本發(fā)明屬于活性物質制備技術領域，具體涉及一種由亞洲蜈蚣藻制備卡拉膠寡糖的方法。

背景技術：

海藻中的低分子糖類物質都來源于天然資源，安全性高、功效特殊、公眾的可信性高，因此作為保健、醫(yī)用化妝添加、醫(yī)藥輔料、醫(yī)藥的特殊用途，其研究和推廣的速度快，應用范圍廣，因此開發(fā)成功后，一旦在保健、醫(yī)用化妝品領域取得一席之地，其直接經濟效益巨大。而且通過深加工，將突破大型海藻作為食品、化工等添加劑的限制，由產品的銷售帶動海藻的養(yǎng)殖，并由此將間接帶動藻類的養(yǎng)殖、增加養(yǎng)殖收益、改善養(yǎng)殖海域的生態(tài)環(huán)境。

然而海藻寡糖的制備一直是制約其應用的瓶頸，制備卡拉膠寡糖的方法主要有三種：生物酶法、化學法及物理法。傳統(tǒng)的化學法和物理法的主要缺陷是反應條件不易控制、產物聚合度很高且分布不均一，且產生的大量廢水易污染環(huán)境。生物酶法能明顯克服這些缺陷，具有反應條件溫和易控制、底物專一性好等優(yōu)點，但現(xiàn)有的卡拉膠酶通常來源于常溫微生物，大部分為熱不穩(wěn)定酶，當溫度高于50℃時就會迅速失活，嚴重限制了其在卡拉膠寡糖制備工藝中的應用。

技術實現(xiàn)要素：

為解決海藻寡糖傳統(tǒng)制備方法效率低下的問題，本發(fā)明提供一種制備卡拉膠寡糖的制備工藝，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。

本發(fā)明的方法包括以下步驟：

1)將亞洲蜈蚣藻沖洗干凈，切碎、勻漿配成3-5％(w/v)的勻漿液；

2)向蜈蚣藻的勻漿液中，加入纖維素酶，在55℃作用進行酶解1-4h或以上；

作為優(yōu)選，按照質量比1.0-3.5萬U/g的比例加入纖維素酶；

3)然后添加高溫卡拉膠酶，55℃，35rpm條件下酶解1-7h；

作為優(yōu)選，按照0.5-11.0U/g蜈蚣藻的量添加高溫卡拉膠酶；

4)酶解液經離心、濃縮，稱取濃縮的酶解液，緩慢加入到活性炭柱中，分別以重蒸水和5-25％等不同體積分數(shù)梯度的乙醇溶液洗脫，流速控制為3.0～4.0ml/min；收集各種洗脫液濃縮至適量，冷凍干燥，獲得卡拉膠寡糖。

所述的高溫卡拉膠酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

上述方法中使用的活性炭柱中的活性炭，是先用稀鹽酸浸泡后，再去掉稀鹽酸，用無水乙醇浸泡，再倒出無水乙醇加入蒸餾水浸泡，最后將活性炭烘干備用。

本發(fā)明首次從蜈蚣藻中制備海藻寡糖；其次，本發(fā)明采用高溫卡拉膠酶結合復合纖維素酶的制備工藝，實現(xiàn)一步制備海藻寡糖的工藝，極大的提高了海藻寡糖的制備效率，采用該制備工藝，卡拉寡糖的得率可達蜈蚣藻干重的8％。

附圖說明

圖1：熱穩(wěn)定卡拉膠酶基因重組表達的SDS-PAGE圖譜

圖2：熱穩(wěn)定卡拉膠酶的最適作用溫度圖；

圖3：酶解寡糖的層析檢測結果圖；其中注：M為標準寡糖對照；依次為酶活酶對照、15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、360min、720min、1440min。

圖4：纖維素酶的添加量對酶解效果的影響圖；

圖5：纖維素酶的作用時間對酶解效果的影響圖；

圖6：卡拉膠酶的添加量對酶解效果的影響圖；

圖7：酶解時間對酶解效果的影響圖。

具體實施方式

海藻寡糖的制備通常采用化學法和物理法，該方法主要缺陷是反應條件不易控制、產品質量差，且易污染環(huán)境。而采用生物酶法制備能明顯克服這些缺陷，但由于現(xiàn)有的卡拉膠酶絕大多數(shù)為熱不穩(wěn)定酶，當溫度高于50℃時就會迅速失活，嚴重限制了其在卡拉膠寡糖制備工藝中的應用。本發(fā)明提供了一種熱穩(wěn)定卡拉膠酶，該酶在55℃條件下降解制備卡拉膠寡糖，不僅大大提高了底物和產物的溶解性，減少物質與反應器的貼壁效應，有效提升了卡拉膠寡糖的制備效率。

其中海藻寡糖的檢測方法的步驟如下：

A、毛細管點樣用鉛筆在距硅膠板底端2cm處輕輕劃一條直線，為方便點樣，在點樣前在直線上每隔2cm處做一個標記。用0.5mm玻璃點樣毛細管分別將卡拉膠寡糖標準品和卡拉膠寡糖樣品點樣于硅膠板直線上的標記處，在用毛細管點樣時，毛細管應垂直于硅膠板的方向點樣，而且毛細管接觸硅膠板的時間應盡量短，不然點樣斑點直徑難以控制，點樣斑點直徑要控制2mm，讓點樣點自然干燥。

B、層析缸展層將已點好樣的硅膠板底端(點樣端)放入已盛有展層劑的層析缸中，層析板一定要放平，展層劑液面不得超過點樣點，層析時層析缸封閉，自下而上展層，當展層前沿達距薄板頂端1厘米處時，取出硅膠板，于60℃烘箱中烘干。

C、顯色劑顯色將顯色劑均勻的噴涂在烘干好的層析硅膠板上，置于60℃烘箱內加熱，直至顯出層析斑點。

以下結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：熱穩(wěn)定卡拉膠酶的制備及其序列特征

微生物樣品采自于印度尼西亞卡利安達島東海岸的熱泉樣品(5°44’46”N,105°35’12”E)，經16S DNA鑒定確定該菌為芽孢桿菌(Bacillus)屬；初步發(fā)酵實驗表明該菌株在高溫下具有降解卡拉膠的能力。將純化的菌株加入含30wt％的甘油溶液中，保存于-80℃超低溫冰箱中。

(1)制備目的DNA片段

將芽孢桿菌菌(Bacillus)種子液接種于Zobell 2216E海水培養(yǎng)基中，于50℃、150rpm的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用細菌基因組提取試劑盒(購自Tiangen公司，DP302-02)提取染色體DNA，檢測其電泳DNA濃度，DNA長度大于40kb，符合建庫要求。

(2)基因組DNA的部分消化

芽孢桿菌菌(Bacillus)染色體DNA經Sau3AI內切酶部分消化，Sau3AI內切酶酶切60min后，制得插入片段。酶切60min后，染色體DNA剛好酶切完全，適用于構建基因組文庫；當酶切時間超過80min后，酶切過度，各片段不是平均分布，而多為小片段，不利于建庫。因此選酶切60min作為菌株HT19染色體DNA的不完全酶切時間。

(3)基因組文庫的構建

按照pET22b載體(購自Novagen公司)和插入片段約1:3的摩爾比作連接反應。反應體系于16℃連接過夜，濃縮連接產物至3μl，分別取1μl轉化感受態(tài)細胞E.coli DH5α，培養(yǎng)后涂布與含有氨芐青霉素(50μg/ml)、IPTG(20μg/ml)和X-Gal(40μg/ml)的LB平板培養(yǎng)基上，于37℃靜置培養(yǎng)過夜至可見菌落，根據(jù)菌落藍白斑反應篩選轉化子。隨機挑取約18000個菌落作為基因組文庫的克隆保存，從平板中隨機挑選15個白色單菌落，提取質粒，用BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M經PCR擴增目的片斷，引物序列如下：

BcaBEST Primer M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

BcaBEST Primer RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸240s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

經檢測每個克隆均有外源DNA，最小插入片段為800bp左右，最大插入片段6kb左右，平均插入片段大小約為4kb左右。

從基因組文庫中篩選一個周圍有明顯水解圈的克隆。提取重組質粒并測序，獲得產熱穩(wěn)定卡拉膠酶完整的ORF。ORF的完整長度為1125bp，共編碼374個氨基酸，理論分子量為42.5kDa。

實施例2：熱穩(wěn)定卡拉膠的重組表達載體構建

將本發(fā)明獲得的熱穩(wěn)定卡拉膠基因克隆到表達載體上，構建重組表達菌株。首先基于全長序列，設計擴增全基因的引物：

上游引物F-GTCGTCGTCGACCAGTAATTTTACCGGTATC；

下游引物R-CATAAATCTAGACACTCACGACTAAAGTATCT；

PCR擴增確認基因全長序列。采用酶切克隆的方法構建表達質粒，即用采用BamH I/XbaⅠ內切酶對熱穩(wěn)定卡拉膠酶的PCR產物和表達載體pET-30(a)分別進行雙酶切，回收純化；利用T4 DNA Ligase進行連接，并轉化TOP10的感受態(tài)細胞。采用質粒抽提試劑盒(購自Tiangen公司)提取陽性克隆的質粒，經檢測，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，該基因編碼400個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

將上述制得的陽性克隆的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株中，構建表達重組菌株；具體過程如下：

取-80℃保存的BL21，于冰上融化，以預冷的移液管槍尖吸取10μl重組質粒，加入剛剛融化的BL21；輕搖混勻，冰浴放置30min，迅速轉移到42℃水浴中，準確放置90秒；迅速轉移到冰上，冷卻2min；然后加入800μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃，150rpm，45min；涂布含卡那霉素50μg/mL的LB平板培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。將上述構建好的表達重組菌株轉接到100ml含有卡那霉素50μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴大培養(yǎng)直至菌液OD₆₀₀值達0.6時，15℃冷卻30min，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為1.0mmol/L，15℃搖床培養(yǎng)24h。低溫離心收集上清，濃縮凍干。然后進行Ni²⁺親和層析，由于表達的重組蛋白N端含有6×His tag，能親和吸附到層析柱中，經不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫后，收集洗脫液，凍干備用。重組蛋白的誘導表達以及純化后重組蛋白的SDS-PAGE電泳檢測結果見圖1。

(5)熱穩(wěn)定卡拉膠酶活性檢測和酶特性分析

利用DNS(3,5-二硝基水楊酸)方法測定上述制得的熱穩(wěn)定卡拉膠酶活性。具體操作如下：

分別取1mL滅活的與沒滅活的熱穩(wěn)定卡拉膠酶酶液和2mL底物溶液(含有0.2wt％的κ-卡拉膠)于60℃溫度恒溫水浴反應30min，取1mL反應產物加入到1.5mL DNS溶液中，沸水浴5min。而后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水至25mL，混勻在520nm波長下測OD值。測得的熱穩(wěn)定卡拉膠酶活性為800U/ml。

另外，將上述制得的熱穩(wěn)定卡拉膠酶酶液直接滴于固體平板培養(yǎng)基上，用碘液染色后可以看到明顯的透明圈，表明熱穩(wěn)定卡拉膠酶是具有卡拉膠降解活性的，為后續(xù)的研究和應用提供了良好材料。

為測定熱穩(wěn)定卡拉膠酶的耐熱性，分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃進行酶促反應30min，DNS法測定熱穩(wěn)定卡拉膠酶的酶活。以酶活最高值為100％計算其相對酶活力。

經測定，熱穩(wěn)定卡拉膠酶最適反應溫度為60℃(圖2)，在溫度為80℃的條件下，該酶仍具有50％左右的酶活，較現(xiàn)有卡拉膠酶具有明顯的高溫耐受性特性。

純化凍干后的熱穩(wěn)定卡拉膠酶即可用于蜈蚣藻寡糖制備，我們首先驗證了該熱穩(wěn)定卡拉膠酶對蜈蚣藻膠降解產物的組成分析，結果見圖3。

實施例2

A、將亞洲蜈蚣藻沖洗干凈，將蜈蚣藻切碎、勻漿配成5％(w/v)的勻漿液；按照0.5-3.5萬U/g蜈蚣藻添加纖維素酶，55℃、35rpm條件下酶解2h后，然后按照5.0U/g蜈蚣藻的量添加卡拉膠酶，55℃、35rpm條件下酶解6h，測定各實驗組的還原糖生成量和粘度作還原糖相對含量、相對粘度與酶添加量的關系曲線，確定最適的纖維素酶添加量。

由圖4可以看出，添加不同量的纖維素酶，55℃條件下對亞洲蜈蚣藻中的纖維素進行2h降解。結果顯示，纖維素酶添加量在0.5～2.5萬U/g蜈蚣藻范圍內，還原糖的生成量呈明顯上升趨勢，酶解液粘度也呈明顯下降趨勢。大于2.5萬U/g蜈蚣藻的條件下，還原糖的生成量和酶解液粘度的變化趨勢不再明顯。因此，在保證纖維素降解效果的前提下，選擇更加節(jié)約的酶添加方式，纖維素酶的最適添加量確定為2.5萬U/g蜈蚣藻。收集、濃縮酶解液備用。

B、將100g活性炭先以10％的稀鹽酸500ml浸泡過夜。倒出稀鹽酸，加入500ml無水乙醇浸泡，再倒出無水乙醇加入蒸餾水浸泡，最后將活性炭80℃烘干備用；

C、酶解液經離心、濃縮，稱取濃縮的酶解液，緩慢加入到活性炭柱(4×60cm)，8％體積分數(shù)梯度的乙醇溶液洗脫，流速控制為3.0～4.0ml/min。收集各種洗脫液濃縮至適量，冷凍干燥，備用。酶解產物組成、純度和得率見表1。

表1降解后亞洲蜈蚣藻寡糖得率

實施例2

A、將亞洲蜈蚣藻沖洗干凈，將蜈蚣藻切碎、勻漿配成5％(w/v)的勻漿液；按照2.5萬U/g蜈蚣藻添加纖維素酶，55℃、35rpm條件下酶解1-4h后，然后按照5.0U/g蜈蚣藻的量添加卡拉膠酶，55℃、35rpm條件下酶解6h，測定各實驗組的還原糖生成量和粘度；作還原糖相對含量、相對粘度與酶添加量的關系曲線，確定最適的纖維素酶添加量。

在確定最適纖維素酶添加量的基礎上，對纖維素酶的降解時間進行了探究，結果發(fā)現(xiàn)，酶解2.5h左右還原糖的生成量和酶解液的粘度基本不再變化，說明降解基本完全(圖5)。收集、濃縮酶解液備用。

B、將100g活性炭先以10％的稀鹽酸500ml浸泡過夜。倒出稀鹽酸，加入500ml無水乙醇浸泡，再倒出無水乙醇加入蒸餾水浸泡，最后將活性炭80℃烘干備用；

C、酶解液經離心、濃縮，稱取濃縮的酶解液，緩慢加入到活性炭柱(4×60cm)，以8％體積分數(shù)梯度的乙醇溶液洗脫，流速控制為3.0～4.0ml/min。收集各種洗脫液濃縮至適量，冷凍干燥，備用。酶解產物組成、純度和得率見表2。

表2降解后亞洲蜈蚣藻寡糖得率

實施例3

A、將亞洲蜈蚣藻沖洗干凈，將蜈蚣藻切碎、勻漿配成5％(w/v)的勻漿液；按照2.5萬U/g蜈蚣藻添加纖維素酶，55℃、35rpm條件下酶解2.5h后，然后按照1.0-9.0U/g蜈蚣藻的量添加卡拉膠酶，55℃、35rpm條件下酶解6h，測定各實驗組的還原糖生成量和粘度，以確定卡拉膠酶的最佳用量。

如圖6所示，卡拉膠酶的最適添加量約為7.0U/g蜈蚣藻，在該添加量的條件下降解6h，還原糖的量上升幅度趨緩，同時酶解液的粘度變化不再明顯。因此選擇7.0U/g蜈蚣藻的卡拉膠酶添加量作為最適添加量。收集、濃縮酶解液備用。

B、將100g活性炭先以10％的稀鹽酸500ml浸泡過夜。倒出稀鹽酸，加入500ml無水乙醇浸泡，再倒出無水乙醇加入蒸餾水浸泡，最后將活性炭80℃烘干備用；

C、酶解液經離心、濃縮，稱取濃縮的酶解液，緩慢加入到活性炭柱(4×60cm)，以8％體積分數(shù)梯度的乙醇溶液洗脫，流速控制為3.0～4.0ml/min。收集各種洗脫液濃縮至適量，冷凍干燥，備用。酶解產物組成、純度和得率見表3。

表3降解后亞洲蜈蚣藻寡糖得率

實施例4

A、將亞洲蜈蚣藻沖洗干凈，將蜈蚣藻切碎、勻漿配成5％(w/v)的勻漿液；按照2.5萬U/g蜈蚣藻添加纖維素酶，55℃、35rpm條件下酶解2.5h后然后按照7.0U/g蜈蚣藻的量添加卡拉膠酶，55℃、35rpm條件下酶解1-7h，測定各實驗組的還原糖生成量和粘度，以確定最佳的酶解時間。

由圖7可見，酶解4h后還原糖的生成量和粘度基本不再變化，因此確定卡拉膠酶的最佳作用時間為4h。收集、濃縮酶解液備用。

B、將100g活性炭先以10％的稀鹽酸500ml浸泡過夜。倒出稀鹽酸，加入500ml無水乙醇浸泡，再倒出無水乙醇加入蒸餾水浸泡，最后將活性炭80℃烘干備用；

C、酶解液經離心、濃縮，稱取濃縮的酶解液，緩慢加入到活性炭柱(4×60cm)，以8％體積分數(shù)梯度的乙醇溶液洗脫，流速控制為3.0～4.0ml/min。收集各種洗脫液濃縮至適量，冷凍干燥，備用。酶解產物組成、純度和得率見表4。

表4降解后亞洲蜈蚣藻寡糖的得率

本發(fā)明首次以蜈蚣藻為原料，采用高溫卡拉膠酶結合復合纖維素酶的制備工藝，實現(xiàn)一步制備海藻寡糖的工藝，極大的提高了海藻寡糖的制備效率，采用該制備工藝，卡拉寡糖的得率可達蜈蚣藻干重的8％。

SEQUENCE LISTING

<110> 國家海洋局第一海洋研究所

<120> 一種由亞洲蜈蚣藻制備卡拉膠寡糖的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 374

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Ala Phe Ile Asn Ile Lys Pro Glu Leu Lys Gln Asn Met Glu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Asp Ile Leu Asn Ile Pro Glu Pro Leu Leu Ile Ser Ala Asn

20 25 30

Ala Asn Ala Ser Ala Asp Glu Leu Tyr Phe Pro Gly Val Ser Phe His

35 40 45

Ala Gly Lys Asn Val Gln Ala Ala Glu Thr Tyr Glu Gln Leu Gln Leu

50 55 60

Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Phe Glu Asp Glu Gln Trp Leu Thr Lys Thr

65 70 75 80

Ala Val Tyr Asp Ser Ala Glu Leu Lys Lys Glu Ile Gly Arg Leu Thr

85 90 95

Glu Cys Phe Pro Phe Val Thr Ser Arg Ile Ile Gly Arg Ser Ser Met

100 105 110

Gly Gln Pro Ile Tyr Glu Leu Leu Leu Gly Ala Glu Asn Ala Gly Lys

115 120 125

Arg Thr His Met Asn Ala Ser Phe His Ala Asn Glu Trp Ile Thr Thr

130 135 140

Ser Val Leu Met Lys Trp Leu Lys Glu Tyr Cys Tyr His Leu Cys Thr

145 150 155 160

Gly Gln Thr Ala Leu Gly Phe Ser Pro Leu Asp Ile Phe Ser Ser Thr

165 170 175

Lys Leu Ser Val Val Pro Ile Val Asn Pro Asp Gly Val Asp Leu Val

180 185 190

Leu Asn Gly Pro Gly His Leu Gly Ile Ala Arg Glu Ala Leu Asp Glu

195 200 205

Met Asn Glu His Gln Pro Asp Phe Arg Glu Trp Lys Ala Asn Ile Asn

210 215 220

Gly Val Asp Leu Asn Asn Gln Phe Pro Ser Phe Trp Glu Ile Glu Lys

225 230 235 240

Gln Arg Lys Pro Pro Lys Ser Pro Ser Tyr Arg Asp Tyr Pro Gly Asp

245 250 255

Glu Pro Leu Thr Glu Pro Glu Ala Ala Ala Met Arg Asp Leu Ile Ala

260 265 270

Asn Glu Pro Pro Asp Arg Leu Val Ala Leu His Thr Gln Gly Glu Glu

275 280 285

Ile Tyr Trp Gly Tyr Lys Gly Leu Glu Pro Pro Glu Ser Ala Asp Val

290 295 300

Ile Gln Thr Phe Glu Arg Leu Ser Gly Tyr Lys Gly Val Arg Tyr Ile

305 310 315 320

Asp Ser Tyr Ala Gly Phe Arg Asp Trp Phe Ile His Tyr Tyr Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Val Glu Leu Gly Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Leu

340 345 350

Lys Gln Phe Asp Asp Ile Tyr Cys Lys Ser Arg Gly Ile Leu Trp Ala

355 360 365

Ser Cys Phe Phe Glu Ser

370

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atggcattca tcaacatcaa accggagtta aagcagaata tggaaagact gtctgacatt 60

ctgaacatac ccgaaccgct tttaatcagt gcaaatgcaa atgcatccgc ggacgaactt 120

tattttccgg gagtatcttt tcatgcagga aaaaacgttc aagcagcaga aacatatgaa 180

cagctgcaat tattggcgaa tcaatacacg tttgaagatg aacagtggct gacaaaaaca 240

gccgtttacg attcagcaga actgaaaaag gaaattggca gattgacgga atgctttccg 300

tttgttactt cccgtatcat cggccgctca agcatgggcc agcctatata tgaactgctc 360

cttggagctg aaaatgccgg aaaaagaacg catatgaatg cctcttttca tgccaatgaa 420

tggatcacca cttctgtttt gatgaaatgg ctcaaagaat actgttatca tttatgtaca 480

ggccagaccg ctttaggttt ttcaccgctc gatatttttt catcaacaaa gctttccgtc 540

gtgccgatcg ttaatcccga cggtgttgac cttgtactta acggccccgg tcatcttggg 600

atcgcgagag aagcgctgga tgagatgaac gagcatcagc cggatttccg ggaatggaaa 660

gccaatataa acggagtgga tttaaataat cagtttccgt ctttctggga gatcgaaaaa 720

caaagaaaac cgcctaaatc cccttcctac agagactacc ccggagatga accgctgaca 780

gaaccggaag cggcagcgat gagggattta atcgcaaacg agccgcctga ccggcttgtg 840

gcgcttcaca cacaggggga ggaaatttat tggggataca agggattgga gcctcctgaa 900

tcagctgatg tgatccaaac atttgagcgc ctgagcggtt ataagggcgt cagatatata 960

gacagctatg caggatttag agattggttt attcattatt acggaagaga aggatatact 1020

gttgaacttg gcaaaggaaa aaatccttta ccgctgaaac aatttgacga tatatattgt 1080

aaaagcagag gaatactttg ggcatcctgt ttttttgaaa gctga 1125