本發(fā)明屬于碳納米材料領(lǐng)域，涉及一種富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的制備方法。

背景技術(shù)：

以“明星分子”C₆₀為典型代表的疏水性富勒烯材料可被特定親水試劑經(jīng)化學(xué)修飾成水溶性衍生物，如：富勒烯與羥基化試劑作用生成富勒醇；經(jīng)Bingle-Hirsch反應(yīng)生成水溶性的富勒烯丙二酸多加成衍生物；與多種氨基酸反應(yīng)生成富勒烯氨基酸水溶性衍生物。此外，本研究組曾報(bào)道富勒烯在液相溶劑體系中經(jīng)氮賓多加成反應(yīng)生成富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利號(hào)：Zl201010522925.4.；He R.et al.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine，2016，12(2)：525-526)。

富勒烯水溶性衍生物作為納米生物材料生物相容性良好，自身具有優(yōu)異的電子順磁共振性能、弱順磁性以及獨(dú)特的結(jié)構(gòu)尺寸和穩(wěn)定的生物效應(yīng)，成為探討納米粒與生物、環(huán)境相互作用產(chǎn)生納米生物效應(yīng)問(wèn)題的模式材料。在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已有文獻(xiàn)展示富勒烯水溶性衍生物具有抗菌活性、抗氧化和清除自由基能力，可作化療法抗腫瘤藥物及用于光動(dòng)力療法殺死癌細(xì)胞；在納米農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，其展現(xiàn)出調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)及提高抗逆性方面的作用。然而，在納米醫(yī)學(xué)及納米農(nóng)業(yè)技術(shù)中有關(guān)富勒烯水溶性衍生物應(yīng)用研究的報(bào)道依然極少，瓶頸就在于缺乏經(jīng)濟(jì)合理大規(guī)模制備具有良好生物相容性的富勒烯水溶性衍生物的方法，而導(dǎo)致無(wú)法提供充足產(chǎn)品應(yīng)用于其納米生物效應(yīng)的研究。

目前，富勒烯可經(jīng)羥基化、氨基酸化、Bingle-Hirsch反應(yīng)及氮賓反應(yīng)制備富勒烯水溶性衍生物，主流的制備方法均是富勒烯溶解于有機(jī)溶劑在液相體系發(fā)生反應(yīng)。例如：富勒醇作為最具代表性的富勒烯水溶性衍生物，典型制備方法就是富勒烯溶解于甲苯在相轉(zhuǎn)移催化劑作用下的NaOH處理法；氨基酸化反應(yīng)是富勒烯溶于甲苯后在堿性條件下與過(guò)量的各種氨基酸反應(yīng)；Bingle-Hirsch反應(yīng)也是富勒烯溶解于甲苯溶液與丙二酸酯衍生物發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)；我們研究組報(bào)道的氮賓反應(yīng)則是富勒烯溶解于鄰二氯苯與親水性疊氮有機(jī)化合物高溫下發(fā)生多加成反應(yīng)。綜上所述，當(dāng)前廣泛制備富勒烯水溶性衍生物的液相反應(yīng)技術(shù)方法，幾乎千篇一律地采用甲苯或鄰二氯苯等有機(jī)溶劑作為溶解富勒烯的反應(yīng)溶劑?？紤]到此二者溶解富勒烯能力較低(如：常溫下甲苯、鄰二氯苯分別能溶解C₆₀為2.8、27mg/mL，RuoffR.et al.Journal of Physical Chemistry,1993,97:3379-3383)，當(dāng)開(kāi)展工業(yè)化大規(guī)模制備時(shí)必將消耗巨大體積的甲苯或鄰二氯苯，如此工藝將極大增加大批量生產(chǎn)的操作難度，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)合理大規(guī)模制備水溶化的富勒烯產(chǎn)品。

在富勒烯類(lèi)碳納米材料領(lǐng)域，科研人員一直孜孜追求的目標(biāo)就是通過(guò)更簡(jiǎn)便的制造技術(shù)大規(guī)模獲得新型富勒烯水溶性衍生物。本發(fā)明的目的就是從改進(jìn)富勒烯參與的液相反應(yīng)系統(tǒng)著手，跳出拘泥于不斷尋找高溶解性反應(yīng)溶劑從而優(yōu)化擴(kuò)大反應(yīng)規(guī)模的常規(guī)思路，通過(guò)免添加溶劑策略，利用富勒烯與液態(tài)的疊氮有機(jī)化合物直接發(fā)生氮賓反應(yīng)，發(fā)明出一種在液相體系中便捷地大規(guī)模制備富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種在液相體系中簡(jiǎn)便且能大規(guī)模制備富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的新方法，即免添加有機(jī)溶劑策略的氮賓多加成反應(yīng)法。

本發(fā)明提供了一種富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的制備方法，含如下步驟：

(1)將富勒烯與室溫時(shí)呈液態(tài)的疊氮有機(jī)化合物分別投料于反應(yīng)器，無(wú)需添加有機(jī)溶劑直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌，二者投料的物質(zhì)的量之比為1：50～100；所述疊氮有機(jī)化合物的碳鏈一端鍵聯(lián)親水性官能團(tuán)；

(2)將反應(yīng)體系升溫至回流，保溫12～72小時(shí)后，停止加熱；

(3)蒸除部分未反應(yīng)的疊氮有機(jī)化合物，殘留物經(jīng)有機(jī)溶劑洗滌，進(jìn)一步去除未反應(yīng)物及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生物，然后用水進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾后去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品；

(4)粗產(chǎn)品復(fù)溶于水并使用截留分子量為500-10000道爾頓透析袋透析，干燥得到純凈的富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品。

本發(fā)明所述的富勒烯和疊氮有機(jī)化合物的氮賓多加成反應(yīng)以及產(chǎn)物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，步驟(4)所制得的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物分子以富勒烯碳籠為核心，碳籠通過(guò)氮原子橋聯(lián)多個(gè)親水性側(cè)鏈，每個(gè)側(cè)鏈另一末端鍵聯(lián)有親水性官能團(tuán)，如：-OH、-NH₂，-COOH、-SO₃H，由此保證整個(gè)衍生物分子具備水溶性。疊氮有機(jī)化合物與富勒烯品種可調(diào)控側(cè)鏈數(shù)目的多寡及分布范圍的寬窄。

本發(fā)明步驟(1)所述的富勒烯為分子由60～90個(gè)碳原子組成的具有球狀或類(lèi)球狀結(jié)構(gòu)并含有大量共軛碳碳雙鍵的單質(zhì)中的一種，分子式為C_2n，富勒烯分子中的碳原子數(shù)目?jī)?yōu)選60、70、84或90個(gè)，更優(yōu)選60或70，并以60個(gè)碳原子為最優(yōu)。

本發(fā)明步驟(1)所述的疊氮有機(jī)化合物均可參考現(xiàn)有科技文獻(xiàn)大量制備，優(yōu)選其分子式為N₃(CH₂)_mR或N₃(CH₂)_m-1COOH，其中，R為OH、NH₂或SO₃H，m＝2～6，含2～6個(gè)碳原子的飽和直碳鏈，且碳鏈兩端必須分別鍵聯(lián)疊氮基團(tuán)(-N₃)和親水性官能團(tuán)，如，-OH、-NH₂、-COOH、-SO₃H。優(yōu)選疊氮有機(jī)化合物為2-疊氮基乙醇、2-疊氮基乙胺、2-疊氮基乙基磺酸、2-疊氮基乙酸、3-疊氮基丙酸或6-疊氮基己酸。特別值得注意的是上述疊氮有機(jī)化合物在室溫時(shí)呈液態(tài)，以保證在高溫反應(yīng)過(guò)程中其既作反應(yīng)物，又充作反應(yīng)溶劑。如此，即可通過(guò)免添加有機(jī)溶劑策略，在液相反應(yīng)體系中直接發(fā)生氮賓多加成反應(yīng)，大規(guī)模制備富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物。

本發(fā)明步驟(1)中，疊氮有機(jī)化合物相對(duì)于富勒烯的投料比必須介于指定范圍之內(nèi)，即物質(zhì)的量之比為50～100：1。低于該指定投料比50：1下限時(shí)，隨著反應(yīng)的進(jìn)程，反應(yīng)體系迅速固化使反應(yīng)被迫終止，如此主要獲得加成數(shù)目相對(duì)較少且不具備水溶性的寡加成衍生物，這導(dǎo)致獲得水溶性產(chǎn)品的收率大大降低，將不超過(guò)25％；超過(guò)該指定投料比100：1上限時(shí)，會(huì)大大增加疊氮有機(jī)化合物投料量而加大經(jīng)濟(jì)成本，并且極大增加后續(xù)純化步驟的處理難度及成本；而在指定投料比范圍內(nèi)即可高性?xún)r(jià)比、高收率的獲得富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物。

本發(fā)明所述步驟(3)中，洗滌時(shí)可采用常規(guī)有機(jī)試劑，如：乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等，以便優(yōu)先去除未反應(yīng)的疊氮有機(jī)化合物及加成數(shù)目較少的非水溶性寡加成衍生物。

本發(fā)明還提供了另一種富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的制備方法，含如下步驟：

(a)將富勒烯與室溫時(shí)呈液態(tài)的疊氮有機(jī)化合物分別投料于反應(yīng)器，無(wú)需添加有機(jī)溶劑直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌，二者投料的物質(zhì)的量之比為1：50～100；所述疊氮有機(jī)化合物的碳鏈一端鍵聯(lián)-COOH或-SO₃H；

(b)將反應(yīng)體系升溫至回流，保溫12～72小時(shí)后，停止加熱；

(c)蒸除部分未反應(yīng)的疊氮有機(jī)化合物，殘留物經(jīng)有機(jī)溶劑洗滌，進(jìn)一步去除未反應(yīng)物及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生物，然后用溶劑A進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾后去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品；所述的溶劑A為強(qiáng)親水性溶劑和/或水，所述的強(qiáng)親水性溶劑為甲醇、乙醇、乙酸或乙腈；

(d)將粗產(chǎn)品復(fù)溶于堿性溶液中，并使用截留分子量為500-10000道爾頓透析袋透析，干燥得到純凈的富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品。

本發(fā)明步驟(a)所述的富勒烯為分子由60～90個(gè)碳原子組成的具有球狀或類(lèi)球狀結(jié)構(gòu)并含有大量共軛碳碳雙鍵的單質(zhì)中的一種，分子式為C_2n，富勒烯分子中的碳原子數(shù)目?jī)?yōu)選60、70、84或90個(gè)，更優(yōu)選60或70，并以60個(gè)碳原子為最優(yōu)。

本發(fā)明步驟(a)所述的疊氮有機(jī)化合物均可參考現(xiàn)有科技文獻(xiàn)大量制備，優(yōu)選其分子式為N₃(CH₂)_mSO₃H或N₃(CH₂)_m-1COOH，其中，m＝2～6，含2～6個(gè)碳原子的飽和直碳鏈，且碳鏈兩端必須分別鍵聯(lián)疊氮基團(tuán)(-N₃)和親水性官能團(tuán)-COOH、-SO₃H。優(yōu)選疊氮有機(jī)化合物為2-疊氮基乙基磺酸、2-疊氮基乙酸、3-疊氮基丙酸或6-疊氮基己酸。特別值得注意的是上述疊氮有機(jī)化合物在室溫時(shí)呈液態(tài)，以保證在高溫反應(yīng)過(guò)程中其既作反應(yīng)物，又充作反應(yīng)溶劑。如此，即可通過(guò)免添加有機(jī)溶劑策略，在液相反應(yīng)體系中直接發(fā)生氮賓多加成反應(yīng)，大規(guī)模制備富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物。

本發(fā)明步驟(a)中，疊氮有機(jī)化合物相對(duì)于富勒烯的投料比必須介于指定范圍之內(nèi)，即物質(zhì)的量之比為50～100：1。低于該指定投料比50：1下限時(shí)，隨著反應(yīng)的進(jìn)程，反應(yīng)體系迅速固化使反應(yīng)被迫終止，如此主要獲得加成數(shù)目相對(duì)較少且不具備水溶性的寡加成衍生物，這導(dǎo)致獲得水溶性產(chǎn)品的收率大大降低，將不超過(guò)25％；超過(guò)該指定投料比100：1上限時(shí)，會(huì)大大增加疊氮有機(jī)化合物投料量而加大經(jīng)濟(jì)成本，并且極大增加后續(xù)純化步驟的處理難度及成本；而在指定投料比范圍內(nèi)即可高性?xún)r(jià)比、高收率的獲得富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物。

本發(fā)明所述步驟(c)中，洗滌時(shí)可采用常規(guī)有機(jī)試劑，如：乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等，以便優(yōu)先去除未反應(yīng)的疊氮有機(jī)化合物及加成數(shù)目較少的非水溶性寡加成衍生物。

本發(fā)明所述步驟(c)中，產(chǎn)物的分離純化可采用溶劑提取法，提取所用的溶劑A采用梯度改變強(qiáng)親水性溶劑：水的體積比由100％：0％至0％：100％實(shí)現(xiàn)提取溶劑極性的調(diào)節(jié)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)加成數(shù)目在較窄范圍變化且平均加成數(shù)目由少到多變化的富勒烯多氮雜橋衍生物的相互分離。優(yōu)選溶劑A為乙醇和/或水。

本發(fā)明所述步驟(d)中，堿性溶液優(yōu)選為濃度>0.1mol/L且≤5mol/L的NaOH、KOH或氨水溶液，更優(yōu)選1mol/L的NaOH或KOH溶液。

本發(fā)明步驟(d)所制得的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物分子以富勒烯碳籠為核心，碳籠通過(guò)氮原子橋聯(lián)多個(gè)親水性側(cè)鏈，每個(gè)側(cè)鏈另一末端鍵聯(lián)有親水性官能團(tuán)，如：-COOM、-SO₃M(其中M為Na、K或NH₄)，由此保證整個(gè)衍生物分子具備水溶性。疊氮有機(jī)化合物與富勒烯品種及反應(yīng)后處理中純化時(shí)的提取方式可調(diào)控側(cè)鏈數(shù)目的多寡及分布范圍的寬窄。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

a.本發(fā)明提供的大規(guī)模制備富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物新方法的特點(diǎn)：①合成工藝更簡(jiǎn)便、更高效，合成過(guò)程中操作方法更簡(jiǎn)單；②實(shí)驗(yàn)室條件下，在0.5L反應(yīng)容器內(nèi)就可實(shí)現(xiàn)富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的百克量級(jí)制備，這為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)水溶性富勒烯衍生產(chǎn)品提供出嶄新的工藝路線。

b.本發(fā)明提供的液相反應(yīng)法的反應(yīng)體系采用免添加有機(jī)溶劑策略，相較于以往采用二甲苯、氯苯、鄰二氯苯作反應(yīng)溶劑的反應(yīng)體系其優(yōu)勢(shì)在于：①避免使用高污染的芳烴或鹵代芳烴類(lèi)有機(jī)溶劑溶解反應(yīng)物，使得反應(yīng)體系對(duì)環(huán)境污染影響降低到更小程度；②依據(jù)相似相溶原理，疊氮有機(jī)化合物自身作溶劑的反應(yīng)氛圍有利于形成的富勒烯寡加成衍生物分散于液相反應(yīng)體系，促進(jìn)其繼續(xù)發(fā)生氮賓多加成反應(yīng)，并最終產(chǎn)生更高加成數(shù)目的水溶性衍生產(chǎn)物；③利用同等反應(yīng)容器反應(yīng)時(shí)，免溶劑策略的反應(yīng)規(guī)?？蓴U(kuò)大10倍以上；④此法還適用于液態(tài)的多種加成試劑與富勒烯發(fā)生多加成反應(yīng)大規(guī)模制備其它類(lèi)型的水溶性富勒烯衍生物。

c.本發(fā)明所獲得富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的水相溶解性能優(yōu)異，自身為穩(wěn)定自由基，可作為捕獲其它自由基的納米探針，體外自由基清除實(shí)驗(yàn)展示其清除自由基效果特別顯著，此外，其還可受激發(fā)射熒光，使之在納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和納米農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域中均具有重要的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1.實(shí)施例1中氮雜富勒醇1粉末的FT-IR譜圖。

圖2.實(shí)施例1中氮雜富勒醇1粉末的熱重分析譜圖。

圖3.實(shí)施例1中氮雜富勒醇1的ESR分析譜圖。

圖4.實(shí)施例1中氮雜富勒醇1的熒光激發(fā)譜和發(fā)射譜。

圖5.實(shí)施例9中C₆₀(NCH₂CH₂OH)₁₄水溶液處理ABTS⁺·后清除率與濃度的關(guān)聯(lián)性。

圖6.實(shí)施例9中C₆₀(NCH₂COONa)₁₃水溶液處理ABTS⁺·后清除率與濃度的關(guān)聯(lián)性。

圖7.實(shí)施例10中C₆₀(NCH₂COONa)₁₃處理對(duì)玉米種子萌發(fā)率的影響。

圖8.實(shí)施例10中50μg/ml(左)、5μg/ml(中)、0μg/ml(右)C₆₀(NCH₂COONa)₁₃水溶液處理對(duì)兩葉一心期玉米根系的影響。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍并不限于列舉的實(shí)施例。

實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法；所述試劑和材料均可從商業(yè)途徑獲得。其中，富勒烯C₆₀和C₇₀來(lái)源于河南省濮陽(yáng)市永新富勒烯科技有限公司，純度高于99.9％。所需的含短直碳鏈的親水性疊氮基小分子有機(jī)化合物，如：疊氮乙醇、疊氮乙酸、疊氮乙胺、疊氮己酸等，由疊氮鈉與相應(yīng)的鹵代物參考現(xiàn)有科技文獻(xiàn)制成。

實(shí)施例1：大規(guī)模制備C₆₀與疊氮乙醇的水溶性產(chǎn)物C₆₀(NCH₂CH₂OH)₁₄(氮雜富勒醇1)

(1)將60.0g C₆₀固體粉末與362.8g液態(tài)的2-疊氮基乙醇(物質(zhì)的量投料比為1:50)分別投料于500mL三口反應(yīng)瓶，接冷凝管及機(jī)械攪拌裝置，無(wú)需添加有機(jī)溶劑，直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌；

(2)反應(yīng)體系升溫至回流，保溫72小時(shí)后，停止加熱；

(3)減壓蒸餾去除部分未反應(yīng)的2-疊氮基乙醇，殘留物經(jīng)乙醚、乙酸乙酯反復(fù)洗滌，以便進(jìn)一步去除未反應(yīng)的2-疊氮基乙醇及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生化產(chǎn)物，然后添加去離子水超聲提取多次至上清液無(wú)色后，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品1；

(4)將粗產(chǎn)品1復(fù)溶于去離子水并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋于水相透析，微孔濾膜過(guò)濾，減壓旋蒸干燥，由此精制得到純凈的側(cè)鏈末端含羥基的富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品108.2g，產(chǎn)率84％，標(biāo)記為氮雜富勒醇1。

氮雜富勒醇1的表征信息如下：

圖1所示，紅外光譜在3377cm^-1處的強(qiáng)吸收峰歸屬為O-H伸縮振動(dòng)、1383cm^-1處弱吸收峰歸屬于O-H彎曲振動(dòng)、1059cm^-1歸屬于C-OH伸縮振動(dòng)，此三組吸收峰證明氮雜富勒醇1分子中存在-OH，在2935、2879cm^-1處的弱吸收峰歸屬于C-H對(duì)稱(chēng)與反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，在1641cm^-1處的強(qiáng)吸收峰歸屬于富勒烯碳籠中殘余的C＝C伸縮振動(dòng)，在500-600cm^-1之間的弱吸收寬峰為C₆₀的骨架振動(dòng)吸收。

圖2所示TG-DTG-DSC同步分析結(jié)果表明，氮雜富勒醇1分子在溫度區(qū)間133-695℃百分比質(zhì)量從93.89％減少到44.26％，此區(qū)間減少的百分比質(zhì)量(49.36％)完全歸因于氮雜富勒醇1分子碳籠外接側(cè)鏈基團(tuán)-NCH₂CH₂OH的全部丟失，而695℃時(shí)殘留的質(zhì)量則歸屬于C₆₀碳籠，其中碳籠式量為720，全部外接側(cè)鏈(-NCH₂CH₂OH)的式量為59x，計(jì)算x＝13.68，據(jù)此得氮雜富勒醇1的平均分子式為C₆₀(NCH₂CH₂OH)₁₄。

圖3所示ESR圖譜表明，氮雜富勒醇1粉末在室溫下展現(xiàn)為3270G附近的無(wú)精細(xì)結(jié)構(gòu)的寬峰，相應(yīng)的g因子為2.0018，電子自旋量子數(shù)為S＝1/2。其電子自旋態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道富勒烯衍生物的結(jié)果一致，表明其可作為穩(wěn)定的自由基離子。

圖4所示熒光光譜顯示氮雜富勒醇1在水溶液中能受激產(chǎn)生熒光，這意味著其免標(biāo)記熒光染料自身即可作潛在的納米熒光探針。

上述結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)室條件下在0.5L反應(yīng)容器內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)百克量級(jí)的富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物產(chǎn)品制備。這為大規(guī)模工業(yè)化批量生產(chǎn)水溶性富勒烯衍生產(chǎn)品開(kāi)辟了嶄新的路徑。所制得的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物具有受激發(fā)射熒光性能及良好的電子順磁共振性質(zhì)，應(yīng)用于生物體系可通過(guò)清除諸如活性氧等自由基而展現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能，從而在納米醫(yī)藥領(lǐng)域及在納米農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例2：制備C₆₀與疊氮乙胺的水溶性加成產(chǎn)物C₆₀(NCH₂CH₂NH₂)₁₂(氮雜富勒胺1)

(1)將12.0g C₆₀固體粉末與143.5g液態(tài)的2-疊氮基乙胺(物質(zhì)的量投料比為1:100)分別投料于250mL三口反應(yīng)器，接冷凝管及機(jī)械攪拌裝置，無(wú)需添加有機(jī)溶劑，直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌；

(2)反應(yīng)體系升溫至回流，保溫48小時(shí)后，停止加熱；

(3)減壓蒸餾去除部分未反應(yīng)的2-疊氮基乙胺，殘留物經(jīng)乙醚、乙酸乙酯反復(fù)洗滌，以便進(jìn)一步去除未反應(yīng)的2-疊氮基乙胺及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生化產(chǎn)物，然后添加去離子水超聲提取多次至上清液無(wú)色后，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品2；

(4)將粗產(chǎn)品2復(fù)溶于去離子水并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，干燥，由此精制得到純凈的側(cè)鏈末端含氨基的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品22.4g，產(chǎn)率95％，標(biāo)記為氮雜富勒胺1。熱重分析表征其平均分子式為C₆₀(NCH₂CH₂NH₂)₁₂。

實(shí)施例3：制備C₆₀與疊氮乙酸的富勒烯基聚甘氨酸水溶性衍生物C₆₀(NCH₂COOH)₁₃

(1)將20.0g C₆₀固體粉末與140.4g液態(tài)的2-疊氮基乙酸(物質(zhì)的量投料比為1:100)分別投料于250mL三口反應(yīng)器，接冷凝管及機(jī)械攪拌裝置，無(wú)需添加有機(jī)溶劑，直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌；

(2)反應(yīng)體系升溫至回流，保溫12小時(shí)后，停止加熱；

(3)減壓蒸餾去除部分未反應(yīng)的2-疊氮基乙酸，殘留物經(jīng)乙醚、乙酸乙酯反復(fù)洗滌，以便進(jìn)一步去除未反應(yīng)的2-疊氮基乙酸及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生化產(chǎn)物，然后用去離子水超聲提取多次至上清液無(wú)色，合并提取液，濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品3；

(4)將粗產(chǎn)品3復(fù)溶于去離子水并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，干燥，由此精制得到純凈的側(cè)鏈末端含羧基的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品，產(chǎn)率75％，標(biāo)記為富勒烯基聚甘氨酸水溶性衍生物1。熱重分析表征其平均分子式為C₆₀(NCH₂COOH)₁₃。

實(shí)施例4：制備C₆₀與疊氮乙酸的富勒烯基聚甘氨酸鈉水溶性衍生物

實(shí)施例3的步驟(3)中，經(jīng)去離子水多次超聲提取粗產(chǎn)品3后的殘留物繼續(xù)添加乙醇超聲提取多次至上清液無(wú)色，合并提取液，濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品4；提取粗產(chǎn)品4后的殘留物繼續(xù)添加體積比為50％：50％的乙醇-水的二元溶劑超聲提取多次，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品5。

將粗產(chǎn)品3、粗產(chǎn)品4、粗產(chǎn)品5復(fù)溶于1mol/L NaOH溶液并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，微孔濾膜過(guò)濾，干燥，由此精制得到純凈的含甘氨酸鈉的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品，依次標(biāo)記為富勒烯基聚甘氨酸鈉水溶性衍生物1、富勒烯基聚甘氨酸鈉水溶性衍生物2、富勒烯基聚甘氨酸鈉水溶性衍生物3。熱重分析表征其平均分子式依次為C₆₀(NCH₂COONa)₁₃、C₆₀(NCH₂COONa)₆、C₆₀(NCH₂COONa)₈。

如此，通過(guò)梯度調(diào)節(jié)提取溶劑極性的策略，即可實(shí)現(xiàn)加成數(shù)目在較窄范圍變化且平均加成數(shù)目互異的富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物的相互分離。

實(shí)施例5：制備C₆₀與疊氮乙酸的富勒烯基聚甘氨酸鈉水溶性衍生物C₆₀(NCH₂COONa)₇

實(shí)施例3的步驟(3)中，經(jīng)去離子水多次超聲提取粗產(chǎn)品3后的殘留物，直接添加體積比為50％：50％的甲醇-水的二元溶劑超聲提取多次，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品6。

將粗產(chǎn)品6復(fù)溶于1mol/L NaOH溶液并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，微孔濾膜過(guò)濾，干燥，由此精制得到純凈的含甘氨酸鈉的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品，依次標(biāo)記為富勒烯基聚甘氨酸鈉水溶性衍生物4。熱重分析表征其平均分子式依次為C₆₀(NCH₂COONa)₇。

實(shí)施例6：制備C₆₀與疊氮丙酸的富勒烯基聚丙氨酸鈉水溶性衍生物C₆₀(NCH₂CH₂COONa)₁₀

(1)將9.0g C₆₀固體粉末與143.9g液態(tài)的3-疊氮基丙酸(物質(zhì)的量投料比為1:100)分別投料于250mL反應(yīng)器，無(wú)需添加有機(jī)溶劑直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌；

(2)反應(yīng)體系升溫至回流，保溫72小時(shí)后，停止加熱；

(3)減壓蒸餾去除部分未反應(yīng)的3-疊氮基丙酸，殘留物經(jīng)乙醚、乙酸乙酯反復(fù)洗滌，以便進(jìn)一步去除未反應(yīng)的3-疊氮基丙酸及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生化產(chǎn)物，然后添加體積比為50％：50％的乙腈與水的混合物超聲提取多次，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品；

(4)將粗產(chǎn)品復(fù)溶于1mol/L NaOH溶液，并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，微孔濾膜過(guò)濾，干燥，由此精制得到純凈的側(cè)鏈末端含羧酸鹽的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品17.0g，產(chǎn)率75％，標(biāo)記為富勒烯基聚丙氨酸鈉水溶性衍生物。熱重分析表征其平均分子式為C₆₀(NCH₂CH₂COONa)₁₀。

實(shí)施例7：制備C₆₀與疊氮己酸的富勒烯基聚己氨酸鈉水溶性衍生物C₆₀(NCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COONa)₈

(1)將10.0g C₆₀固體粉末與109.1g液態(tài)的6-疊氮基己酸(物質(zhì)的量投料比為1:50)分別投料于250mL反應(yīng)器，無(wú)需添加有機(jī)溶劑直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌；

(2)反應(yīng)體系升溫至回流，保溫48小時(shí)后，停止加熱；

(3)減壓蒸餾去除部分未反應(yīng)的6-疊氮基己酸，殘留物經(jīng)乙醚、乙酸乙酯反復(fù)洗滌，以便進(jìn)一步去除未反應(yīng)的2-疊氮基乙酸及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生化產(chǎn)物，然后添加體積比為50％：50％的乙酸與水的混合物超聲提取多次，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品；

(4)將粗產(chǎn)品復(fù)溶于1mol/L NaOH溶液，并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，微孔濾膜過(guò)濾，干燥，由此精制得到純凈的側(cè)鏈末端含羧酸鹽的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品14.8g，產(chǎn)率60％，標(biāo)記為富勒烯基聚己氨酸鈉水溶性衍生物。熱重分析表征其平均分子式為C₆₀(NCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COONa)₈。

實(shí)施例8：制備C₇₀與疊氮乙醇的水溶性加成產(chǎn)物C₇₀(NCH₂CH₂NH₂)₁₆(氮雜富勒醇2)

(1)將5.0g C₇₀固體粉末與51.8g液態(tài)的2-疊氮基乙醇(物質(zhì)的量投料比為1:100)分別投料于100mL三口反應(yīng)器，接冷凝管及機(jī)械攪拌裝置，無(wú)需添加有機(jī)溶劑，直接在惰性氣體氛圍下機(jī)械攪拌；

(2)反應(yīng)體系升溫至回流，保溫72小時(shí)后，停止加熱；

(3)減壓蒸餾去除部分未反應(yīng)的2-疊氮基乙醇，殘留物經(jīng)乙醚、乙酸乙酯反復(fù)洗滌，以便進(jìn)一步去除未反應(yīng)的2-疊氮基乙醇及加成數(shù)目較少的非水溶性衍生化產(chǎn)物，然后添加去離子水超聲提取多次至上清液無(wú)色后，合并提取液經(jīng)濾膜過(guò)濾，去除溶劑，得固化的粗產(chǎn)品；

(4)將粗產(chǎn)品復(fù)溶于去離子水并使用截留分子量為500-10000道爾頓的透析袋透析，干燥，由此精制得到純凈的側(cè)鏈末端含羥基的富勒烯多氮雜橋類(lèi)水溶性衍生物的固態(tài)產(chǎn)品9.4g，產(chǎn)率95％，標(biāo)記為氮雜富勒醇2。熱重分析表征其平均分子式為C₇₀(NCH₂CH₂OH)₁₆。

實(shí)施例9：C₆₀(NCH₂CH₂OH)₁₄和C₆₀(NCH₂COONa)₁₃水溶液體外清除自由基能力的測(cè)試

清除自由基測(cè)試方法參考文獻(xiàn)(Li X.et al.Chemistry Central Journal.2012；6:140)的光度檢測(cè)法，結(jié)果顯示C₆₀(NCH₂CH₂OH)₁₄(圖5)和C₆₀(NCH₂COONa)₁₃(圖6)水溶液都能有效清除2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS⁺·)，且清除效果與二者的濃度呈線性依賴(lài)性，最高清除率均超過(guò)90％。這初步證實(shí)側(cè)鏈末端含不同親水官能團(tuán)的富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物在體外條件下均具備高效清除自由基的能力。這也間接闡釋其可清除生物體中活性氧等自由基，本法所大規(guī)模制備的新型富勒烯多氮雜橋水溶性衍生物具備清除活體生物體系中自由基的能力。

實(shí)施例10：C₆₀(NCH₂COONa)₁₃水溶液處理玉米種子的測(cè)試

(1)C₆₀(NCH₂COONa)₁₃促進(jìn)玉米種子萌發(fā)

利用5μg/ml和50μg/ml的C₆₀(NCH₂COONa)₁₃水溶液浸泡24小時(shí)并培養(yǎng)玉米種子，以水作為對(duì)照。結(jié)果表明：萌發(fā)的第二天，經(jīng)50μg/ml處理的玉米種子發(fā)芽率已接近70％，對(duì)照則40％左右，而5μg/ml C₆₀(NCH₂COONa)₁₃處理樣品與對(duì)照沒(méi)有顯著差異(圖7)。說(shuō)明一定濃度的C₆₀(NCH₂COONa)₁₃處理能夠促進(jìn)萌發(fā)，提高種子萌發(fā)的整齊度及出苗率。

(2)C₆₀(NCH₂COONa)₁₃促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)及根系發(fā)育

在上述處理下，對(duì)兩葉一心期的玉米幼苗的進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，處理樣品顯著的促進(jìn)玉米整個(gè)植物(地下部分-根長(zhǎng)，地上部分-芽長(zhǎng))的發(fā)育(表1)。說(shuō)明C₆₀(NCH₂COONa)₁₃能夠促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)。此外，發(fā)現(xiàn)50μg/ml C₆₀(NCH₂COONa)₁₃處理的兩葉一心期幼苗55％根系有分支現(xiàn)象，根條數(shù)增多，根系較為發(fā)達(dá)(圖8左)，5μg/ml處理下，27％的處理樣根系有分支，而對(duì)照僅有17.5％的樣品有分支。

表1