技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種金針菇多糖及其制備方法。

背景技術(shù)：

金針菇又名樸菇、冬菇、構(gòu)菌和金錢菌等，是目前人工栽培最為廣泛的食用菌之一，其產(chǎn)量已位居世界前三。大量研究表明，金針菇主要的功能成分是金針菇多糖，其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、降血壓、改善記憶、抗炎癥、抗病毒、抑菌以及抗氧化等多種功能活性。金針菇多糖是一個以葡聚糖為主，由數(shù)個多糖組分構(gòu)成的混合多糖，不同的提取分離方法得到的金針菇多糖，其分子量、單糖組成等分子結(jié)構(gòu)特征有所不同，具有的生物功能活性也各有差異。現(xiàn)有技術(shù)中粗多糖由于其成分復(fù)雜，其中含有蛋白類、色素、小分子可溶性物質(zhì)等，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量難以控制。因此需要進一步純化處理，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)確定其生物功能。

新城疫是由新城疫病毒引起的一種禽類的高度接觸性、傳染性和致死性疾病。近年來，國內(nèi)外多個實驗室的研究結(jié)果表明，由于NDV只有一個血清型，常用的疫苗株能對不同基因型的流行株攻擊提供較好的臨床保護，但雞群中流行株的帶毒率和病毒載量較高，這是免疫雞群仍發(fā)生非典型新城疫的主要原因。一些細胞因子雖然有一定療效，但由于其價格昂貴，很難在畜禽業(yè)中推廣應(yīng)用。因此，尋找安全有效的新型抗新城疫獸藥一直是獸醫(yī)領(lǐng)域研究的熱點。

CN201210219695公開了一種通過采用超聲波提取金針菇多糖的方法，披露了金針菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，但是僅通過實驗對體外活性進行了評價，其在體內(nèi)的活性評價并沒有涉及；CN201410599264公開了一種通過水煮醇沉的方式提高金針菇多糖純度的方法，但是通過該方法提取出的多糖，其組分及生物應(yīng)用不能確定，得到的多糖不是純品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可以從金針菇中提取高純度均一多糖的方法，該方法保證了多糖得率與活性之間的一致性，確保了提純后的金針菇多糖的組分與含量。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種金針菇多糖的制備方法，包括熱水提取、乙醇沉淀、離子交換柱層析、凝膠柱層析，具體步驟如下：

（1）脫脂：取金針菇子實體，將其置于50-60℃鼓風(fēng)中干燥至恒重，粉碎干燥后的金針菇子實體，按料液比1:8-1:10加入95%乙醇，室溫下充分浸泡24小時，過濾去除脂類；

（2）將步驟（1）重復(fù)兩次；

（3）熱水提?。菏占瘹堅?，在室溫下干燥，按料液比1:15-1:20加入蒸餾水后充分浸泡20-30min，于90-120℃下反應(yīng)1-2小時，過濾，收集濾液；

（4）重復(fù)步驟（3）兩次，合并三次反應(yīng)的濾液；

（5）乙醇沉淀：將濾液進行濃縮，然后添加無水乙醇至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達到60%，充分?jǐn)噭蚝笥?-20℃下靜置8-12小時，離心，收集沉淀物；

（6）將沉淀物用5-10倍蒸餾水溶解后，水浴揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得金針菇粗多糖；

（7）離子交換柱層析：將凍干金針菇粗多糖樣品溶于蒸餾水中，離心后取上清液，將上清液進行DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析；

（8）凝膠柱層析：將離子柱層析得到的金針菇粗多糖組分配成樣品液，離心，經(jīng)SephacrylS-300柱層析后得到金針菇多糖。

進一步的，制備得到的金針菇多糖包括四種組分，包括半乳糖、甘露糖、巖藻糖和葡萄糖四種單糖，其摩爾質(zhì)量比為2.6:1.4:1.1:1，金針菇多糖可以抑制新城疫病毒，具有免疫調(diào)節(jié)活性。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明提供的制備金針菇多糖的方法，引入了凝膠柱層析方法，通過分離純化制備得到高純度均一金針菇多糖，其一級分子結(jié)構(gòu)確定，多糖重均分子量為1.8×104 Da，單糖組成為半乳糖、甘露糖、巖藻糖和葡萄糖，四種單糖的摩爾質(zhì)量比為2.6:1.4:1.1:1，通過研究發(fā)現(xiàn)，該金針菇多糖具有抑制新城疫病毒的作用，并且可以在一定程度上提高動物的免疫能力。

2、本發(fā)明分離純化獲得的多糖，其組分與占比確定，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，與粗多糖相比，雜質(zhì)較少，不易引起動物的過敏反應(yīng)，因而安全性更高，同時其對抗新城疫病毒功效不減，更有利于在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為金針菇多糖對巨噬細胞釋放NO的影響；

圖2為新城疫病毒與金針菇多糖同時添加抗病毒活性檢測結(jié)果。

具體實施方式

下列實施例中使用的主要材料的來源如下：

1. 金針菇子實體購于上海雪榕生物科技股份有限公司，

2. RAW264.7骨髓巨噬細胞株購自美國國家菌種保藏中心（ATCC number TIB-71TM），

3. 5日齡小雞購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，

4. 小雞飼料購自廣州市番禺區(qū)大川飼料有限公司，

5. 新城疫強毒Lasota株保存于廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，病毒TCID50為10-6.33/0.1mL，

6. 9-10日齡雞胚購自梅里亞動物保健有限公司，為NDV非免雞胚，

7. DMEM、RPMI1640購于GIBCO公司，

8. DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱，

9. Sephacryl S-300柱。

實施例1：

金針菇多糖的制備，包括以下步驟：

（1）脫脂：取金針菇子實體，將其置于60℃鼓風(fēng)中干燥至恒重，粉碎干燥后的金針菇子實體，按料液比1:8（W/V）加入95%乙醇，室溫下充分浸泡24小時，過濾去除脂類；

（2）將步驟（1）重復(fù)兩次；

（3）水提：收集殘渣，在室溫下干燥，按料液比1:20（W/V）加入蒸餾水后充分浸泡，于100℃下反應(yīng)1小時，過濾，收集濾液；

（4）重復(fù)步驟（3）兩次，合并三次反應(yīng)的濾液；

（5）將濾液進行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達到60%，充分?jǐn)噭蚝笾糜陉帥鱿?，靜置10小時，離心，收集沉淀物；

（6）將沉淀物用5倍蒸餾水溶解后，水浴揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得金針菇粗多糖；

（7）取1g凍干金針菇粗多糖溶于100mL蒸餾水中，12000 rpm離心15min，取50mL上清液進行DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析，其中：蒸餾水與0-2 mol/L NaCl梯度洗脫，流速為10mL/min，每管收集15mL，逐管苯酚-硫酸法檢測，得到金針菇粗多糖組分；

（8）將離子柱層析得到的FVP60A組分配成10mg/mL樣品液，12000rpm離心5min，經(jīng)Sephacryl S-300柱層析分別得到提純后的金針菇多糖。

實驗結(jié)果：得到12.38mg金針菇多糖純品，其結(jié)構(gòu)為

，

經(jīng)離子色譜測定其分子量為1.8×104Da，經(jīng)離子色譜檢測發(fā)現(xiàn)其由半乳糖，甘露糖、巖藻糖和葡萄糖四種單糖組成，摩爾質(zhì)量比例為2.6:1.4:1.1:1。

實施例2：

供試樣品的配制

精確稱取實施例1制備的金針菇粗多糖和金針菇多糖樣品于滅菌的eppendorf管中，用PBS緩沖液配置成濃度5mg/mL的溶液，充分溶解后以12000 rpm/min離心30min，無菌條件下轉(zhuǎn)移至新的無菌eppendorf管中，將樣品稀釋成50、200和500μg/mL待用。陰性對照為PBS緩沖液，陽性對照為10μg/mL LPS溶液。

小鼠RAW264.7巨噬細胞的制備

用DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO₂條件下傳代培養(yǎng)后，用0.25%胰蛋白酶消化，混懸液300g離心3min后收集細胞，用無色RPMI1640培養(yǎng)基將細胞稀釋到一定濃度備用。

巨噬細胞釋放NO活性的測定

由于NO極不穩(wěn)定，在體內(nèi)很快生成亞硝酸基（NO2^-）和硝酸基（NO3^-），故采用Griess法測定樣品中的NO2^- / NO3^-作為衡量NO水平的指標(biāo)。

（1）用亞硝酸鈉制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共9個濃度梯度；取100μL于96孔板，加入50μL Griess試劑，測定543nm吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線每個濃度3個重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）NO產(chǎn)量測定

巨噬細胞的培養(yǎng)液消化完畢后用無色RPMI1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%抗生素液體)將細胞稀釋至5×105/ml，每孔180μL加入96孔板，然后再加入20μL各濃度待測樣品和陰性（PBS）、陽性（LPS，10μg/mL）對照，于37℃、含5%的CO2條件下培養(yǎng)48h后，取100μL培養(yǎng)上清于96孔板，加入50μL Griess試劑，顯色10min后，于波長543nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的NO量。

實驗結(jié)果：

金針菇粗多糖在各濃度均不能引起RAW264.7NO釋放增加：在濃度50μg/mL時，刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO的量（單位：μmoL/5.0×105cells）為4.84；在濃度200μg/mL時，產(chǎn)生NO量為4.41；在濃度500μg/mL時，產(chǎn)生NO量為5.17；

金針菇多糖純品在濃度50μg/mL時，刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO的量（單位：μmoL/5.0×105cells）為7.48；在濃度200μg/mL時，產(chǎn)生NO量為12.83；在濃度500μg/mL時，產(chǎn)生NO量為32.94，陰性對照為5.61，陽性對照（濃度1μg/mL）27.69，樣品組顯著高于陰性對照活性（P<0.05），金針菇多糖純品在500μg/mL時活性高于陽性對照LPS，表現(xiàn)出良好的刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO活性。

實施例3

成纖維雞胚細胞制備

取9-10日齡發(fā)育良好的雞胚用碘酒和酒精棉球消毒，無菌操作下取出雞胚放于滅菌平皿中，除去雞胚頭、四肢及內(nèi)臟，用PBS液沖洗雞胚3次。將清洗后的雞胚移入無菌的100mL小燒杯中，用眼科剪剪成1mm³的組織快，近于乳糜狀。先用PBS液洗3次，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加入PBS液，轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶中，靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層PBS液，向細胞培養(yǎng)瓶組織塊內(nèi)加入0.25%的胰蛋白酶溶液5mL，胰蛋白酶溶液與雞胚組織量之比為4-5:1，將帶有組織小塊的細胞培養(yǎng)瓶置37℃水浴中消化30分鐘。每10分鐘輕輕搖動一次，使細胞消化均勻。隨時觀察被消化細胞，當(dāng)組織快變得疏松、表面發(fā)毛時中止消化。吸出上層消化液，用5mL的PBS液輕輕加入并混勻，靜置幾分鐘后，吸棄上層液體，反復(fù)洗滌2-3次。加入3mL的5%胎牛血清營養(yǎng)液，用大口吸管反復(fù)吹打數(shù)次。靜置片刻，吸上層細胞懸液經(jīng)有紗布的漏斗過濾入另一細胞培養(yǎng)瓶中，先吸去少量營養(yǎng)液蘸濕紗布，以免細胞吸附在紗布上。再加入2-3mL營養(yǎng)液充分吹打，直至形成均勻的細胞懸液，準(zhǔn)備細胞計數(shù)。取上述細胞懸液0.5mL加入0.1%即0.1mol/L的結(jié)晶紫—檸檬酸溶液2mL，置室溫或37℃培養(yǎng)箱中5-10min，充分振動混合后，用毛細管或吸血管吸取，滴入血細胞計數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下計數(shù)。按細胞計數(shù)結(jié)果將細胞懸液用營養(yǎng)液進一步稀釋成50萬個細胞/mL的細胞懸液。將細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶，分裝量為瓶容量的1/10，塞緊瓶塞，寫上培養(yǎng)日期，細胞名稱、姓名。輕輕搖動培養(yǎng)瓶使細胞均勻，然后靜置放好，不再搖動。放入5% CO₂、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

金針菇多糖對NDV的抑制作用實驗：

取對數(shù)生長期的雞成纖維細胞接種到 96孔細胞培養(yǎng)板，加入用DMEM培養(yǎng)基稀釋的金針菇多糖，將每種含量的多糖配成濃度分別為15.63ug/mL、7.81ug/mL、3.91ug/mL和1.95ug/mL的溶液，同時設(shè)置DMEM培養(yǎng)基溶劑為對照。將不同濃度的多糖分別用0.22um濾膜過濾除菌，每組添加各濃度多糖和100 TCID₅₀的病毒液（200uL/孔）；另外設(shè)無細胞孔僅加維持液做為檢測調(diào)零孔。每組以加入病毒液后開始計算作用時間，每天觀察一次CPE變化，并對細胞進行拍照和MTT法檢測OD₄₉₀值。

表1. 新城疫病毒與金針菇多糖同時添加組的雞成纖維細胞OD值

實驗結(jié)果：如圖2和表1所示，中低濃度的金針菇多糖抗病毒活性并不明顯，而當(dāng)多糖濃度達到15.63ug/mL時，病毒感染的雞成纖維細胞活力出現(xiàn)上升，因而此研究表明提純后的金針菇多糖對雞成纖維細胞起到保護作用，即對新城疫病毒起到一定的抑制作用。

實施例4

金針菇多糖對雞體內(nèi)免疫功能及生長性能的影響

試驗前，將60只小雞隨機分組，并對各組雞稱重，高濃度多糖組和低濃度多糖組的雞自由采食、飲水，飼喂周期為30天，并做好養(yǎng)殖場衛(wèi)生。

試驗雞在飼喂30日齡進行空腹稱重。記錄各組雞的健康狀況和采食量，并計算平均日采食量(ADFI)、平均體重(BW)、平均日增重(ADG)和料肉比(F/M)。

料肉比=消耗飼料總量(KG)/增重總量(KG)，測定增重一公斤所消耗的飼料量；免疫器官指數(shù)（%）=免疫器官重量（g）×100/活體重（g）。

記錄30天小雞采食飼料總重量，每組隨機抽取20只雞稱重，并取其脾臟、胸腺、法氏囊，剔除脂肪后稱鮮重。

表2 金針菇多糖飼料對雞生長性能的影響(飼喂30天)

實驗結(jié)果：由表2可知，30日齡時，與對照組相比，低濃度組和高濃度組平均體重分別升高了3.7%和7.73%；與對照組相比，低濃度組和高濃度組肉雞的平均日采食量分別提高了2.68%和14.15%；與對照組相比，低濃度組和高濃度組平均日增重分別提高了2.53%和14.61%；與對照組相比，低濃度和高濃度平均料肉比分別提高了2.02%和4.55%。

表3 金針菇多糖飼料對雞免疫器官指數(shù)影響單位：%

由表3可知，與對照組相比，肉雞在30日齡時，100mg/kg和400mg/kg金針菇均能引起脾臟指數(shù)分別上升3.7%和7.73%，引起胸腺指數(shù)上升1.58%和3.76%，還能引起法氏囊指數(shù)上升4.29%和12.37%。

通過金針菇多糖對雞體內(nèi)免疫功能及生長性能的影響試驗可以得出，與空白對照組相比，金針菇多糖可以明顯提高肉雞的體重、采食量、日增重和料肉比，同時還能促進肉雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)上升，以上研究結(jié)果表明金針菇多糖可以在一定程度上提高肉雞的免疫功能。