本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體提供了一種快速、高效提取人類外周血液基因組DNA的方法。
背景技術(shù)：
：分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)多個方面。人類基因組DNA的提取是分子生物學(xué)研究的一項基礎(chǔ)技術(shù)，也是分子生物學(xué)初學(xué)者及臨床醫(yī)生欲開展各種分子生物學(xué)相關(guān)研究的入門技術(shù)?；蚪MDNA作為遺傳物質(zhì)的載體，快速、經(jīng)濟(jì)、安全、高效地從臨床人體血液標(biāo)本中提取到高產(chǎn)量、高純度的基因組DNA,對于遺傳性疾病的基因診斷,尤其是通過母體外周血液診斷胎兒遺傳性疾病和胎兒性別鑒定,腫瘤和傳染性疾病等的早期確診，以及其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都是至關(guān)重要的。作為基因研究的關(guān)鍵步驟，基因組DNA的提取和純化一直都是一個耗時耗力并且自動化程度不高的過程，因而如何快速、經(jīng)濟(jì)的獲得高品質(zhì)的基因組DNA就具有十分重要的意義。從哺乳動物的全血中提取基因組DNA是大部分分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)?；蚪MDNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交及PCR分離基因等。針對人群的遺傳學(xué)分析以及造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫的HLA基因分型工作都需要從大批量的全血樣本中提取基因組DNA。而DNA提取的純度和產(chǎn)量將會直接影響到PCR擴(kuò)增、限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)及分子克隆等試驗(yàn)的成敗。如單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因組文庫構(gòu)建以及DNA序列測定等。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的操作方法也越來越多；對于開展分子生物學(xué)工作的初學(xué)者和臨床醫(yī)生來說有時很難選擇哪一種操作方法更加適用方便。目前，常見的DNA提取方法有多種,但步驟都較多,并需要較長時間才能完成。代表性的方法如酚-氯仿抽提法，在實(shí)踐中存在較多問題和不足，如：蛋白酶K消化時間一般至少需要幾個小時,耗時長；異丙醇的反復(fù)抽提,一是污染DNA的程度增大,二是極易造成DNA的丟失；因多次轉(zhuǎn)移,易造成樣本污染,這也是PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽性的重要原因；分離后的DNA還要經(jīng)過乙醇沉淀純化,操作繁雜,工作量大；純度相對較低；裂解的過程不夠完全徹底，從而導(dǎo)致所提取樣品中的DNA伴有大量的蛋白質(zhì)；所提取得DNA在不同程度上有降解等缺陷。今年來出現(xiàn)的DNA提取試劑盒可有效提取DNA，但費(fèi)用相對較高，為實(shí)現(xiàn)節(jié)約實(shí)驗(yàn)人力和成本,同時快速、高效的提取DNA,本領(lǐng)域需要提供一種新的能加快整個實(shí)驗(yàn)工作進(jìn)度、提高提取效率的提取基因組DNA的方法。本發(fā)明提供大技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的包括：提供一種從血液中取DNA的方法；提供一種從大樣本全血中提取基因組DNA的方法；提供一種快速高效提取人類外周血液基因組DNA的方法，等。具體的，本發(fā)明提供了一種提取基因組DNA的方法，包括以下步驟：①吸取血液于離心管中；②加入緩沖液，混勻；所述緩沖液以質(zhì)量體積濃度計，含有2.5％的十二烷基磺酸鈉；③加入氯化鈉溶液，混勻；④加入Tris平衡酚和氯仿的混合溶液，混勻；⑤離心，吸取上清液于另一支離心管中；⑥加入與上清液等體積的異丙醇，混勻；⑦離心，棄掉上清液；⑧加入70％乙醇溶液，混勻，離心，棄掉上清液；重復(fù)步驟⑧⑨離心管倒置在干凈吸水紙上停留；⑩加含有RNA酶的TE緩沖液，得DNA提取物。本發(fā)明的一種實(shí)施方式是，所述提取方法包括以下步驟：①吸取100ul血液于離心管中；②加入600ul緩沖液，上下顛倒混勻10次；所述緩沖液以質(zhì)量體積濃度計，含有2.5％的十二烷基磺酸鈉；同時所述緩沖液還含有下表2所述成分；表2：TKM-2緩沖液配制物質(zhì)量濃度試劑名稱10mmol/mlPH值7.6的Tris-HCl10mmol/mlKCl10mmol/mlMgCl22mmol/mlEDTA0.4mol/mlNaCl補(bǔ)充體系ddH2O③加入21ul6mmol/mL的氯化鈉溶液，上下顛倒混勻10次；④加入300ul的Tris平衡酚和氯仿的混合溶液，于臺式渦旋震蕩器上振蕩10秒；⑤于12000rpm條件下離心2分鐘,緩慢吸取透明顏色的上清液于另一支離心管內(nèi)；⑥加入與上清液等體積的異丙醇，在臺式渦旋震蕩器上振蕩10秒；⑦離心12000rpm/2min,棄掉上清液；⑧加入體積濃度70％的乙醇溶液，混勻，離心，棄掉上清液；⑨離心管倒置在吸水紙上停留1min，確保沉淀在管中；⑩加入100ul含有RNA酶的1×TE緩沖液；所述1×TE緩沖液的配方如下表3所示；所述1×TE緩沖液與RNA酶的配比為1ml的1×TE緩沖液含3ul的RNA酶。表3：1×TEBuffer1L配制名稱體積(mL)1MTris-HClBuffer(pH7.6)10500mMEDTA(pH8.0)20ddH2O970Total1000優(yōu)選的，所述離心管為1.5mlEP管。優(yōu)選的，步驟①所述血液為人靜脈血。優(yōu)選的，步驟⑤所述的緩慢吸取為使用移液器吸取。優(yōu)選的，步驟⑦所述的棄掉上清液為緩慢倒掉上清液。優(yōu)選的，步驟⑧所述的乙醇溶液為體積濃度70％的乙醇溶液；步驟⑧完成后在重復(fù)進(jìn)行一次。優(yōu)選的步驟④所述的Tris平衡酚和氯仿的混合溶液，以體積比計，Tris平衡酚：氯仿＝1:1。本發(fā)明的一種實(shí)施方式是，包括以下提取步驟：①吸取100ul人靜脈血于1.5mlEP中；②加入600ul緩沖液，上下顛倒混勻10次；所述緩沖液以質(zhì)量體積濃度計，含有2.5％的十二烷基磺酸鈉；同時所述緩沖液還含有下表2所述成分；表2：TKM-2緩沖液配制物質(zhì)量濃度試劑名稱10mmol/mlPH值7.6的Tris-HCl10mmol/mlKCl10mmol/mlMgCl22mmol/mlEDTA0.4mol/mlNaCl補(bǔ)充體系ddH2O③加入21ul6mmol/mL的氯化鈉溶液，上下顛倒混勻10次；④加入300ul的Tris平衡酚和氯仿的混合溶液，于臺式渦旋震蕩器上振蕩10秒；所述Tris平衡酚和氯仿的混合溶液，以體積比計，Tris平衡酚：氯仿＝1:1；⑤于12000rpm條件下離心2分鐘,使用移液器緩慢吸取透明顏色的上清液于另一支離心管內(nèi)；⑥加入與上清液等體積的異丙醇，在臺式渦旋震蕩器上振蕩10秒；⑦離心12000rpm/2min,緩慢倒掉上清液；⑧加入體積濃度70％的乙醇溶液，混勻，離心，棄掉上清液；然后，再加入體積濃度70％的乙醇溶液，混勻，離心，棄掉上清液；⑨離心管倒置在吸水紙上停留1min，確保沉淀在管中；⑩加入100ul含有RNA酶的1×TE緩沖液，；所述1×TE緩沖液的配方如下表3所示；所述1×TE緩沖液與RNA酶的配比為，1ml1×TE緩沖液含3ulRNA酶。表3：1×TEBuffer1L配制名稱體積(mL)1MTris-HClBuffer(pH7.6)10500mMEDTA(pH8.0)20ddH2O970Total1000本發(fā)明提供的血液基因組DNA提取方法，可稱為改良″苯酚-氯仿″提取法。針對常規(guī)方法/試劑盒提取參考方法的不足，本發(fā)明提供的基因組DNA提取方法，更為實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、高效；較現(xiàn)有DNA提取方法，本發(fā)明提取方法的改進(jìn)包括：①去除蛋白酶K的使用，降低成本；②在抽提過程中使用三氯甲烷，以便使蛋白質(zhì)充分的從DNP中分離出來；③在短時間內(nèi)直接裂解了白細(xì)胞膜、核膜,將DNA釋放出來,經(jīng)常規(guī)沉淀、洗滌,在不足30min內(nèi)即可完成基因組DNA的提??；④降低DNA在提取過程中的損耗，提高DNA的濃度；⑤盡可能少的使提取出的DNA降解；⑥消除提取得到的DNA渾濁的現(xiàn)象，同時避免在瓊脂糖凝膠電泳時的條帶拖尾的現(xiàn)象。本發(fā)明提供的血液基因組DNA提取方法，可稱為改良″苯酚-氯仿″提取基因組DNA法，其經(jīng)濟(jì)成本低廉，獲得的DNA質(zhì)量較好，能滿足PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切核酸酶消化實(shí)驗(yàn)的需要，因而可以認(rèn)為該法可以完全取代試劑盒法，是一種適用于臨床大批量樣本基因組DNA提取的好方法。再者，該裂解液中的TKM-2能改變細(xì)胞膜的表面張力,溶解紅細(xì)胞,還可除去血紅蛋白中的卟啉化合物,從而去除了該化合物對PCR反應(yīng)的抑制。紅細(xì)胞裂解后,提取DNA的整個過程在兩個Ep管中進(jìn)行,避免了重復(fù)費(fèi)時的苯酚/氯仿不斷抽提的造成DNA損失和污染,保證了PCR反應(yīng)的質(zhì)量。該方法簡便有效,可大批量處理標(biāo)本,避免了異戊醇對人體造成的危害。此外，還保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性,排除其它生物大分子(蛋白質(zhì)、多糖、脂類等)的污染以及核酸分子之間的污染(提取DNA分子時,應(yīng)去除RNA分子),并且不應(yīng)存在過高濃度的有機(jī)溶劑和金屬離子,也避免化學(xué)因素對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞和對后續(xù)的酶反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。同時還簡化操作步驟,不但可節(jié)省時間,更重要的是,可減少提取過程中各種有害因素對核酸的破壞。有益效果本發(fā)明提供的改良″苯酚-氯仿″提取基因組DNA法，其經(jīng)濟(jì)成本低廉，獲得的DNA質(zhì)量較好，能滿足PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切核酸酶消化實(shí)驗(yàn)的需要，因而可以認(rèn)為該法可以完全取代試劑盒法，是一種適用于臨床大批量樣本基因組DNA提取的好方法。再者，該裂解液中的TKM-2能改變細(xì)胞膜的表面張力,溶解紅細(xì)胞,還可除去血紅蛋白中的卟啉化合物,從而去除了該化合物對PCR反應(yīng)的抑制。紅細(xì)胞裂解后,提取DNA的整個過程在兩個Ep管中進(jìn)行,避免了重復(fù)費(fèi)時的苯酚/氯仿不斷抽提的造成DNA損失和污染,保證了PCR反應(yīng)的質(zhì)量。該方法簡便有效,可大批量處理標(biāo)本,避免了異戊醇對人體造成的危害。此外，還保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性,排除其它生物大分子(蛋白質(zhì)、多糖、脂類等)的污染以及核酸分子之間的污染(提取DNA分子時,應(yīng)去除RNA分子),并且不應(yīng)存在過高濃度的有機(jī)溶劑和金屬離子,也避免化學(xué)因素對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞和對后續(xù)的酶反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。同時還簡化操作步驟,不但可節(jié)省時間,更重要的是,可減少提取過程中各種有害因素對核酸的破壞。附圖說明圖1試劑盒對人類外周血液基因組DNA提取的電泳結(jié)果圖2對人類外周血液基因組DNA提取的對比試驗(yàn)電泳結(jié)果其中，1為樣品a#試劑盒提取法，2為樣品b#試劑盒提取法，3為樣品a#改良″苯酚-氯仿″法，4為樣品b#改良″苯酚-氯仿″法具體實(shí)施方式實(shí)施例一Rela×GeneBloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng)(0.1-20ml)試劑盒(非離心柱，天根公司)方法提取實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法①.向300ul含抗凝劑的血液(血液樣品A)中加入750ul細(xì)胞裂解液CLA，顛倒混勻20次。②.12000rpm離心1min。倒棄上清，將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留2min,確保沉淀在管中。③.現(xiàn)配現(xiàn)用緩沖液FGA和ProteinseK的混合液(200ul緩沖液FGA+1.5ulProteinseK)④.加入200ul緩沖液FGA與ProteinaseK的混合液，立即上下劇烈震蕩或渦旋混勻至溶液無團(tuán)塊。⑤.65℃水浴10min，其間顛倒混勻數(shù)次。⑥.加入200ul異丙醇，上下顛倒混勻50次至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組DNA。⑦.12000rmp離心5min，倒棄上清。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保沉淀在管中。⑧.加入300ul70％乙醇，渦旋振蕩5s，12000rmp離心2min，倒棄上清。⑨.將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留至少5min，確保沉淀在管中。⑩.空氣干燥DNA沉淀直至所有的液體揮發(fā)干凈(至少5min)加入200ul緩沖液TB，低速渦旋5s，65℃加熱20min溶解DNA，其間輕彈數(shù)次助溶。另，取血液樣本B，按血樣樣本A的提取方法提取DNA。DNA純度及產(chǎn)量的檢測測定DNA樣本的OD260/OD280吸光度值，計算所提樣本的純度。DNA總量以O(shè)D260/OD280值為參考，DNA總量的計算公式為：DNA(μg/ml)＝OD260×50×稀釋倍數(shù)。DNA完整性檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測：配置1％的瓊脂糖凝膠，取3ulMarker,2ul提取的DNA，120V30min，凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果并成像,對提取DNA進(jìn)行完整性檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如說明書附圖圖1與表1-1、表1-2所示：表1-1實(shí)施例一方法對人類外周血液基因組DNA提取的純度及濃度結(jié)果表1-2實(shí)施例一方法對人類外周血液基因組DNA提取的純度及濃度結(jié)果上述常規(guī)方法/試劑盒提取參考方法的提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，現(xiàn)有提取方法存在著如下的諸多問題：①蛋白酶K消化時間一般至少需要幾個小時,耗時長；②異丙醇的反復(fù)抽提,一是污染DNA的程度增大,二是極易造成DNA的丟失；③因多次轉(zhuǎn)移,易造成樣本污染,這也是PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽性的重要原因；④分離后的DNA還要經(jīng)過乙醇沉淀純化,操作繁雜,工作量大；⑤純度沒有符合OD260/OD280＝1.8±0.1的要求，純度相對較低；⑥裂解的過程不夠完全徹底，從而導(dǎo)致所提取樣品中的DNA伴有大量的蛋白質(zhì)；⑦所提取得DNA在不同程度上有降解。實(shí)施例二本發(fā)明改良″苯酚-氯仿″法提取DNA實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法①吸取100ul成人靜脈血于1.5mlEP管中；②加入600ulTKM-2(with2.5％SDS)，上下顛倒混勻10次(TKM2配制見后表2)③再加入21ul6MNaCl溶液，上下顛倒混勻10次④最后加入300ul的Tris平衡酚-氯仿(Tris平衡酚與氯仿的體積比為1:1)，于臺式渦旋震蕩器上振蕩10s⑤于12000rpm條件下離心2min,緩慢吸取上清液(透明顏色)于另一支Ep管里(此步驟應(yīng)小心操作，為避免吸到苯酚，推薦使用100ml移液器吸取多次來實(shí)現(xiàn))⑥再加入與上清液等體積的異丙醇(V上清∶V異丙醇＝1∶1)，在臺式渦旋震蕩器上振蕩10s(加入異丙醇會出現(xiàn)絲狀或絮狀基因組DNA，應(yīng)該仔細(xì)觀察)⑦離心12000rpm/2min,棄掉上清液(注意：在極數(shù)的情況下沉淀可能會松弛，所以要緩慢倒上清液)⑧加入1ml70％乙醇，上下顛倒使沉淀懸浮起來。然后離心12000rpm/1min，棄掉上清液⑨重復(fù)上述的步驟⑧一次⑨Ep管倒置在干凈的吸水紙上停留1min，確保沉淀在管中⑩加100ul1×TEBuffer(含有RNA酶，詳見后表3)，表2：TKM-2Buffer配制物質(zhì)量濃度試劑名稱10mmol/mlTris-HCl(pH7.6)10mmol/mlKCl10mmol/mlMgCl22mmol/mlEDTA0.4mol/mlNaCl補(bǔ)充體系ddH2O表3：1×TEBuffer1L配制名稱體積(mL)1MTris-HClBuffer(pH7.6)10500mMEDTA(pH8.0)20ddH2O970Total1000注：1×TEBuffer與RNA酶的即1ml的1×TEBuffer+3ul的RNA酶DNA純度及產(chǎn)量的檢測測定DNA樣本的OD260/OD280吸光度值，計算所提樣本的純度。DNA總量以O(shè)D260/OD280值為參考，DNA總量的計算公式為：DNA(μg/ml)＝OD260×50×稀釋倍數(shù)。DNA完整性檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測：配置1％的瓊脂糖凝膠，取3ulMarker,2ul提取的DNA，120V30min，凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果并成像,對提取DNA進(jìn)行完整性檢測。采用改良″苯酚-氯仿″法對人類外周血液基因組DNA提取的結(jié)果如表4-1、表4-2所示：表4-1本發(fā)明改良″苯酚-氯仿″法對人血液樣品a#外周血液基因組DNA提取的純度及濃度結(jié)果表4-2本發(fā)明改良″苯酚-氯仿″法對對人血液樣品b#外周血液基因組DNA提取的純度及濃度結(jié)果由于DNA提取試劑盒操作較為繁瑣,且價格昂貴,同時不適用于大量的基因?qū)嶒?yàn)研究。而本發(fā)明提取方法無需使用DNA提取試劑盒，成本低廉；同時，較常規(guī)酚-氯仿抽提法提取DNA提取方法，操作方便，提取效果更好。本發(fā)明提供的改良苯酚-氯仿″法得到的DNA純度高，DNA含量顯著增加。實(shí)施例三本發(fā)明改良″苯酚-氯仿″法與試劑盒抽提法效果對比實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施例一和實(shí)施例二的提取方法，分別提取DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；檢測結(jié)果如說明書附圖2所示。在本研究中我們對傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法進(jìn)行改良加入SDS和NaCl來進(jìn)行細(xì)胞核膜的破裂使核內(nèi)DNA釋放，促使蛋白質(zhì)變性，同時抑制DNA酶活性防止DNA被降解；利用DNA和RNA在高濃度的NaCl溶液中溶解度的不同使其有效分離開來；苯酚-氯仿-異丙醇的反復(fù)抽提能夠?qū)⒓?xì)胞碎片等雜質(zhì)成分去除干凈，保證了DNA的純度。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無水乙醇沉淀并經(jīng)70％乙醇洗滌后的得到的DNA沉淀呈無色透明狀，易溶解。該法得到的基因組DNA質(zhì)量較好，電泳檢測幾乎看不到拖尾現(xiàn)象，并且點(diǎn)樣孔處比較干凈無發(fā)亮現(xiàn)象，表明樣本中蛋白得到很徹底地去除，不但DNA產(chǎn)量相對較高，同時能滿足下游實(shí)驗(yàn)的需要。當(dāng)前第1頁1 2 3