本發(fā)明涉及生物活性肽制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種雙酶分步酶解螃蟹殼制備抗氧化活性肽的方法。
背景技術(shù)：
海洋甲殼動物資源豐富，據(jù)世界糧農(nóng)組織FAO漁業(yè)部統(tǒng)計，1996年世界海洋甲殼動物總產(chǎn)量達到510.7萬噸，其中蟹類占總產(chǎn)量的23.88％。蟹類經(jīng)加工后會產(chǎn)生大量的下腳料，如蟹腳、蟹背殼等，由于技術(shù)及認識等方面原因，這些蝦蟹殼大多數(shù)往往被隨意丟棄，造成了極大的污染和資源浪費。而國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)對蟹殼加工利用尚處于初級階段，現(xiàn)有的加工利用方法除了少部分粗粉碎作為魚粉加工原料外，多數(shù)被用于生產(chǎn)甲殼素，而甲殼素生產(chǎn)企業(yè)大多面臨環(huán)保壓力而停止生產(chǎn)。因此如何把這一資源進行最大化利用，開發(fā)新產(chǎn)品已成為水產(chǎn)品加工業(yè)急需解決的問題。
近年來，對水產(chǎn)品加工下腳料綜合利用的研究漸成熱點，主要是利用蛋白酶來提取蛋白水解物，用于調(diào)味料或食品添加劑的開發(fā)。蝦蟹殼中富含豐富的蛋白質(zhì)，以及眾多對人體有益的營養(yǎng)素及鐵、鋅、銅等微量元素，利用生物酶解技術(shù)，將蟹殼資源有效的加以開發(fā)利用，制備成為具有抗氧化功能，且營養(yǎng)豐富的產(chǎn)品，將大大提高其應用價值，有效增加了螃蟹的經(jīng)濟價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了提供一種工藝步驟簡單，過程穩(wěn)定可控，節(jié)能、高效、綠色環(huán)保的雙酶分步酶解螃蟹殼制備抗氧化活性肽的方法，利用蟹殼制備抗氧化鈦，實現(xiàn)螃蟹加工廢棄物資源的綜合利用，提高其應用價值，有效增加了螃蟹的經(jīng)濟價值。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種雙酶分步酶解螃蟹殼制備抗氧化活性肽的方法，包括以下步驟：
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經(jīng)粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用。
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質(zhì)量比1：(5～10)混合后，調(diào)節(jié)pH為2.0～3.0，在30～40℃保溫10～20min，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.1～0.3％的酸性蛋白酶，保溫酶解6～8h，升至95～100℃滅酶15～20min，冷卻至50～60℃，調(diào)節(jié)pH至6.5～7.5，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.1～0.3％的風味蛋白酶，于50～60℃保溫酶解2～4h，升溫至95～100℃滅酶10～20min，得酶解液。本發(fā)明的關(guān)鍵點在于酶解過程，不同的蛋白酶對蛋白質(zhì)的作用位點不同，單酶水解作用位點較單一，導致蛋白質(zhì)的水解度較低，本發(fā)明采用雙酶酶解技術(shù)，由于酸性蛋白酶和風味蛋白酶的作用位點差異較大，因此可以有效提高蟹殼蛋白的水解度，從而獲得小分子的活性肽。所述的酸性蛋白酶為由黑曲霉培養(yǎng)發(fā)酵后采用現(xiàn)代生物技術(shù)精制而成的安全、高效生物食品級酶制劑，其分子量35kDa左右，酶活力為20000～50000U/g；所述的風味蛋白酶為由米曲霉菌株發(fā)酵，經(jīng)提純、復配而成的食品級復合風味蛋白酶，酶活力為≥30000U/g。
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液。
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液。膜分離去除無抗氧化活性或抗氧化活性較低的成分，在進一步提高蟹殼抗氧化肽的純度的同時，對抗氧化肽的結(jié)構(gòu)和活性的影響較小。
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
作為優(yōu)選，步驟(2)中，高速離心的工藝參數(shù)為：離心轉(zhuǎn)速6000～10000rpm/min，時間10～30min。
作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述酸性蛋白酶酶活力為20000～50000U/g，所述風味蛋白酶酶活力≥30000U/g。
作為優(yōu)選，步驟(2)中，酶解過程在攪拌條件下進行。
因此，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明以蟹殼為原料，蟹殼粉碎后經(jīng)雙酶分步酶解、離心分離、膜分離、真空冷凍干燥得到固體的蟹殼抗氧化肽，工藝步驟簡單，過程穩(wěn)定可控，節(jié)能、高效、綠色環(huán)保，實現(xiàn)了螃蟹加工廢棄物資源的綜合利用，提高其應用價值，有效增加了螃蟹的經(jīng)濟價值。
具體實施方式
下面通過具體實施方式對本發(fā)明做進一步的描述。
實施例1
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經(jīng)粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用；
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質(zhì)量比1：5混合后，調(diào)節(jié)pH為2.0，在30℃保溫10min，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.1％、酶活力為20000U/g的酸性蛋白酶，在攪拌條件下保溫酶解6h，升至95℃滅酶15min，冷卻至50℃，調(diào)節(jié)pH至6.5，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.1％、酶活力≥30000U/g的風味蛋白酶，在攪拌條件下于50℃保溫酶解2h，升溫至95℃滅酶10min，得酶解液；
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液，高速離心的工藝參數(shù)為：離心轉(zhuǎn)速6000rpm/min，時間10min；
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液；
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
將得到的蟹殼抗氧化肽經(jīng)抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，蟹殼抗氧化肽對DPPH的清除效果為10.5mg AAE/g樣品，抗氧化肽的產(chǎn)量為240mg/g原料；感官評價為4。
實施例2
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經(jīng)粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用；
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質(zhì)量比1：10混合后，調(diào)節(jié)pH為3.0，在40℃保溫20min，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.3％、酶活力為50000U/g的酸性蛋白酶，在攪拌條件下保溫酶解8h，升至100℃滅酶20min，冷卻至60℃，調(diào)節(jié)pH至7.5，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.3％、酶活力≥30000U/g的風味蛋白酶，在攪拌條件下于60℃保溫酶解4h，升溫至100℃滅酶20min，得酶解液；
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液，高速離心的工藝參數(shù)為：離心轉(zhuǎn)速10000rpm/min，時間30min；
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液；
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
將得到的蟹殼抗氧化肽經(jīng)抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，蟹殼抗氧化肽對DPPH的清除效果為10.2mg AAE/g樣品，抗氧化肽的產(chǎn)量為180mg/g原料；感官評價為4。
實施例3
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經(jīng)粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用；
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質(zhì)量比1：7混合后，調(diào)節(jié)pH為2.5，在35℃保溫15min，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.2％、酶活力為30000U/g的酸性蛋白酶，在攪拌條件下保溫酶解7h，升至98℃滅酶17min，冷卻至55℃，調(diào)節(jié)pH至7.2，加入為蟹殼粉質(zhì)量0.2％、酶活力≥30000U/g的風味蛋白酶，在攪拌條件下于55℃保溫酶解3h，升溫至97℃滅酶15min，得酶解液；
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液，高速離心的工藝參數(shù)為：離心轉(zhuǎn)速8000rpm/min，時間20min；
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液；
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
將得到的蟹殼抗氧化肽經(jīng)抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，蟹殼抗氧化肽對DPPH的清除效果為9.8mg AAE/g樣品，抗氧化肽的產(chǎn)量為249mg/g原料；感官評價為4。
本發(fā)明所用的DPPH清除率測定方法具體步驟為：
取1.5mL適當稀釋的蟹殼抗氧化肽溶液，加入3.0mL 0.09mg/mL DPPH(95％乙醇溶液)，混合均勻室溫避光放置5min，以95％乙醇為調(diào)零管，測定樣品在517nm處吸光值。其中空白對照用95％乙醇溶液替代樣品，標準品為抗壞血酸(AAE)溶液，濃度為0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL。
結(jié)果以每g蟹殼抗氧化肽相當于抗壞血酸的mg數(shù)表示，即mg AAE/g樣品。
本發(fā)明采用的感官評價方法為：由8名經(jīng)過訓練的感官評價小組成員按照表1所示的評分標準，對蟹殼抗氧化肽進行感官評分。
表1 感官評價評分標準
以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。