本發(fā)明涉及微藻生物能源領(lǐng)域，涉及一種有效提高微藻油脂含量的方法。
背景技術(shù)：
：隨著全球能源短缺及環(huán)境惡化等問(wèn)題日趨嚴(yán)重，尋找新的清潔可再生能源成為亟需解決的問(wèn)題之一。生物質(zhì)能源以其安全、不易造成二次污染、可再生等優(yōu)勢(shì)在眾多新型能源中脫穎而出，有望取代或部分替代化石能源。而生物柴油作為生物質(zhì)能源的研究熱點(diǎn)，其原料的選擇受到了廣泛關(guān)注。由于微藻可在海水、污水以及灘涂中養(yǎng)殖，具有“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”、光合作用較強(qiáng)能夠固定更多的二氧化碳、油脂含量較高等優(yōu)點(diǎn)，因此，第三代生物柴油以其作為原材料，進(jìn)行了大量研究。目前生物柴油的瓶頸仍然是成本問(wèn)題，其中，藻種的油脂含量是制約生物柴油產(chǎn)率的關(guān)鍵性因素之一，有效提高微藻油脂含量依舊是微藻生物能源領(lǐng)域有待解決的技術(shù)難題。目前，針對(duì)提高微藻油脂含量的研究方向包括營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、誘變育種、基因工程等。營(yíng)養(yǎng)調(diào)控主要以對(duì)氮、磷元素的調(diào)控為主，氮、磷等元素的缺乏能夠明顯提高微藻藻株的含油率，但是，也會(huì)對(duì)其生物量造成消極影響，因此，在總油脂含量上提高不明顯。通過(guò)誘變育種的方式提高藻株油脂含量，能夠達(dá)到較好的效果，但是，由于其突變的不定向性，具有一定的局限性。而通過(guò)基因工程的手段，能夠定向增加微藻藻株的油脂含量，但是由于其技術(shù)難度較大，受到了限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種低頻低強(qiáng)度超聲促進(jìn)微藻油脂合成的方法。具體方案為：將超聲探頭浸入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的微藻培養(yǎng)液，開啟超聲對(duì)微藻進(jìn)行超聲處理，超聲頻率為20-50kHz，超聲功率為10-30W/L(瓦特/每升微藻培養(yǎng)液)，超聲處理時(shí)間為15-35min/d(分鐘/每天)，相鄰兩次超聲脈沖之間時(shí)間間隔為1-6s，總處理時(shí)間為0.5-5d(包括間隔)，最好在微藻的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3-5天)連續(xù)處理三天；處理后的微藻轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中最佳超聲頻率為20kHz，最佳超聲功率為20W/L，最佳處理時(shí)間為30min/d，最佳超聲脈沖時(shí)間間隔為2s。上述超聲探頭為超聲波生物促進(jìn)生長(zhǎng)儀的超聲探頭，超聲探頭進(jìn)入微藻培養(yǎng)液的深度為約2mm。上述微藻的培養(yǎng)基為BG-11微藻培養(yǎng)基或其他任何微藻培養(yǎng)基。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，每次超聲處理所取微藻培養(yǎng)液的體積為10-500ml。上述微藻為柵藻、小球藻、硅藻、隱甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻、金藻和大型藻類等中的一種或多種。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，處理后的微藻培養(yǎng)溫度為0-40℃。微藻油脂的提取方法可為氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-異丙醇法、正己烷-乙醇法和乙醚-石油醚法等。本發(fā)明提供的方法利用超聲促進(jìn)微藻傳質(zhì)，增加酶活，用于提高油脂含量及生物量，創(chuàng)新性強(qiáng)、易于操作，可用于促進(jìn)微藻油脂的積累，同時(shí)提高微藻的生物量。本發(fā)明采用20kHz的低頻超聲波，在不破壞生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性，有利于對(duì)底物的攝取和代謝產(chǎn)物的積累，其中不僅油脂含量增加了37％，而且葡萄糖利用率提高了24％，細(xì)胞干重(生物量)提高了34％，這是由于低頻低功率的超聲波通過(guò)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或者改變酶分子的空間構(gòu)象，從而明顯地加速微生物代謝速率、提高代謝產(chǎn)物的積累。同時(shí)，超聲后的微藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)尼羅紅染色在熒光顯微鏡下能夠顯示更多的黃色熒光，說(shuō)明超聲波確實(shí)能夠促進(jìn)油脂的合成(圖1)。附圖說(shuō)明圖1為微藻細(xì)胞經(jīng)尼羅紅染色后在熒光顯微鏡下的照片：(a)超聲處理前；(b)超聲處理后。圖2為微藻細(xì)胞在超聲波處理前后的最終生物量和油脂含量。圖3為微藻細(xì)胞在超聲波處理前后對(duì)葡萄糖的利用情況。具體實(shí)施方式實(shí)施例1-17本發(fā)明所用藻種為實(shí)驗(yàn)室篩選的柵藻，超聲實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌室中的超凈臺(tái)中完成，溫度為室溫。為了保持無(wú)菌狀態(tài)，試驗(yàn)時(shí)將超聲波生物促進(jìn)生長(zhǎng)儀以及超聲探頭置于超凈臺(tái)內(nèi)，紫外滅菌25min；超聲時(shí)，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的微藻培養(yǎng)液從光照培養(yǎng)箱中取出，放置于經(jīng)紫外滅菌的超凈臺(tái)中；為了使超聲均勻的作用于微藻細(xì)胞，超聲處理開始前首先要將藻液搖勻，然后將經(jīng)過(guò)滅菌的超聲探頭浸入微藻液約2mm進(jìn)行超聲處理(由于超聲探頭直徑較大，本實(shí)驗(yàn)使用體積約為240ml帶有透氣孔的植物組織培養(yǎng)瓶培養(yǎng)微藻，注意一個(gè)樣品處理完成后需用酒精棉將探頭擦干凈，防止樣品之間出現(xiàn)染菌的情況)；在微藻生長(zhǎng)過(guò)程中每隔24h測(cè)定一次藻液在680nm波長(zhǎng)下的吸光度，用于表征微藻濃度；同時(shí)每隔24h測(cè)定一次葡萄糖濃度(用于表征微藻底物消耗速率)。當(dāng)微藻生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)(OD680≈8),取50ml藻液，離心后(10000r/m)于105℃下烘干至恒重，即為生物量。再取50ml藻液，利用氯仿-甲醇法(體積比為2:1)對(duì)油脂進(jìn)行抽提，吸取氯仿相后氮吹至有機(jī)溶劑全部揮發(fā)，恒重后即得到微藻油脂。微藻的油脂含量＝油脂質(zhì)量/生物量×100％微藻的培養(yǎng)基為BG-11微藻培養(yǎng)基，微藻種類為柵藻，超聲總時(shí)間(不包括時(shí)間間隔)為30min。表1實(shí)施例1-17主要參數(shù)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1234567891011121314151617超聲頻率kHz2030405020304050203040503050204010超聲功率W/L1020304050203020202020202020202020超聲時(shí)間min/d1520253035301525203015352025301520超聲間隔s13125612345621246油脂含量(％)2423192223252427262918252926322725從表1可以看出，當(dāng)處理?xiàng)l件采取實(shí)施例15的參數(shù)時(shí)，微藻油脂含量最高。實(shí)施例18-27與實(shí)施例15的區(qū)別在于表2。表2實(shí)施例18-27區(qū)別條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3