本發(fā)明屬于有機(jī)高分子化合物領(lǐng)域，具體涉及一種鼠李糖脂的制備方法。
背景技術(shù)：
木薯是廣泛栽種于熱帶地區(qū)和部分亞熱帶地區(qū)的農(nóng)作物之一，原料來源廣，資源豐富。木薯塊根肉質(zhì)富含淀粉，工業(yè)生產(chǎn)中主要以其為原料加工淀粉或酒精。木薯渣是以木薯為原料加工產(chǎn)品后所剩下的固體廢料，其淀粉含量較高，同時也含有一定量的木質(zhì)纖維素和少量的蛋白質(zhì)，存在相當(dāng)大的再利用價值。目前雖已有利用木薯渣作飼料應(yīng)用的研究，但仍未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化利用，大部分企業(yè)仍選擇將其作為廢棄物直接丟棄，這不僅是對資源的巨大浪費(fèi)，也是對環(huán)境的巨大污染。近年來木薯渣因所含粗纖維經(jīng)有效降解之后可以變廢為寶、節(jié)省資源又保護(hù)環(huán)境而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，木薯渣再利用方面的研究已成為一大熱點(diǎn)。如果能通過篩選微生物和酶制劑將木薯渣中的淀粉和纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，再經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)出日化原料、食品添加劑和新型藥物等，就能以低廉的原料成本換來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，從而實(shí)現(xiàn)木薯渣的有效降解及再利用。
鼠李糖脂是由微生物在一定條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，由1～2個鼠李糖和不同碳鏈長度的β-羥基脂肪酸兩部分連接組成。鼠李糖脂是一種新型的陰離子生物表面活性劑，具有乳化、增溶、分散、凝聚和降低界面張力等功能，而且低毒、易生物降解，因而在石油化工、生物醫(yī)藥、食品及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。鼠李糖脂的制備主要通過微生物發(fā)酵，再從發(fā)酵液中提取得到。生產(chǎn)鼠李糖脂的菌種以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)最為常見。許多種類的碳源都可以發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，從石油化學(xué)衍生物到天然原料，其中最常用的是植物油、糖和甘油。目前，經(jīng)微生物發(fā)酵得到鼠李糖脂的主要瓶頸是碳源的成本過高和鼠李糖脂的產(chǎn)量較低，這限制了鼠李糖脂的規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用。降低發(fā)酵基質(zhì)的成本成為鼠李糖脂開發(fā)的主要方向。木薯渣作為一種廉價易得的碳源，以其為原料生物合成鼠李糖脂，不僅減少了生產(chǎn)鼠李糖脂的成本，而且降低了木薯渣的治理成本，實(shí)現(xiàn)了木薯渣的資源化利用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對本領(lǐng)域存在的不足之處，本發(fā)明的目的是提出一種鼠李糖脂的生產(chǎn)方法，用木薯渣在不經(jīng)任何預(yù)處理的前提下，通過同步糖化發(fā)酵制取鼠李糖脂，本工藝可以大幅度提高木薯渣資源組分的利用率。
為實(shí)現(xiàn)上述目的的具體技術(shù)方案為：
一種鼠李糖脂的生產(chǎn)方法，是向木薯渣中加入纖維素酶及銅綠假單胞菌，同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂。
通過對木薯渣的糖化和發(fā)酵試驗(yàn)比較，同步糖化發(fā)酵比較經(jīng)雙酶法糖化后接入銅綠假單胞菌發(fā)酵、或木薯渣經(jīng)酶解后接入銅綠假單胞菌進(jìn)行發(fā)酵，有更好的技術(shù)效果。
進(jìn)一步地，所述木薯渣為工業(yè)木薯渣，含水量為8～15％，木薯渣的粒度為通過40目篩。
其中，所述銅綠假單胞菌首先經(jīng)過液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后加入木薯渣，木薯渣占發(fā)酵培養(yǎng)基的比例為2～6w/v％。
其中，所述液體培養(yǎng)基含有的成分為：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl 5.0g/L；
發(fā)酵培養(yǎng)基含有的成分為：MgSO4·7H2O 0.125g/L，NaNO3 1.5g/L，KH2PO4 0.125g/L，酵母提取物0.5g/L。
其中，所述添加纖維素酶、纖維二糖酶和銅綠假單胞菌種子懸液。反應(yīng)體系中纖維素酶的加入量為3.75FPU/g-木薯渣，纖維二糖酶的加入量為5.65CBU/g-木薯渣(纖維素酶中纖維二糖酶含量較低，需要額外加入纖維二糖酶)。其中，所述銅綠假單胞菌種子懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為1～1.5％(v/v)，培養(yǎng)的條件為溫度35～38℃、時間144～168h。
其中，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液固液分離，收集清液，調(diào)節(jié)清液pH為1.6～2.2后靜置，待絮狀沉淀出現(xiàn)，用等體積乙酸乙酯萃取清液，收集萃取的上層溶液。
優(yōu)選地，將發(fā)酵液在12000×g離心條件下離心15min后收集上清液，用HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH為1.6～2.2，在4℃下靜置過夜，用等體積乙酸乙酯萃取，收集萃取的上層溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾。
本發(fā)明的有益效果在于：
木薯渣是提取淀粉后的工業(yè)固體廢棄物，資源量大、價格低廉；木薯渣中含有的淀粉和纖維素經(jīng)有效降解可轉(zhuǎn)化為葡萄糖，可用以生產(chǎn)鼠李糖脂。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，木薯渣不經(jīng)雙酶法糖化，只加入低用量的纖維素酶即可將大部分的淀粉和纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，有利于簡化工藝過程。
本發(fā)明提出的生產(chǎn)方法，反應(yīng)過程中同時加入纖維素酶和銅綠假單胞菌，實(shí)現(xiàn)了直接同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，縮短了反應(yīng)時間，有利于降低生產(chǎn)成本；整個反應(yīng)過程中不經(jīng)化學(xué)預(yù)處理，既降低了化學(xué)品使用成本，又使得整個工藝過程綠色環(huán)保；相較于以葡萄糖為原料生產(chǎn)鼠李糖脂，以木薯渣為原料經(jīng)過直接同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂可使產(chǎn)物得率顯著提高。木薯渣在不經(jīng)雙酶法淀粉酶糖化的前提下，僅加入纖維素酶和銅綠假單胞菌，鼠李糖脂產(chǎn)量可達(dá)11.49g/L。
附圖說明
圖1是本發(fā)明鼠李糖脂生產(chǎn)方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例中，木薯渣是提取淀粉后的工業(yè)固體廢棄物，含水率8～12％。
實(shí)施例中，如無特殊說明，所使用的手段均為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段。
實(shí)施例1
流程見圖1。
1)木薯渣經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，工業(yè)振動篩篩分過40目篩。
2)配制液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0。培養(yǎng)得到用于接入發(fā)酵體系的銅綠假單胞菌(保藏號CGMCC1.1785)種子懸液。
3)配制發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.125，NaNO3 1.5，KH2PO4 0.125，酵母提取物0.5。
向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5％(w/v)的木薯渣，并用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至6.0，制得發(fā)酵液。將發(fā)酵液倒入250mL好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶(帶豎擋板的三角瓶)中，裝瓶量為50mL，瓶口用封口膜封住后滅菌。隨后向無菌的發(fā)酵液中加入用量為3.75FPU/g-木薯渣的纖維素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纖維二糖酶和接種量為1％(v/v)的銅綠假單胞菌種子懸液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶置于37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中反應(yīng)168h。
4)對發(fā)酵液中的鼠李糖脂進(jìn)行提取，將發(fā)酵液在12000×g離心條件下離心15min后收集上清液。用6mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至2.0，在4℃下靜置過夜，待絮狀沉淀出現(xiàn)，用等體積乙酸乙酯萃取清液3次，收集3次萃取的上層溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾，得到鼠李糖脂粗提品。
獲得的鼠李糖脂粗品產(chǎn)量為11.49g/L。
實(shí)施例2
木薯渣經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，篩分過40目篩。培養(yǎng)得到用于接入發(fā)酵體系的銅綠假單胞菌(CGMCC 1.1785)種子懸液。配制發(fā)酵培養(yǎng)基，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5％(w/v)的木薯渣，并用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至6.0，制得發(fā)酵液。將發(fā)酵液倒入250mL好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶(帶擋板)中，裝瓶量為50mL，瓶口用封口膜封住后滅菌。隨后向無菌的發(fā)酵液中加入用量為3.75FPU/g-木薯渣的纖維素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纖維二糖酶和接種量為3％(v/v)的銅綠假單胞菌種子懸液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶置于37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中反應(yīng)144h。隨后對發(fā)酵液中的鼠李糖脂進(jìn)行提取。
其他操作同實(shí)施例1。獲得的鼠李糖脂粗品產(chǎn)量為11.08g/L。
實(shí)施例3：
木薯渣經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，工業(yè)振動篩篩分過40目篩。培養(yǎng)得到用于接入發(fā)酵體系的銅綠假單胞菌(CGMCC 1.1785)種子懸液。配制發(fā)酵培養(yǎng)基，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2.5％(w/v)的木薯渣，并用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至6.0，制得發(fā)酵液。將發(fā)酵液倒入250mL好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶(帶擋板)中，裝瓶量為50mL，瓶口用封口膜封住后滅菌。隨后向無菌的發(fā)酵液中加入用量為3.75FPU/g-木薯渣的纖維素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纖維二糖酶和接種量為1％(v/v)的銅綠假單胞菌種子懸液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶置于37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中反應(yīng)96h。隨后對發(fā)酵液中的鼠李糖脂進(jìn)行提取。
其他操作同實(shí)施例1。獲得的鼠李糖脂粗品產(chǎn)量為5.98g/L。
對比例1：
培養(yǎng)得到用于接入發(fā)酵體系的銅綠假單胞菌(CGMCC 1.1785)種子懸液。配制發(fā)酵培養(yǎng)基，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入30g/L的葡萄糖，并用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至6.0，制得發(fā)酵液。將發(fā)酵液倒入250mL好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶(帶擋板)中，裝瓶量為50mL，瓶口用封口膜封住后滅菌。隨后向無菌的發(fā)酵液中接入1％(v/v)的銅綠假單胞菌種子懸液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶置于37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中反應(yīng)144h。隨后對發(fā)酵液中的鼠李糖脂進(jìn)行提取，獲得的鼠李糖脂粗品產(chǎn)量為1.98g/L。
討論：經(jīng)前期試驗(yàn)得知，木薯渣經(jīng)纖維素酶轉(zhuǎn)化可得到約30g/L的葡萄糖，但直接用30g/L的葡萄糖為底物生產(chǎn)鼠李糖脂，產(chǎn)量較低。對比例2：
木薯渣經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，工業(yè)振動篩篩分過40目篩。木薯渣經(jīng)雙酶法糖化：20％木薯渣在85℃下使用淀粉酶液化1h(加酶前要加入CaCl2)，淀粉酶用量20U/g木薯渣，調(diào)節(jié)糊化液pH至4.0(10％H2SO4)，按照150U/g木薯渣加入糖化酶，于60℃糖化2-3h，得到木薯渣淀粉糖化液。
培養(yǎng)得到用于接入發(fā)酵體系的銅綠假單胞菌(CGMCC 1.1785)種子懸液。配制2倍濃度發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.25，NaNO3 3.0，KH2PO4 0.25，酵母提取物1.0。向250mL好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶(帶擋板)中加入25mL的2倍濃度發(fā)酵培養(yǎng)基，再加入12.5g木薯渣糖化液和15g水，并用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至6.0，制得發(fā)酵液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶的瓶口用封口膜封住后滅菌。隨后向無菌的發(fā)酵液中加入用量為3.75FPU/g-木薯渣的纖維素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纖維二糖酶和接種量為1％(v/v)的銅綠假單胞菌種子懸液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶置于37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中反應(yīng)168h。隨后對發(fā)酵液中的鼠李糖脂進(jìn)行提取，獲得的鼠李糖脂粗品產(chǎn)量為5.65g/L。
討論：木薯渣經(jīng)雙酶法糖化之后再接入銅綠假單胞菌進(jìn)行發(fā)酵，會使得反應(yīng)初期溶液中的葡萄糖濃度過高，不利于菌種的生長。
對比例3：
木薯渣經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，工業(yè)振動篩篩分過40目篩。木薯渣酶解：10％木薯渣在48℃、180rpm下酶解96h，纖維素酶加入量為3.55FPU/g-木薯渣、纖維二糖酶加入量為5.65CBU/g-木薯渣。培養(yǎng)得到用于接入發(fā)酵體系的銅綠假單胞菌(CGMCC 1.1785)種子懸液。配制2倍濃度發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.25，NaNO3 3.0，KH2PO40.25，酵母提取物1.0。向250mL好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶(帶擋板)中加入25mL的2倍濃度發(fā)酵培養(yǎng)基，再加入25mL木薯渣酶解液，并用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至6.0，制得發(fā)酵液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶的瓶口用封口膜封住后滅菌。隨后向無菌的發(fā)酵液中接入1％(v/v)的銅綠假單胞菌種子懸液。將好氧發(fā)酵培養(yǎng)瓶置于37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中反應(yīng)168h。隨后對發(fā)酵液中的鼠李糖脂進(jìn)行提取，獲得的鼠李糖脂粗品產(chǎn)量為1.30g/L。
討論：木薯渣經(jīng)酶解后接入銅綠假單胞菌進(jìn)行發(fā)酵，會使得反應(yīng)初期溶液中的葡萄糖濃度過高，抑制銅綠假單胞菌的生長。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。