn)物取1-10μl,1-20μl緩沖反應液,限制性內(nèi)切酶HindIII 1-10U,25-65℃,孵育1-10小時。如果樣本是SNP位點的某一特定分型如TT,則其PCR產(chǎn)物序列將與限制性內(nèi)切酶識別序列一致,則產(chǎn)物可以被該酶切成較小片段;如果樣本是SNP位點的另一分型GG或者GT,則其PCR產(chǎn)物序列將與限制性內(nèi)切酶識別序列不一致或者部分不一致,則產(chǎn)物不能或者部分不能被該酶切成較小片段。
4.3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,如圖1所示,泳道1和6為GnRH位點純合子GG,泳道2,3,4和5則為該位點純合子TT,泳道7為該位點雜合子GT,此結(jié)果與已知情況相符。由于30bp的小片段在3.0%的瓊脂糖凝膠上,紫外檢測不出,因而只有133bp的片段可見。
實施例3以CYP3A4*1、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、JSNP為例,對多個SNP位點進行檢測分型。
1.引物設計
其中CYP3A4*4序列,改造前TAAGGTGAGTGGATG GCATGCGGAT,改造為限制性內(nèi)切酶Bam H I的識別位點GGATCC,改造后的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果如圖2所示。
第一對或者第二對PCR引物各一對共5對引物,同時加入PCR反應體系,即所謂的”巢式”PCR,同樣進行兩次PCR擴增第一次PCR反應分別針對五對引物,以及從人外周血中提取的DNA為模板,電泳定量模板的濃度為10ng/μl。20μl-的反應體系中反應混合液為200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,200μM dGTP,2mM MgCl2,2U Taq DNA聚合酶,5對上下游引物各3Pmol,其中下游引物3’末端含有1-2個和模板DNA不配對的堿基,反應條件為兩步退火94℃30秒,67℃10秒,56℃30秒,72℃45秒,循環(huán)30次;第二次PCR反應20μl的反應體系中反應混合液為200μM dATP,200μMdTTP,200μM dCTP,200μM dGTP,2mM MgCl2,2U Taq DNA聚合酶,第一次PCR產(chǎn)物稀釋5倍后取1μl作為模板,分別進行目標片段的擴增,第二對引物各30Pmol,下游引物的3’末端含至少2個和模板不配對的堿基。反應條件采用兩步退火94℃30秒,67℃10秒,56℃30秒,72℃45秒,循環(huán)30次;3.PCR產(chǎn)物酶切,即RFLP的檢測將最終PCR產(chǎn)物取1-10μl,1-20μl緩沖反應液,各自不同的限制性內(nèi)切酶1-10U,25-65℃,孵育1-10小時。如果樣本是SNP位點的某一特定分型,則其PCR產(chǎn)物序列將與限制性內(nèi)切酶識別序列一致,則產(chǎn)物可以被該酶切成較小片段;如果樣本是SNP位點的另一分型,則其PCR產(chǎn)物序列將與限制性內(nèi)切酶識別序列不一致,則產(chǎn)物不能或者部分不能被該酶切成較小片段。
4. 3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,如圖4所示各自不同的限制性內(nèi)切酶酶切各自不同的PCR反應產(chǎn)物的結(jié)果。自右1至左10相臨兩泳道分別是PCR產(chǎn)物和他們相應的限制性內(nèi)切酶結(jié)果。泳道1、3、5、7、9分別為位點CYP3A4*1、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、JSNP使用本發(fā)明方法兩次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果,泳道2、4、6、8、10為位點CYP3A4*1、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、JSNP上述PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果,由圖可以看出以上樣本均為野生型,與結(jié)果相符。
權(quán)利要求
1.一組用于擴增基因片段的引物,其特征在于該組引物包括兩對引物,這兩對引物分別為下述引物對中的一種第一種引物對中的上下游引物和模板完全配對;第二種引物對的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配對,而另外一條和模板DNA不完全配對。
2.一組如權(quán)利要求1所述的引物,其特征在于第二種引物對中與模板不完全配對的那條引物包含兩個部分,第一部分為引物和模板相關部分,位于引物的5’端;第二部分為和限制性內(nèi)切酶識別序列相關部分,位于引物的3’端,并且其序列和模板不完全配對。
3.一組如權(quán)利要求1所述的引物,其特征在于引物的總長度在15-35bp之間。
4.一組如權(quán)利要求3所述的引物,其特征在于引物的總長度在25-30bp之間。
5.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于其中與模板DNA不完全配對的那條引物,其與模板DNA相配對的部分為10-30bp,與模板DNA不相配對的部分為3-5bp。
6.一組如權(quán)利要求5所述的引物,其特征在于其中與模板DNA不完全配對的那條引物,其與模板DNA相配對的部分為為20-25bp,與模板DNA不相配對的部分為4-5bp。
7.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′CAG GAC ACT GGG CAT CTG GGA TAA ATC TCT 3′5′CTC AAA TTC AGT GGA CTA CCC CTT GGA AAG 3′第二對引物5′AAC TCC TAG CTG TCC TTA TTC TAC TGA ATT 3′5′GGT CAT GAT TGA CCT CGG AAG GAACGT 3′
8.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′GAA GTC ACC AGA AAG TCA GAA GGA TGC ATA 3′5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT TCAGCT 3′第二對引物5′GTT TGG AAG GAT GTG TAG GAG TCT TCT AGG 3′5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC TGT TAAGCT 3′
9.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′GAA GTC ACC AGA AAG TCA GAA GGA TGC ATA 3′5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC GCC TCTATC 3′第二對引物5′GTT TGG AAG GAT GTG TAG GAG TCT TCT AGG 3′5′TGG CAT AAA ATC TAT TAA ATC GCC TCA AGC 3′
10.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′CAG GAC ACT GGG CAT CTG GGA TAA ATC TCT 3′5′CTC AAA TTC AGT GGA CTA CCC CTT GGA AAG 3′第二對引物5′GCC CAT CAC CCA GTA GAC AGT CAC TAA ATA 3′5′TCT TCC ATT CTT CAT CCT CAG ATC CGGATC3′
11.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′AGT GTG ATA GAA GGT GAT CTA GTA GAT CTG 3′5′GAA AGT TGA TTA GTG GTT GCA TAT GAT GAT 3′第二對引物5′TGA CTG GAC ATG TGG GTT TCC TGT TGC GTG 3′5′CAG TTA TTT TTA AGA GAG AAA GAT AAA TTA 3′
12.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′ACA CAT TCT CAA ATG AAA GTC CCT ATC AGG 3′5′TGG GAC TCA GTT TCT TTT GAACTC TGAAAG 3′第二對引物5′GAC CAC GCT GTG ATT ACT TCT GAC TTC AGG 3′5′TGG GAC TCA GTT TCT TTTCAA CTC TGGAAT3′
13.一組如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物,其特征在于該組引物的序列為第一對引物5′CAC ATC AGA ATG TAA CGA CCC CCA GTG TAC 3′5′GGT TTC ACC TCC TCC CTC CTT CTC CAGGTC3’第二對引物5′CGT GGC CCA ATC AAT TAT CTT TAT TTT TGC 3′5′GGT TTC ACC TCC TCC CTC CTT CTC CGGATC3′
14.一組如權(quán)利一切1-13任一項所述引物的設計方法,其特征在于該組引物包括兩對引物,這兩對引物分別為下述引物對中的一種第一種引物對中的上下游引物和模板完全配對;第二種引物對的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配對,而另外一條和模板DNA不完全配對;其中第二種引物對中與模板不完全配對的那條引物包含兩個部分,第一部分為引物和模板相關部分,位于引物的5’端;第二部分為和限制性內(nèi)切酶識別序列相關部分,位于引物的3’端,并且其序列和模板不完全配對。
15.一組如權(quán)利要求1-13任一項所述引物在SNP檢測中的應用,其中SNP位點可為1-5個。
16.一種如權(quán)利要求15所述的應用,其特征在于通過引物,對待測基因片段進行PCR擴增,然后通過限制性內(nèi)切酶進行酶切,根據(jù)酶切片段的長度,進行SNP的檢定。
17.一種如權(quán)利要求16所述的應用,其特征在于所述的PCR擴增為巢式PCR擴增。
18.一種如權(quán)利要求16所述的應用,其特征在于所述的限制性內(nèi)切酶為HindIII、EcoR I或Bam HI中的一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組用于擴增基因片段的引物,該組引物包括兩對引物,兩對引物或者是引物對中的上下游引物和模板完全配對;或者是引物對的上游引物或者下游引物之一和模板DNA完全配對,而另外一條和模板DNA不完全配對。如此設計而成的引物可通過巢式PCR對任意待測基因片段進行擴增后形成限制性內(nèi)切酶Hind III、EcoR I或Bam HI的識別序列,并與RFLP相關聯(lián),以限制性內(nèi)切酶Hind III、EcoR I或Bam HI對擴增片段進行酶切反應,最后根據(jù)酶切片段片段大小對SNP進行檢定。
文檔編號C12P19/34GK1560276SQ20041001670
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者辛秀娟, 肖君華, 肖振賢, 魏東芝, 欒曉輝 申請人:華東理工大學