本發(fā)明涉及枸杞多糖提取技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)：

枸杞多糖是一種生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)T、B、CTL、NK和巨噬細(xì)胞等免疫功能，促進(jìn)IL-2、IL-3和TNFβ等細(xì)胞因子產(chǎn)生。增強(qiáng)荷瘤、化療與輻射損傷小鼠免疫功能及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)(NIM)網(wǎng)絡(luò)的作用，淡黃色纖維狀固體，有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老多種功效，可制藥；

枸杞多糖的提取純化分為二步。一是枸杞粗多糖的提取，二是枸杞多糖的分級純化。粗多糖的提取工藝如下：稱取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮(1：1)回流脫脂，濾出溶劑，殘?jiān)L(fēng)干后以80%乙醇脫單糖和低聚糖。將脫低聚糖等后的殘?jiān)盟?0~100℃水溶提多糖，提取液減壓濃縮后用酒精沉淀多糖，再用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。例如公告號為CN1263108的一種枸杞多糖提取純化工藝，該專利采用新鮮枸杞漿果分離除去枸杞籽后，制得枸杞原汁，先用50萬分子量膜分離枸杞色素及不溶固形微粒，再用1—10萬分子量膜截留溶解枸杞多糖原汁部分，真空冷凍成枸杞多糖粗品，訂制Φ45mm和Φ100mm大柱徑分離柱對枸杞多糖粗品柱層析，可以g量級以上制備純枸杞多糖。上述專利采用了先進(jìn)的膜分離技術(shù)和大柱層析技術(shù)，提高了枸杞多糖的制備效率和得率，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，使枸杞多糖盡快轉(zhuǎn)化為藥品，用于醫(yī)學(xué)臨床。但是該專利只是通過過濾和層析這種物理方式進(jìn)行提取枸杞多糖，提取速度慢，提取時(shí)間長；

近年來，越來越多的文獻(xiàn)是關(guān)于枸杞多糖提取及其分離工藝，枸杞多糖作為一種無毒副作用的活性成分，越來越受到人們的關(guān)注。枸杞干果中含有60～70%單糖和雙糖、9～11%的多糖、0.2～0.3%的黃酮，以及7～8%的蛋白。目前對枸杞多糖的提取研究是采用水提法進(jìn)行，該法提取溫度較高，易破壞多糖活性，同時(shí)傳統(tǒng)的提取方法對枸杞原料的要求高，資源利用率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

（一）解決的技術(shù)問題

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，解決了提取速度慢，提取時(shí)間長的問題，提高枸杞多糖得率和資源利用率。

（二）技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：

A1、將枸杞干果在60℃條件下烘干，再將其粉碎過50目篩，同時(shí)準(zhǔn)備黃酒酵母菌種。

A2、將一定量的枸杞干果粉原料投入提取罐內(nèi)，加入40倍原料量的去離子水和5%黃酒酵母菌種，加熱攪拌升溫至28℃，保溫?cái)嚢杼崛?6小時(shí)；

A3、對保溫?cái)嚢韬蟮囊后w進(jìn)行過濾，以得到上清液，濾渣再次用5倍量的水與黃酒酵母分別提取兩次，方法相同；

A4、濾液用真空泵抽到單效濃縮器中（濾液以裝滿容器體積的2/3為宜），在溫度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽壓力0.2MPa條件下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮到至固形物為50-55%左右；

A5、加入4倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉兩次，再經(jīng)過離心、乙醚洗滌、粉碎和噴霧干燥，最后通過80目篩，得枸杞多糖。

優(yōu)選的，A1中黃酒酵母菌種的制作方法包括以下步驟：

A11、YPD培養(yǎng)基的配制。

A12、挑取黃酒酵母單菌落接菌于YPD培養(yǎng)基中，并將混入有黃酒酵母單菌的YPD培養(yǎng)基放入28℃的空氣搖床中，180r/min，培養(yǎng)48小時(shí)之后即得。

優(yōu)選的，A11中YPD培養(yǎng)基的配制方法為稱取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析純葡萄糖，加水定容至1000mL，分裝置500mL的錐形瓶中各100mL，121℃高溫高壓滅菌15min制得。

優(yōu)選的，A3中的過濾采用板框進(jìn)行，板框由濾板和濾框交替疊合構(gòu)成，在板與框之間設(shè)置有壓濾布。

優(yōu)選的，A1和A5中粉碎均采用型號為ZN-04B的小型粉碎機(jī)。

優(yōu)選的，A5中的離心采用低速大容量臺式離心機(jī)。

（三）有益效果

本發(fā)明提供了一種微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝。具備以下有益效果：

1、本發(fā)明通過黃酒酵母菌種和去離子水的配合，有利用了微生物法提取枸杞多糖，降低了提取所消耗的時(shí)間，提取速度快，適用性強(qiáng)，可靠性高。

2、本發(fā)明有效的利用了板框?qū)Ρ財(cái)嚢韬蟮囊后w進(jìn)行過濾，并且板框由濾板和濾框交替疊合構(gòu)成，在板與框之間設(shè)置有壓濾布，過濾面積大，占地面積小，過濾效果高，結(jié)構(gòu)簡單，便于攜帶。

3、本發(fā)明通過無水乙醇對固定物含量50-55%的濾液進(jìn)行醇沉，再經(jīng)過低速大容量臺式離心機(jī)進(jìn)行離心、乙醚洗滌保證了提取后的枸杞多糖干凈度，提取質(zhì)量高。

4、本發(fā)明不使用有機(jī)溶劑，對環(huán)境友好，枸杞資源利用率高，提取溫度低，發(fā)酵過程中產(chǎn)生多肽和多酚等功效成分，可以提高枸杞的生物活性，保留了枸杞的多糖、黃酮等有效成分，資源利用率達(dá)到55%以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝流程圖;

圖2為多糖提取率溫度單因素實(shí)驗(yàn)圖;

圖3為多糖提取率料液比單因素實(shí)驗(yàn)圖;

圖4為多糖提取率提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，如圖1所示，包括以下步驟：

A1、將枸杞干果在60℃條件下烘干，再將其粉碎過50目篩，同時(shí)準(zhǔn)備黃酒酵母菌種。

本發(fā)明A1中黃酒酵母菌種的制作方法包括以下步驟：

A11、YPD培養(yǎng)基的配制。

A12、挑取黃酒酵母單菌落接菌于YPD培養(yǎng)基中，并將混入有黃酒酵母單菌的YPD培養(yǎng)基放入28℃的空氣搖床中，180r/min，培養(yǎng)48小時(shí)之后即得。

本發(fā)明A11中YPD培養(yǎng)基的配制方法為稱取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析純葡萄糖，加水定容至1000mL，分裝置500mL的錐形瓶中各100mL，121℃高溫高壓滅菌15min制得。

A2、將一定量的枸杞干果粉原料投入提取罐內(nèi)，加入40倍原料量的去離子水和5%黃酒酵母菌種，加熱攪拌升溫至28℃，保溫?cái)嚢杼崛?6小時(shí)。

A3、對保溫?cái)嚢韬蟮囊后w進(jìn)行過濾，以得到上清液，濾渣再次用5倍量的水與黃酒酵母分別提取兩次，方法相同。

本發(fā)明A3中的過濾采用板框進(jìn)行，板框由濾板和濾框交替疊合構(gòu)成，在板與框之間設(shè)置有壓濾布。

A4、濾液用真空泵抽到單效濃縮器中（濾液以裝滿容器體積的2/3為宜），在溫度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽壓力0.2MPa條件下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮到至固形物為50-55%左右。

A5、加入4倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉兩次，再經(jīng)過離心、乙醚洗滌、粉碎和噴霧干燥，最后通過80目篩，得枸杞多糖。

本發(fā)明A1和A5中粉碎均采用型號為ZN-04B的小型粉碎機(jī)，A5中的離心采用低速大容量臺式離心機(jī)。

該微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝是通過以下步驟優(yōu)化而來：

S1、利用單因素實(shí)驗(yàn)先后采集溫度對枸杞多糖提取率的影響工藝參數(shù)、料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數(shù)和提取時(shí)間對枸杞多糖提取率的影響工藝參數(shù)，每個(gè)因素做三個(gè)平行。

S1中溫度對枸杞多糖提取率的影響工藝參數(shù)的采集方法為稱取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去離子水，配制料液比為1:50，分別于26℃、28℃、30℃、32℃空氣搖床內(nèi)，180r/min，發(fā)酵48h后取出，離心取上清液，測定計(jì)算多糖提取率，每個(gè)因素做三個(gè)平行，具體請見圖2：

由圖可見，枸杞多糖提取率在28℃之前隨著溫度的升高而顯著升高，28℃之后隨著溫度的升高而顯著下降，過高的溫度會對酵母的活性有抑制作用，故溫度選在26℃-30℃為宜。

S1中料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數(shù)的采集方法為稱取3.6g、4.5g、6g、9g干燥的枸杞粉末，分別加入180mL去離子水（即料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50），于28℃空氣搖床內(nèi)，180r/min，發(fā)酵48h后取出，離心取上清，測定計(jì)算多糖提取率，每個(gè)因素做三個(gè)平行，具體請見圖3：

由圖可見，枸杞多糖的提取率隨著料液比的先顯著增高后顯著下降，在1:40達(dá)到最大提取率，料液比為1:40之后開始顯著下降的原因可能是隨著料液比的增大，發(fā)酵底物中菌和酶的濃度較小，使多糖的提取率降低。故料液比應(yīng)選取1:30-1:50為宜。

S1中料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數(shù)的采集方法為稱取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去離子水，配制料液比為1:40，于28℃空氣搖床內(nèi)，180r/min，分別發(fā)酵36h、48h、60h、72h后取出，離心取上清，測定計(jì)算多糖提取率，每個(gè)因素做三個(gè)平行，具體請見圖4：

有圖可知，在微生物提取時(shí)間為48h時(shí)，枸杞多糖的提取率最大， 48h之后隨著時(shí)間的增加，提取率開始顯著下降，時(shí)間取36h-60h為宜。

S2、在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9正交實(shí)驗(yàn)，按照正交實(shí)現(xiàn)確定的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，做出三個(gè)平行，具體請見下表：

由圖可知，三個(gè)因素對于枸杞多糖提取率影響大小為C>A>B，即料液比>發(fā)酵溫度>時(shí)間，根據(jù)顯著性分析可得，料液比和溫度對微生物法提取枸杞多糖影響顯著（P<0.05），時(shí)間對微生物法提取枸杞多糖影響不顯著。由圖微生物法提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得最佳提取工藝為A2B1C2，提取率為2.74%，所以微生物法產(chǎn)表面活性劑提取枸杞多糖的最佳工藝為發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間為36h、料液比為1:40。

S3、通過觀察實(shí)驗(yàn)記錄表，取得最佳工藝，并制定微生物法提取枸杞多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝。

該優(yōu)化步驟以枸杞作為實(shí)驗(yàn)材料，枸杞多糖的提取率作為考察目標(biāo)，通過酵母產(chǎn)槐糖脂、表面活性素、甘露糖蛋白和熱水法提取枸杞多糖，選取影響枸杞多糖提取率的主要因素，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定表面活性劑法和熱水法提取枸杞多糖的最優(yōu)工藝條件，對比表面活性劑法和熱水法提取枸杞多糖的提取率，評價(jià)利用酵母產(chǎn)表面劑提取枸杞多糖的可行性和優(yōu)越性

綜上所述，本發(fā)明通過黃酒酵母菌種和去離子水的配合，有利用了微生物法提取枸杞多糖，降低了提取所消耗的時(shí)間，提取速度快，適用性強(qiáng)，可靠性高。

同時(shí)，本發(fā)明有效的利用了板框?qū)Ρ財(cái)嚢韬蟮囊后w進(jìn)行過濾，并且板框由濾板和濾框交替疊合構(gòu)成，在板與框之間設(shè)置有壓濾布，過濾面積大，占地面積小，過濾效果高，結(jié)構(gòu)簡單，便于攜帶。

其次，本發(fā)明通過無水乙醇對固定物含量50-55%的濾液進(jìn)行醇沉，再經(jīng)過低速大容量臺式離心機(jī)進(jìn)行離心、乙醚洗滌保證了提取后的枸杞多糖干凈度，提取質(zhì)量高。

需要說明的是，在本文中，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個(gè)……限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。