本發(fā)明屬于病原生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效殺滅滴蟲等醫(yī)學(xué)原蟲的細菌培養(yǎng)上清液的制備方法和及其利用方法。
背景技術(shù)：
：原蟲為單細胞真核動物.醫(yī)學(xué)原蟲是寄生在人體腔管、體液、組織或細胞內(nèi)的致病及非致病性原蟲,約有40余種，醫(yī)學(xué)原蟲感染后容易引起阿米巴性痢疾、阿米巴性膿腫(以上主要為溶組織阿米巴)、陰道毛滴蟲感染等疾病。原蟲感染可發(fā)生在人體任何部位和組織，隨著經(jīng)濟發(fā)展，大部分原蟲性疾病逐漸減少，但是近年來由于受性概念的轉(zhuǎn)變，陰道滴蟲病發(fā)病又有上升，美國每年婦女感染人數(shù)為300萬，全世界為1.8億，國外資料表明：滴蟲感染率與性接觸次數(shù)有關(guān)，成年處女感染率為零。我國上世紀(jì)50年代滴蟲的感染率已婚婦女為20％左右，上世紀(jì)70年代發(fā)病率明顯下降，以性機能旺盛期為易感年齡。在局部原蟲感染治療中、特別是陰道滴蟲病治療中局部治療常常用滅滴靈(甲硝唑)或凝膠消毒劑，而滅滴靈有致癌作用，不適合孕婦等特殊人群使用，而且滅滴靈和消毒劑容易導(dǎo)致局部微生物菌群平衡失調(diào)，導(dǎo)致瘙癢等不適感。技術(shù)實現(xiàn)要素：為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種廣高效殺滅滴蟲等醫(yī)學(xué)原蟲的細菌培養(yǎng)上清液的制備方法和及其利用方法，具有毒性低、效果塊、配制方法簡便等特點。本發(fā)明目的是通過采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種高效殺滅滴蟲等醫(yī)學(xué)原蟲的細菌培養(yǎng)上清液的制備方法和及其利用方法，其特征在于：所述培養(yǎng)基包括自配基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促進艱難梭菌生長的添加劑、蒸餾水和促進艱難梭菌毒素分泌的添加劑。所述促進艱難梭菌生長的添加劑為動物腸上皮水解產(chǎn)物；所述添加液與蒸餾水的體積比為1:99～5:95；所述促進艱難梭菌毒素分泌的添加劑為甲醇:所述甲醇添加量為10～100mg/L:優(yōu)選的，所述自配基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為可溶性淀粉10g/L，酵母浸出液5g/L，磷酸氫二鈉0.1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，維生素B20.1g/L。優(yōu)選的，所述動物血液水解產(chǎn)物為鳥類或哺乳類動物腸上皮，處理溫度為190度以上200度以下,處理壓力2個大氣壓以上。優(yōu)選的，所述甲醇其純度在99％以上。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟：(1)將動物腸上皮在190度以上200度以下溫度和2個大氣壓以上的條件進行水解，制備細菌生長促進劑；(2)按自配基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方稱取可溶性淀粉10g/L，酵母浸出液5g/L，磷酸氫二鈉0.1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，維生素B20.1g/L，加入所述細菌生長促進劑和所述蒸餾水，混勻，121℃高壓滅菌25min；所述細菌生長促進劑與蒸餾水的體積比為1:99～5:95；(3)滅菌后放置室溫冷卻至60℃后添加甲醇50mg。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)細菌為艱難梭菌；優(yōu)選的，所述艱難梭菌可分泌艱難梭菌毒素A和B以及二元毒素B；優(yōu)選的，所述艱難梭菌為ATCCBAA-1805菌株；優(yōu)選的，所述艱難梭菌培養(yǎng)上清液，可以以原始狀態(tài)(液態(tài))使用，使用濃度為1～10％左右的水溶液；優(yōu)選的，所述艱難梭菌培養(yǎng)上清液，可以經(jīng)過濃縮干燥使用，使用時濃度為10～1000mg/L。優(yōu)選的，所述艱難梭菌培養(yǎng)上清液，可以經(jīng)過蛋白鹽析、沉淀等精化后使用，使用時濃度為1～100mg/L。優(yōu)選的，所述的上清液處理物可添加到外用藥物使用與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明培養(yǎng)基利用了細菌生長促進劑，可促進艱難梭菌的生長和毒素的分泌，提高培養(yǎng)上清中的毒素含量，達到能夠殺滅原蟲的濃度。(2)本發(fā)明方法所獲得的培養(yǎng)上清液可以低毒性、短時間、高效的殺滅局部的原蟲。具體實施方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1：本發(fā)明培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基對艱難梭菌生長對比測試1、配制傳統(tǒng)培養(yǎng)基秤取腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)38.5g，現(xiàn)配1L液體培養(yǎng)基，分注試管后121度、1.2個大氣壓滅菌15分鐘后，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為對照組。2、配制添加艱難梭菌生長促進劑、未添加促進艱難梭菌毒素添加劑的培養(yǎng)基(1)取100ml豬腸(購買自農(nóng)貿(mào)市場)用剪刀剪碎，均勻攪拌后使用高溫高壓反應(yīng)釜進行水解，溫度設(shè)定195度，壓力設(shè)定2.1大氣壓，經(jīng)過1個小時處理后過濾，濾過液倒入玻璃瓶，再次進行滅菌(121度、1.2大氣壓、15分鐘)備用。(2)稱量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.5g，維生素B20.1g，加入(1)中的50ml動物腸上皮水解液和950ml蒸餾水，混勻，分注試管后121℃高壓滅菌25min，室溫冷卻，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為實驗組1。3、使用氮氣驅(qū)逐氧氣后將對照組和實驗組1放入?yún)捬豕拗信囵B(yǎng)，24小時后在OD600進行檢測，以O(shè)D600數(shù)據(jù)推測生長情況(詳見表一)。實驗結(jié)果說明動物腸上皮水解產(chǎn)物能促進艱難梭菌的生長，作為本發(fā)明中的關(guān)鍵組分。實施例2：添加促進艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基和未添加促進艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基對比測試1、配制添加促進艱難梭菌毒素添加劑的培養(yǎng)基在進行實施例1的同時，配制添加促進艱難梭菌毒素添加劑的培養(yǎng)基，稱量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.5g，維生素B20.1g，并溶于1L蒸餾水中，混勻，于121℃高壓滅菌25min后室溫冷卻，溫度下降到60度后添加50mg甲醇，分注試管中，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為實驗組2。2、與對照組和實驗組1同樣氮氣排空氣后厭氧培養(yǎng)24小時后使用艱難梭菌毒素A/B檢測試劑(C.DIFFICILETOXA/BII試劑盒，購自美艾利爾(中國)醫(yī)療器械有限公司)檢測毒素A和B濃度以及OD值(詳見表二)。實驗結(jié)果顯示只添加促進毒素添加劑雖然能夠提高毒素分泌，但是提高艱難梭菌生長的作用不大。實施例3：添加促進艱難梭菌毒素添加劑和促進艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基對比測試在進行實施例1和2的同時，配制添加促進艱難梭菌生長添加劑和毒素添加劑的培養(yǎng)基，稱量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.5g，維生素B20.1g，以及動物腸上皮水解產(chǎn)物50ml，溶于950ml蒸餾水中，混勻，于121℃高壓滅菌25min后室溫冷卻，溫度下降到60度后添加50mg甲醇，分注試管中，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為實驗組3。與對照組和實驗組1、實驗組2同樣氮氣排空氣后厭氧培養(yǎng)24小時后使用艱難梭菌毒素A/B檢測試劑(C.DIFFICILETOXA/BII試劑盒，購自美艾利爾(中國)醫(yī)療器械有限公司)檢測毒素A和B濃度以及OD值(詳見表三)。實驗結(jié)果顯示本發(fā)明培養(yǎng)基能夠同時提高艱難梭菌生長速度和毒素分泌。實施例4：皮膚粘膜毒性實驗將實施例3的試管進行離心，收集培養(yǎng)上清液，使用過濾滅菌器進行過濾滅菌，分成三份，一份作為原液，一份進行低溫濃縮干燥，一份進行鹽析脫鹽精制待用。選取健康雄性小白鼠(KM小鼠，15日齡)30只，剃毛露出皮膚，分成三組進行皮膚毒性實驗；第一組：直接涂抹原液，6次/日；第二組：使用無菌蒸餾水溶解低溫濃縮干燥產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日；第三組：使用無菌蒸餾水溶解精制產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日。經(jīng)過7天實驗，未發(fā)現(xiàn)小白鼠皮膚紅腫、糜爛、潰瘍、發(fā)疹等現(xiàn)象。選取健康雌性小白鼠(KM小鼠，15日齡)30只，分成三組進行會陰部粘膜毒性實驗，使用細棉棒涂抹到陰道壁；第一組：直接涂抹原液，6次/日；第二組：使用無菌蒸餾水溶解低溫濃縮干燥產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日；第三組：使用無菌蒸餾水溶解精制產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日。經(jīng)過7天實驗，未發(fā)現(xiàn)小白鼠陰道壁紅腫、糜爛、潰瘍、發(fā)疹等現(xiàn)象，殺死小白鼠后觀察宮頸也未發(fā)現(xiàn)紅腫或糜爛。實驗結(jié)果顯示本發(fā)明培養(yǎng)上清液對皮膚和粘膜未見毒性反應(yīng)。實施例5：滴蟲殺滅實驗使用5％小牛血清(BSA)+肝浸湯培養(yǎng)基培養(yǎng)陰道毛滴蟲，5％二氧化碳培養(yǎng)箱37度24小時培養(yǎng)，使用細胞計數(shù)板計數(shù)，培養(yǎng)密度為6.5*105/ml，顯微鏡下滴蟲活動性良好，將培養(yǎng)毛滴蟲分注到24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1ml備用。取實施例4配制的上清液，使用無菌蒸餾水進行10倍稀釋，配制10-1、10-2、10-3、10-4濃度試劑后每孔加入10ul，對照組加入10ul生理鹽水，1小時后顯微鏡下觀察毛滴蟲，發(fā)現(xiàn)實驗組原液：10-1、10-2濃度下滴蟲失去活動能力，部分滴蟲出現(xiàn)形態(tài)不完整現(xiàn)象，其余兩種10-1、10-2、10-3、10-4濃度均見滴蟲失去活動能力，部分滴蟲出現(xiàn)形態(tài)不完整現(xiàn)象，10-1、10-2濃度形態(tài)不完整細胞最多，考慮艱難梭菌毒素A和B以及二元毒素的微絲微管破壞作用導(dǎo)致滴蟲的微絲和微管，從而起到殺滅滴蟲作用。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對發(fā)明專利保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明做了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍的前提下，還可以對本發(fā)明的技術(shù)方案做出修改或者等同替換，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。附表一：本發(fā)明培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基對艱難梭菌生長對比測試對比測試結(jié)果對照組實驗組1(50ml動物腸上皮水解產(chǎn)物)24小時后平均OD0.41.3表二：添加促進艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基和未添加促進艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基對比測試對照組實驗組1實驗組224小時后毒素A平均濃度20ng/ul31ng/ul25ng/ul24小時后毒素B平均濃度12ng/ul26ng/ul17ng/ul24小時后平均OD0.41.30.7表三：添加促進艱難梭菌毒素添加劑和促進艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基對比測試對照組實驗組1實驗組2實驗組324小時后毒素A平均濃度20ng/ul31ng/ul25ng/ul47ng/ul24小時后毒素B平均濃度12ng/ul26ng/ul17ng/ul33ng/ul24小時后平均OD0.41.30.71.4當(dāng)前第1頁1 2 3