專利名稱：一種提高金針菇多糖抗氧化活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金針菇深加工技術(shù)，具體涉及提高金針菇多糖抗氧化活性的方法。
背景技術(shù)：
金針菇是世界上著名的食用菌、藥用菌和觀賞菌，是僅次于蘑菇、香菇，而屬于第3位的食用菌。目前，金針菇已被廣泛應(yīng)用于食品、調(diào)味品以及保健品行業(yè)中。多糖是金針菇中重要的生物活性物質(zhì)，相關(guān)研究表明，金針菇多糖是一類主要以β-α，3)糖苷鍵連接的葡聚糖，具有抑制腫瘤、抗癌、降血糖、降血脂和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。目前，金針菇多糖已被開發(fā)應(yīng)用于功能性食品、生物醫(yī)藥、飼料等方面。如華南理工大學(xué)(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00610036622.5)公開了一種具有提高全身免疫機(jī)能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖功效的高活性金針菇多糖-肽-Fe2+鰲合物；天圣制藥集團(tuán)股份有限公司(中國專利申請(qǐng)?zhí)?01010042031)公開了一種具有促進(jìn)智力發(fā)育、提高記憶力的含金針菇多糖和香菇多糖的雙菇多糖配制品及其制法和用途；王星麗(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00910001855)公開了一種具有降血脂、減肥美體的金針菇多糖保健膠囊；鞍山保健飲品制造公司(中國專利申請(qǐng)?zhí)?992109861)公開了一種具有激發(fā)智力潛能、提高記憶力 的金針口服液和制法及用途。北京琥珀光華醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00610057191.0)公開了一種用于治療多種疾病，并具有免疫調(diào)節(jié)功能，以及明顯抗肝癌、抗肝炎作用的以金針菇多糖為活性成分的藥物組合物注射制劑。張永亮(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00910192559)公開了一種可以提高動(dòng)物的抗病能力、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的復(fù)合多糖飼料添加劑。雖然金針菇多糖具有多種保健功效，但目前因其提取率低、活性低而限制了其應(yīng)用。因此如何提高金針菇多糖的提取率，提高其活性是其大規(guī)模應(yīng)用的前提。目前公開的專利文獻(xiàn)中主要是采用液體深層培養(yǎng)法制備金針菇多糖。如南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00810155913)公開了一種包括斜面菌種活化、搖瓶種子培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、超濾膜分離并濃縮、醇沉等步驟制備金針菇多糖的方法；江蘇省江大綠康生物工程技術(shù)研究有限公司(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00710131811)公開了一種深層液體發(fā)酵法生產(chǎn)富硒金針菇粗多糖原粉的方法。以上方法制備的金針菇多糖不僅得率低，活性低，而且工序復(fù)雜，操作繁瑣且不可控。因此，本發(fā)明公開一種通過控制酶解法調(diào)控金針菇多糖分子量分布的制備方法，以達(dá)到提高其多糖得率和抗氧化活性的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過控制酶解法調(diào)控金針菇多糖分子量分布，以提高其多糖提取率和抗氧化活性的制備方法，填補(bǔ)目前國內(nèi)外關(guān)于應(yīng)用酶解法調(diào)控多糖分子量分布提聞其功效的技術(shù)空白。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種提高金針菇多糖抗氧化活性的方法，其包括如下步驟:
(O金針菇洗凈，晾干后粉碎得金針菇干；(2)在金針菇干中加入3-6倍質(zhì)量的95%乙醇，加熱使液體微沸，回流2-4小時(shí)；除雜、過濾，除醇，取濾渣，得金針菇粉；
(3)在金針菇粉中加入20-30倍質(zhì)量的蒸餾水，于90-100°C下提取1-3小時(shí)，過濾，重復(fù)提取2次，分離金針菇渣得提取液；
(4)在提取液中加入Sevag試劑，劇烈振蕩30-60分鐘，然后靜置10分鐘，離心，重復(fù)除蛋白3-8次得到脫蛋白的提取液；
(5)將脫蛋白的提取液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/7 1/3，得濃縮液；加入乙醇，混合均勻后，在0-4°C下靜置6-12小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得金針菇粗多糖；
(6)在金針菇粗多糖中加入水解酶，在45-60°C下水解2-6小時(shí)，沸水浴滅酶15分鐘，離心，過濾，冷凍干燥，得金針菇精制多糖。上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，步驟(I)所述金針菇粉碎為粉碎至20-80 目。上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，步驟(4)所述Sevag試劑的加量為提取液體積的3-5倍。上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，步驟(5)所述乙醇添加量滿足混合均勻后乙醇最終濃度為70-85% (v/v)0上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，步驟(6)所述水解酶為果膠酶、木瓜蛋白酶、胰酶中的一種。上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，步驟(6)所述水解酶的添加量為1000-3000U/100g。上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，步驟(6)獲得的金針菇精制多糖分子量為 19000-30000Da。上述提高金針菇多糖抗氧化活性的方法中，所述Sevag試劑中氯仿與丁醇的體積比為5:1。本發(fā)明采用了以上技術(shù)方案，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:1、本發(fā)明提供了一種通過控制酶解法調(diào)控金針菇多糖分子量分布，以提高其多糖提取率和抗氧化活性的制備方法，填補(bǔ)目前國內(nèi)外關(guān)于應(yīng)用酶解法調(diào)控多糖分子量分布提高其功效的技術(shù)空白。2、本制備方法實(shí)現(xiàn)了金針菇多糖分子量分布的可控性，可有效降低金針菇多糖的分子量，增加溶解性，使其在體內(nèi)更易被吸收，更有效地發(fā)揮功效，應(yīng)用范圍更廣。3、通過本方法所制備的金針菇多糖，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，所得多糖提取率比傳統(tǒng)水提法提高2.5-3.5倍，且具有明顯的抗氧化活性。在DPPH.自由基體系中，金針菇多糖的IC50 為1.69-2.12mg/mL, 同時(shí) ORAC 值最高達(dá) 923 μ molTrolox/g。


圖1a 圖1c為實(shí)施例1、2、3中所制備的金針菇多糖的分子量分布圖。圖2為實(shí)施例1、2、3中所制備的金針菇多糖的提取率結(jié)果圖。圖3為實(shí)施例1、2、3中所制備的金針菇多糖對(duì)DPPH自由基清除活性結(jié)果圖。圖4為實(shí)施例1、2、3中所制備的金針菇多糖ORAC值結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
(I)金針菇洗凈，晾干后粉碎至60目，得提取原料。(2)在金針菇干中加入3倍95%乙醇，加熱使液體微沸，回流2小時(shí)。除雜、過濾，除醇，取濾渣，得金針菇粉。(3)在提取原料中加入20倍蒸餾水，于90°C下提取I小時(shí)，過濾，重復(fù)提取I次，
分離金針菇渣得提取液。(4)在提取液中加入3倍Sevag試劑(氯仿:丁醇=5:1)以除去蛋白，劇烈振蕩30分鐘，然后靜置10分鐘，離心，重復(fù)除蛋白3次。(5)將提取液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/7，得濃縮液。然后加入乙醇，使乙醇最終濃度為80% (v/v)，混合均勻后，在0-4°C下靜置6小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得金針菇粗多糖。(6)在金針菇多糖中加入果膠酶1000U/100g，在45°C下水解4小時(shí)，沸水浴滅酶15分鐘，離心，過濾，冷凍干燥，得金針菇精制多糖。測(cè)定所得金針菇多糖的分子量分布、提取率、DPPH自由基清除活性、ORAC值。實(shí)施例2
(I)金針菇洗凈，晾干后粉碎至80目，得提取原料。(2)在金針菇干中加入5倍95%乙醇，加熱使液體微沸，回流3小時(shí)。除雜、過濾，除醇，取濾渣，得金針菇粉。(3)在提取原料中加入25倍蒸餾水，于95°C下提取2小時(shí)，過濾，重復(fù)提取I次，分離金針菇渣得提取液。(4)在提取液中加入4倍Sevag試劑(氯仿:丁醇=5:1)以除去蛋白，劇烈振蕩45分鐘，然后靜置10分鐘，離心，重復(fù)除蛋白3次。(5)將提取液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/5，得濃縮液。然后加入乙醇，使乙醇最終濃度為75% (v/v)，混合均勻后，在0-4°C下靜置10小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得金針菇粗多糖。(6)在金針菇多糖中加入木瓜蛋白酶2000U/100g，在50°C下水解3小時(shí)，沸水浴滅酶15分鐘，離心，過濾，冷凍干燥，得金針菇精制多糖。測(cè)定所得金針菇多糖的分子量分布、提取率、DPPH自由基清除活性、ORAC值。實(shí)施例3
(I)金針菇洗凈，晾干后粉碎至60目，得提取原料。(2)在金針菇干中加入6倍95%乙醇，加熱使液體微沸，回流4小時(shí)。除雜、過濾，除醇，取濾渣，得金針菇粉。(3)在提取原料中 加入30倍蒸餾水，于100°C下提取3小時(shí)，過濾，重復(fù)提取I次，分離金針菇渣得提取液。(4)在提取液中加入5倍Sevag試劑(氯仿:丁醇=5:1)以除去蛋白，劇烈振蕩60分鐘，然后靜置10分鐘，離心，重復(fù)除蛋白3次。(5)將提取液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/3，得濃縮液。然后加入乙醇，使乙醇最終濃度為85% (v/v)，混合均勻后，在0-4°C下靜置12小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得金針菇粗多糖。(6)在金針菇多糖中加入胰酶3000U/100g，在60°C下水解6小時(shí)，沸水浴滅酶15分鐘，離心，過濾，冷凍干燥，得金針菇精制多糖。測(cè)定所得金針菇多糖的分子量分布、提取率、DPPH自由基清除活性、ORAC值。
圖la、圖lb、圖1c分別為實(shí)施例1、2、3所得金針菇的分子量分布圖。從圖中可以看出，所得金針菇多糖的分子量分布控制在19000-30000Da之間。圖2為實(shí)施例1、2、3所得金針菇多糖的提取率結(jié)果圖。從圖中可以看出，與傳統(tǒng)水提法相比，采用本發(fā)明的制備方法可以提高金針菇多糖的提取率2.8-3.2倍。圖3為實(shí)施例1、2、3所得金針菇多糖的DPPH自由基清除活性結(jié)果圖。從圖中可以看出，采用本發(fā)明的制備方法可以提高金針菇多糖的DPPH自由基清除活性1.8-2.3倍。圖4為實(shí)施例1、2、3所得金針菇多糖的ORAC值結(jié)果圖。從圖中可以看出，采用本發(fā)明的制備方法可以提高金針菇多糖的氧`化自由基吸收能力2.5-2.8倍。
權(quán)利要求
1.一種提高金針菇多糖抗氧化活性的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)金針菇洗凈，晾干后粉碎得金針菇干； (2)在金針菇干中加入3-6倍質(zhì)量的95%乙醇，加熱使液體微沸，回流2-4小時(shí)；除雜、過濾，除醇，取濾渣，得金針菇粉； (3)在金針菇粉中加入20-30倍質(zhì)量的蒸餾水，于90-100°C下提取1-3小時(shí)，過濾，重復(fù)提取2次，分離金針菇渣得提取液； (4)在提取液中加入Sevag試劑，劇烈振蕩30-60分鐘，然后靜置10分鐘，離心，重復(fù)除蛋白3-8次得到脫蛋白的提取液； (5)將脫蛋白的提取液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/7 1/3，得濃縮液；加入乙醇，混合均勻后，在0-4°C下靜置6-12小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得金針菇粗多糖； (6)在金針菇粗多糖中加入水解酶，在45-60°C下水解2-6小時(shí)，沸水浴滅酶15分鐘，離心，過濾，冷凍干燥，得金針菇精制多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述金針菇粉碎為粉碎至20-80目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)所述Sevag試劑的加量為提取液體積的3-5倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)所述乙醇添加量滿足混合均勻后乙醇最終濃度為70-85% (v/v)0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(6)所述水解酶為果膠酶、木瓜蛋白酶、胰酶中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(6)所述水解酶的添加量為1000-3000U/100g。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(6)獲得的金針菇精制多糖分子量為19000-30000Da。
8.根據(jù)權(quán)利要求Γ7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述Sevag試劑中氯仿與丁醇的體積比為5:1。
全文摘要
本發(fā)明公開一種提高金針菇多糖抗氧化活性的制備方法。本發(fā)明采用控制酶解法來調(diào)控金針菇多糖的分子量分布，金針菇粉碎后，通過除雜、熱水浸提、除蛋白、濃縮和乙醇分級(jí)沉淀分離獲得金針菇多糖，再用酶法進(jìn)行控制降解以使金針菇多糖的分子量降到19000-30000Da。采用此法所制備的金針菇多糖，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，所得多糖提取率比傳統(tǒng)水提法提高2.5-3.5倍，且具有明顯的抗氧化活性。在DPPH·自由基體系中，金針菇多糖的IC50為1.69-2.12mg/mL，同時(shí)ORAC值最高達(dá)923μmolTrolox/g。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103073648SQ20121033324
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者游麗君, 趙謀明, 崔春, 劉鈞發(fā), 馮夢(mèng)瑩, 任嬌艷 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)