本發(fā)明涉及一種DNA分離分析技術(shù)領(lǐng)域，且特別涉及一種DNA分離試劑盒。

背景技術(shù)：

DNA的檢測是區(qū)別生物界各物種的最根本依據(jù)，也是人類疾病的初期診斷最有效的方法。毛細(xì)管電泳已成為分離DNA片段的重要方法之一，在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。目前已有與毛細(xì)管電泳儀配套使用的商品化DNA試劑盒。然而，目前商品化的DNA分離試劑盒極其有限，選擇面窄；且應(yīng)用次數(shù)少、保存條件苛刻、價(jià)格昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種DNA分離試劑盒，其價(jià)格低廉，分離效果佳，使用壽命長，保存條件簡單。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明提出一種DNA分離試劑盒，其包括：甲基纖維素膠體溶液、緩沖液、DNA Marker、熒光染料和毛細(xì)管柱，其中，該毛細(xì)管柱為依次用1.0-5.0mg/ml的硅烷偶聯(lián)劑和第一混合物進(jìn)行沖洗后的石英毛細(xì)管柱；其中，第一混合物包括終濃度為10-40mg/ml的丙烯酰胺、0.5-3.0mg/ml的過硫酸銨和0.5-2.0mg/ml的四甲基乙二胺。

本發(fā)明實(shí)施例的DNA分離試劑盒的有益效果是：其包括內(nèi)壁化學(xué)鍵連接有聚丙烯酰胺涂層的毛細(xì)管柱，該毛細(xì)管柱通過硅烷偶聯(lián)劑對(duì)石英毛細(xì)管柱進(jìn)行改性，且改性后的石英毛細(xì)管柱與丙烯酰胺、過硫酸銨和四甲基乙二胺反應(yīng)形成聚丙烯酰胺發(fā)生化學(xué)鍵的鍵和反應(yīng)，從而使得石英毛細(xì)管柱內(nèi)壁具有一層牢固的聚丙烯酰胺，其不易脫落，且通過合理的配比，使其效果最優(yōu)化，從而制得的毛細(xì)管柱具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性。由于聚丙烯酰胺會(huì)形成網(wǎng)狀篩孔且不帶電荷，所以制得的該毛細(xì)管柱可用于DNA的高效分離。且該DNA分離試劑盒應(yīng)用時(shí)間長、保存條件簡單、價(jià)格低廉。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1本發(fā)明提供的DNA分離試劑盒第一天首次使用測定結(jié)果色譜圖；

圖2本發(fā)明提供的DNA分離試劑盒第三天使用測定結(jié)果色譜圖；

圖3本發(fā)明提供的DNA分離試劑盒第五天使用測定結(jié)果色譜圖；

圖4本發(fā)明提供的DNA分離試劑盒第六天使用測定結(jié)果色譜圖。

圖5本發(fā)明提供的對(duì)比例商品化的DNA分離試劑盒第一天首次使用測定結(jié)果色譜圖；

圖6本發(fā)明提供的對(duì)比例商品化的DNA分離試劑盒第三天使用測定結(jié)果色譜圖；

圖7本發(fā)明提供的對(duì)比例商品化的DNA分離試劑盒第五天使用測定結(jié)果色譜圖；

圖8本發(fā)明提供的對(duì)比例商品化的DNA分離試劑盒第七天使用測定結(jié)果色譜圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的DNA分離試劑盒進(jìn)行具體說明。

一種DNA分離試劑盒，其包括：甲基纖維素膠體溶液、緩沖液、DNA Marker、熒光染料和毛細(xì)管柱。

該DNA分離試劑盒適于配合毛細(xì)管電泳使用。其中，甲基纖維素膠體溶液是指甲基纖維素在緩沖液中溶脹成澄清或微渾濁的膠體溶液。優(yōu)選地，甲基纖維素膠體溶液濃度為1-10mg/ml，其篩分作用最佳。

緩沖液，分子電泳時(shí)所使用的緩沖溶液，用以穩(wěn)定體系酸堿度。優(yōu)選地，緩沖液選自TAE、TBE、TPE和MOPS等中的一種。更優(yōu)選地，緩沖液為TBE。具體地，TBE的濃度例如為30-200mmol/L。

DNA Marker，是一種分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA做凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來檢測凝膠是否有問題。并通過其大小可以粗略估算樣品DNA分子量的大小。DNA Marker可以選自DL500DNA Marker、DL1000DNA Marker、DL3000DNA Marker或其他商品化DNA Marker等。

熒光染料，作為檢測標(biāo)記，優(yōu)選為SYBR Gold核酸熒光染料、SYBR Green I核酸熒光染料等。更優(yōu)選地，熒光染料為SYBR Gold核酸熒光染料，其靈敏度高、染色效果佳。

該毛細(xì)管柱為依次用1.0-5.0mg/ml的硅烷偶聯(lián)劑和第一混合物進(jìn)行沖洗后的石英毛細(xì)管柱。

由于石英毛細(xì)管內(nèi)壁含有大量的硅羥基(-Si-OH)，其具有一定的疏水性并且在較寬的pH范圍內(nèi)帶有負(fù)電荷，毛細(xì)管在電泳時(shí)液體中的正離子被吸引附著于通道壁上，該吸附力越靠近通道壁越強(qiáng)，而水分子因具偶極性而被吸附于正離子上，因而當(dāng)開始電泳時(shí)，在石英毛細(xì)管兩端施加電壓時(shí)，距離通道壁較遠(yuǎn)的正離子，由于受壁的吸引力較弱，游向負(fù)極，正離子帶著吸附于其上的水分子以及因?yàn)槟Σ亮恳渌肿右积R游向負(fù)極，從而引發(fā)電滲效應(yīng)，影響最終得到的毛細(xì)管電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。而硅烷偶聯(lián)劑則可以與硅羥基(-Si-OH)發(fā)生硅烷化反應(yīng)，消除石英毛細(xì)管內(nèi)壁因硅羥基(-Si-OH)解離所帶的負(fù)電荷。

優(yōu)選地，硅烷偶聯(lián)劑選自甲基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷和十八烷基三氯硅烷中的至少一種。均可消除石英毛細(xì)管內(nèi)壁因硅羥基(-Si-OH)解離所帶的負(fù)電荷。更優(yōu)選地，硅烷偶聯(lián)劑為甲基三甲氧基硅烷。

具體地，甲基三甲氧基硅烷(CH₃Si(CH₃O)₃)與硅羥基(-Si-OH)發(fā)生硅烷化反應(yīng)，硅羥基(-Si-OH)生成(-Si-O-Si(CH₃O)₂CH₃)，具體反應(yīng)如下：CH₃Si(CH₃O)₃+-Si-OH→-Si-O-Si(CH₃O)₂CH₃；其消除石英毛細(xì)管內(nèi)壁因硅羥基(-Si-OH)解離所帶的負(fù)電荷效果佳且環(huán)保。

由于甲基三甲氧基硅烷需避光保存，優(yōu)選地，第一次沖洗于遮光條件下進(jìn)行12h-24h。在上述條件下第一次沖洗進(jìn)行12h-24h，從而使甲基三甲氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行充分、均勻的修飾。

優(yōu)選地，于制備改性石英毛細(xì)管柱步驟之前還包括對(duì)石英毛細(xì)管柱進(jìn)行預(yù)處理步驟，預(yù)處理步驟將初始毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗，用于除去管內(nèi)壁堿溶性雜質(zhì)以及將管壁硅氧鍵打開形成硅羥基，接著用0.1mol/L HCl溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)，并用純水沖洗至呈中性。

第一混合物包括終濃度為10-40mg/ml的丙烯酰胺、0.5-3.0mg/ml的過硫酸銨和0.5-2.0mg/ml的四甲基乙二胺。

其中，丙烯酰胺(C₃H₅NO)是一種不飽和酰胺，別名AM，2-丙烯酰胺，丙烯酰胺水合液，2-丙烯酰胺；是一種白色晶體化學(xué)物質(zhì)，能溶于水。是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的單體。其化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，在雙鍵及酰胺基處可進(jìn)行一系列的化學(xué)反應(yīng)，采用不同的工藝，可以引入不同的官能基團(tuán)。

聚丙烯酰胺((C₃H₅NO)_n)，簡稱PAM，是一種水溶性線型高分子物質(zhì)。PAM分子鏈與分散相通過機(jī)械、物理、化學(xué)等作用，將分散相牽連在一起，形成網(wǎng)狀。過硫酸銨與四甲基乙二胺聯(lián)用，用于催化丙烯酰胺的聚合生成聚丙烯酰胺((C₃H₅NO)_n)。其中，過硫酸銨((NH₄)₂S₂O₈)，又名過二硫酸銨或過氧二硫酸銨，易溶于水。在有機(jī)高分子聚合時(shí)的助聚劑。四甲基乙二胺((CH₃)₂N(CH₂)₂N(CH₃)₂)，又名N，N，N'，N'-甲基乙二胺；四甲基乙撐二胺；1，2-雙(二甲基氨基)乙烷；四甲基-1，2-亞乙基二胺；無色透明液體，稍有氨氣味，與水混溶。其催化丙烯酰胺的聚合反應(yīng)。

由于丙烯酰胺的聚合反應(yīng)屬于自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而氧氣具有顯著的阻聚作用，氧氣與自由基反應(yīng)形成不活潑的過氧自由基，阻止了鏈的延長，形成分子量較低的聚合物，不能有效地屏蔽管壁的硅羥基，因此，去除聚合液中的氧是有利于聚丙烯酰胺涂層質(zhì)量的提高。優(yōu)選地，丙烯酰胺、過硫酸銨和四甲基乙二胺的溶劑均為水，且均經(jīng)除氧處理。除氧方式可以采用物理方式，例如通氮，也可以采用化學(xué)方式，在此不做限定。

用第一混合物對(duì)上述改性的石英毛細(xì)管柱進(jìn)行第二次沖洗，得該毛細(xì)管柱。

優(yōu)選地，第二次沖洗進(jìn)行時(shí)間為12h-24h。使得聚丙烯酰胺與改性后的石英毛細(xì)管柱充分反應(yīng)。通過對(duì)硅烷偶聯(lián)劑、丙烯酰胺、過硫酸銨和四甲基乙二胺的濃度、比例以及反應(yīng)的時(shí)間綜合調(diào)控，使得最終制得的該毛細(xì)管柱的內(nèi)壁聚丙烯酰胺層均勻分布，提高其柱效。同時(shí)聚丙烯酰胺形成網(wǎng)狀的篩孔，用于不同大小的DNA快速分離，提高分離效率。更優(yōu)選地，第二次沖洗于無氧條件下進(jìn)行，防止在聚合過程中氧氣的再溶解。

如上述制備方法制得的毛細(xì)管柱?？煞磸?fù)利用，時(shí)間長，可在至少一年內(nèi)均保持較高的柱效性。由于Si-O-Si-C鍵在堿性條件下易于水解，從而使聚丙烯酰胺涂層部分脫落，因此日常維護(hù)優(yōu)選為只需稀酸沖洗，例如0.01-0.10mol/L的鹽酸、0.01-0.10mol/L的硼酸、0.01-0.10mol/L磷酸等，其維護(hù)簡單便捷。更優(yōu)選地，使用0.01-0.10mol/L磷酸進(jìn)行沖洗，其價(jià)格便宜，且沖洗效果佳。

因此，該DNA分離試劑盒在毛細(xì)管電泳中使用時(shí)，其可去除電滲流對(duì)結(jié)果的影響，且最大限度地消除生物分子與管壁之間的非特異性相互作用，同時(shí)聚丙烯酰胺形成網(wǎng)狀的篩孔，用于使不同大小的DNA 快速分離，分離效率高。提高整個(gè)DNA分離試劑盒質(zhì)量并降低制作成本。該DNA分離試劑盒僅需4℃保存。

DNA分離試劑盒適于與安裝有激光誘導(dǎo)熒光檢測器的毛細(xì)管電泳儀配合使用，例如P/ACE^TM MDQ型毛細(xì)管電泳儀、其他商品化毛細(xì)管電泳儀，或自行組裝的儀器均可。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

DNA分離試劑盒，包括4mg/ml的甲基纖維素膠體溶液、45mmol/L的TBE緩沖液、DL1000Marker、SYBR Gold核酸熒光染料和毛細(xì)管柱，其中該毛細(xì)管柱，其是由以下步驟制備：首先，將初始毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗，接著用0.1mol/L HCl溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)，并用純水沖洗，直至呈中性。其次，于遮光條件下，用1.0mg/ml的甲基三甲氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管柱第一次沖洗24h，得改性石英毛細(xì)管柱；接著，用純水沖洗10min，再用第一混合物對(duì)改性的石英毛細(xì)管柱第二次沖洗24h，得該毛細(xì)管柱，其中第一混合物包括終濃度為40mg/ml的丙烯酰胺、3.0mg/ml的過硫酸銨和1.3mg/ml的四甲基乙二胺。利用上述DNA分離試劑盒進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

實(shí)施例2

DNA分離試劑盒，包括5mg/ml的甲基纖維素膠體溶液、100mmol/L的TBE緩沖液、DL1000Marker、SYBR Gold核酸熒光染料和毛細(xì)管柱，其中該毛細(xì)管柱，其是由以下步驟制備：首先，將初始毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗，接著用0.1mol/L HCl溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)，并用純水沖洗，直至呈中性。其次，于遮光條件下，用2.0mg/ml的甲基三甲氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管柱第一次沖洗12h，得改性石英毛細(xì)管柱；接著，用純水沖洗10min，再用第一混合物對(duì)改性的石英毛細(xì)管柱第二次沖洗19h，得該毛細(xì)管柱，其中第一混合物包括終濃度為10mg/ml的丙烯酰胺、0.5mg/ml的過硫酸銨和2.0mg/ml的四甲基乙二胺。利用上述DNA分離試劑盒進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

實(shí)施例3

DNA分離試劑盒，包括10mg/ml的甲基纖維素膠體溶液、200mmol/L的TBE緩沖液、DL2000Marker、SYBR Gold核酸熒光染料和毛細(xì)管柱，其中該毛細(xì)管柱，其是由以下步驟制備：首先，將初始毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗，接著用0.1mol/L HCl溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)，并用純水沖洗，直至呈中性理。其次，于遮光條件下，用5.0mg/ml的甲基三甲氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管柱第一次沖洗12h，得改性石英毛細(xì)管柱；接著，用純水沖洗10min，再用第一混合物對(duì)改性的石英毛細(xì)管柱第二次沖洗16h，得該毛細(xì)管柱，其中第一混合物包括終濃度為15mg/ml的丙烯酰胺、2.5mg/ml的過硫酸銨和1.0mg/ml的四甲基乙二胺。利用上述用于DNA分離試劑盒進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

實(shí)施例4

DNA分離試劑盒，包括8mg/ml的甲基纖維素膠體溶液、150mmol/L的TBE緩沖液、DL1000Marker、SYBR Gold核酸熒光染料和毛細(xì)管柱，其中該毛細(xì)管柱，其是由以下步驟制備：首先，將初始毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗，接著用0.1mol/L HCl溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)，并用純水沖洗，直至呈中性。其次，于遮光條件下，用4.0mg/ml的甲基三甲氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管柱第一次沖洗16h，得改性石英毛細(xì)管柱；接著，用純水沖洗10min，再用第一混合物對(duì)改性的石英毛細(xì)管柱第二次沖洗17h，得該毛細(xì)管柱，其中第一混合物包括終濃度為25mg/ml的丙烯酰胺、1.5mg/ml的過硫酸銨和1.5mg/ml的四甲基乙二胺。利用上述DNA分離試劑盒進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

實(shí)施例5

DNA分離試劑盒，包括1mg/ml的甲基纖維素膠體溶液、170mmol/L的TBE緩沖液、DL500Marker、SYBR Gold核酸熒光染料和毛細(xì)管柱，其中該毛細(xì)管柱，其是由以下步驟制備：首先，將初始毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗，接著用0.1mol/L HCl溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)，并用純水沖洗，直至呈中性。其次，于遮光條件下，用3.0mg/ml的甲基三甲氧基硅烷對(duì)石英毛細(xì)管柱第一次沖洗18h，得改性石英毛細(xì)管柱；接著，用純水沖洗10min，再用第一混合物對(duì)改性的石英毛細(xì)管柱第二次沖洗12h，得該毛細(xì)管柱，其中第一混合物包括終濃度為33mg/ml的丙烯酰胺、1.0mg/ml的過硫酸銨和1.7mg/ml的四甲基乙二胺。利用上述DNA分離試劑盒進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

對(duì)比例

測定使用的儀器為：P/ACE^TM MDQ型毛細(xì)管電泳儀。將實(shí)施例1制得的DNA分離試劑盒置于毛細(xì)管電泳儀中，6kV電動(dòng)進(jìn)樣10s，分離電壓14kV，電泳分離20min。激發(fā)光波長為488nm，檢測的熒光波長為520nm。同一日內(nèi)連續(xù)6次測定DL1000DNA Marker，記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)片段的遷移時(shí)間并計(jì)算日內(nèi)精密度(詳見表1)，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示。連續(xù)6日測定DL1000DNA Marker，記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)片段的遷移時(shí)間，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示，計(jì)算日間精密度(表2)。并記錄其連續(xù)7天實(shí)驗(yàn)測定DNA Marker得到的色譜圖，其中，圖1至圖4分別為在第一天、第三天、第五天和第六天測定DNA Marker得到的色譜圖。圖1至圖4中，橫坐標(biāo)均表示遷移時(shí)間，縱坐標(biāo)均表示熒光強(qiáng)度。由圖1至圖4中可得，使用第六天測定的DNA Marker得到的色譜圖與首次使用相比，各峰清晰可見，未發(fā)生峰缺失、峰拖尾等現(xiàn)象，該DNA分離試劑盒，使用壽命長，結(jié)果重現(xiàn)性佳。

市售商品化的DNA分離試劑盒，在同等的實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)7天實(shí)驗(yàn)，圖5至圖8分別為在第一天、第三天、第五天和第七天測定DNA Marker得到的色譜圖。其中，圖5為2016年3月17日測定結(jié)果，圖6為2016年3月19日測定結(jié)果，圖7為2016年3月21日測定結(jié)果，圖8為2016年3月23日測定結(jié)果。圖5至圖8中，橫坐標(biāo)均表示遷移時(shí)間，縱坐標(biāo)均表示熒光強(qiáng)度。由圖5可得，各不同大小的DNA片段分離效果佳。由圖6可知，圖5中出現(xiàn)的第一個(gè)峰出現(xiàn)的時(shí)間推遲，熒光強(qiáng)度降低，其分離精密度開始降低，但整體分離效果仍較佳。而由圖7可得，結(jié)果重現(xiàn)性降低，分離性能嚴(yán)重下降，從開始電泳即出現(xiàn)小峰干擾，并后續(xù)出現(xiàn)峰缺失、峰面積變大的現(xiàn)象。由圖8可得，分離性能進(jìn)一步下降。因此可得，該商品化的DNA分離試劑盒在開始使用第4天以后分離效果變差，從而該商品化的DNA分離試劑盒使用次數(shù)少，使用壽命短。且該商品化的用于DNA分離試劑盒維護(hù)繁瑣苛刻，必須每天將毛細(xì)管柱從儀器上取下裝于卡盒中，浸泡并于4℃條件下保存于冰箱。

表1各片段的遷移時(shí)間及日內(nèi)精密度

由表1可得，同一日內(nèi)連續(xù)6次測定DL1000DNA Marker，記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)片段，其日內(nèi)精密度為0.29％-0.41％。也即是說，該DNA分離試劑盒日內(nèi)精密度高，柱效穩(wěn)定，可重復(fù)性佳。

表2各片段的遷移時(shí)間及日間精密度

由表2可得，連續(xù)6日測定DL1000DNA Marker，記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)片段，其日間精密度為0.68％-1.06％。也即是說，該DNA分離試劑盒，使用壽命長，可重復(fù)性佳。且經(jīng)發(fā)明人多年實(shí)驗(yàn)，正常情況下，該DNA分離試劑盒的壽命普遍保持在至少一年左右。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例的該DNA分離試劑盒，其維護(hù)簡單，重現(xiàn)性佳，分離效果好，使用壽命長。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。