本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種用于構(gòu)建多樣品全長轉(zhuǎn)錄組混合文庫的方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)錄組測序(Transcr iptomesequencing)主要通過高通量測序研究特定組織或細胞在某個時期轉(zhuǎn)錄出來的mRNA。轉(zhuǎn)錄組測序可全面快速地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本及基因序列，可以用于研究基因結(jié)構(gòu)和基因功能、可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測等。

傳統(tǒng)的二代轉(zhuǎn)錄組測序由于其讀長短的特點，建庫時需要進行打斷，無法直接獲得單個RNA分子由5ˊ到3ˊ的全部序列。基于PacBio三代測序平臺的全長轉(zhuǎn)錄組測序，無需打斷，能夠直接讀取反轉(zhuǎn)錄的全長cDNA,能夠有效的獲取高質(zhì)量的單個RNA分子的全部序列，準確辨別二代測序無法識別的同源異構(gòu)體(isoform)、同源基因、超家族基因或等位基因表達的轉(zhuǎn)錄本。

目前已有的全長轉(zhuǎn)錄組建庫并不支持多樣品混合建庫流程，即使混樣建庫，也僅僅是將樣品混合到一起，測序數(shù)據(jù)并不能進行有效區(qū)分。在二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)中，是可以進行多樣品混合建庫的，但由于三代測序的全長轉(zhuǎn)錄組建庫并不需要進行打斷，按照二代建庫的方法添加標簽序列會非常繁瑣，因此，需要一種新的構(gòu)建多樣品全長轉(zhuǎn)錄組混合文庫的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建多樣品全長轉(zhuǎn)錄組混合文庫的方法，在逆轉(zhuǎn)錄過程中使用帶有鑒別標簽的引物分別對不同樣品中的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后將所述來自不同樣品中的cDNA混合并進行處理得到所述文庫。本發(fā)明的方法通過在逆轉(zhuǎn)錄引物中加入一段特異的標簽序列，使得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物帶上特有的標簽，在對不同樣品使用帶有不同標簽序列的引物逆轉(zhuǎn)錄以及后續(xù)PCR擴增后，都可通過該標簽來鑒別逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物初始來自于哪個樣品，從而實現(xiàn)混合樣品建庫。

優(yōu)選地，所述帶有鑒別標簽的引物按5’-3’的順序包括以下區(qū)段：擴增區(qū)序列、標簽區(qū)序列和Poly(A)錨定區(qū)序列，所述Poly(A)錨定區(qū)序列包括多個胸苷，所述標簽區(qū)序列為區(qū)別來自不同樣品的cDNA的特異性序列，所述擴增區(qū)序列為用于PCR擴增的序列。其中擴增區(qū)序列用于在逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增時擴增引物的錨定，Poly(A)錨定區(qū)序列用于錨定mRNA上的Poly(A)，標簽區(qū)序列用于區(qū)分樣品的來源。

優(yōu)選地，所述帶有鑒別標簽的引物的3’末端還依次包含核苷酸V和N，其中，V表示A、C或G，所述N表示A、T、C或G，并且所述帶有鑒別標簽的引物為滿足V和N的條件的所有序列的混合物。通過在引物3’末端加入V和N，使得逆轉(zhuǎn)錄的起始位點位于mRNA的Poly(A)的5’端，而不是Poly(A)中部或3’端，減小了逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的無效長度。

優(yōu)選地，所述標簽區(qū)序列的長度為10-18nt，標簽區(qū)序列需要有合適的長度以保持其相互之間的特異性，以及與基因組序列之間的特異性。

具體地，所述方法包括以下步驟：

S1：使用所述帶有不同標簽的引物別對不同樣品中的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；

S2：取得自各樣品的cDNA等量混合；

S3：按片段大小篩選片段；

S4：PCR擴增所篩選的片段；

S5：向S4擴增的片段添加接頭；

S6：用核酸外切酶消化S5得到的片段，消化后純化DNA片段即得到所述文庫。

進一步地，S3篩選的片段的大小為0.5-10KB。

優(yōu)選地，S4PCR擴增時所用的混合cDNA的總量為0.1-10μg，該cDNA總量的設(shè)置有助于將PCR過程中的循環(huán)數(shù)限制在合理范圍。

優(yōu)選地，在S4PCR擴增后，S5添加測序接頭之前，還包括以下步驟：

S7：DNA損傷修復；

S8：末端修復。

優(yōu)選地，在S6后還包括S9：文庫質(zhì)檢，確定文庫大小。

本發(fā)明基于三代全長轉(zhuǎn)錄組建庫無需進行打斷的特征，在實驗開始的第一步-全長cDNA的擴增中引入標簽序列，加入標簽序列后即可進行混樣，有效的簡化了操作流程，節(jié)約了試劑耗材用量，降低了實驗成本，并且實現(xiàn)了在同一個文庫中進行多個樣本混合建庫的流程。

附圖說明

圖1為構(gòu)建多樣品轉(zhuǎn)錄組混合文庫的方法的流程圖；

圖2為帶有鑒別標簽序列的引物的示意圖；

圖3為單個樣品PCR擴增后的安捷倫2100檢測圖；

圖4為混合樣品片段篩選后PCR擴增的安捷倫2100檢測圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

對植物不同的6個組織-根、木質(zhì)莖、樹皮、葉、花、果實分別提取總RNA后進行混合文庫構(gòu)建，建立三個文庫，1-1.5kb，1.5-2kb，2-6kb，采用PACBIO RSII分別各測序1個cell，流程圖如圖1所示。具體實驗過程如下：

1.合成帶標簽的cDNA

本步操作在無RNase的超凈臺中進行，不同組織樣本分開單獨操作，且每個樣本對應(yīng)的標簽是唯一無重復的，本次實驗使用的逆轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，具體序列如表1所示。

表1逆轉(zhuǎn)錄使用的帶標簽的引物

1)將6個0.2mL的PCR管置于冰上，加入以下試劑：樣品1-6的總RNA1μg(按濃度換算體積)、帶標簽的引物(12μM，BC1-BC6)1μL、無核酸酶水補充至4.5μL。

2)輕柔渦旋混勻，瞬時離心，置于PCR儀上，運行如下程序：72℃3min，42℃2min，72℃到42℃降溫速率設(shè)置為0.1℃/s；

3)上述反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物添加至表2所示的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，輕柔渦旋混勻，瞬時離心，在PCR儀上運行如下程序：42℃90min，70℃10min；

表2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

4)單樣品的PCR擴增

取新的1.5mL EP管，按表3配制PCR體系，充分混勻，瞬時離心，PCR程序為：98℃2min；98℃20s、65℃30s、72℃3.5min，15循環(huán)；72℃5min。反應(yīng)完成后按照AMPure PB磁珠的操作說明使用1倍體積的磁珠進行純化，最后加入11μL的無核酸酶水洗脫；取1μL純化產(chǎn)物，使用無核酸酶水稀釋10倍，取2μL稀釋液進行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物的濃度與總量；取1μL稀釋液進行安捷倫2100檢測，確定片段的大小分布。如圖3所示，所有PCR產(chǎn)物的安捷倫2100檢測片段分布非常一致，片段大小分布由0.7K-5K，其主峰在1.8K。

表3單樣品PCR擴增體系

2.等量混樣

根據(jù)Qubit定量結(jié)果，每個樣本各取500ng的PCR產(chǎn)物進行混樣，混樣后的PCR產(chǎn)物總量為3μg。

3.BluePippin片段篩選

按照Bluepippin的操作說明進行目的片段的篩選，本次篩選的片段范圍為1-1.5KB、1.5-2KB、2-6KB；篩選完成后按照AMPure PB磁珠的操作說明使用1倍體積的磁珠進行純化，最后加入20μL的無核酸酶水洗脫。

4.混合樣品的PCR擴增放大

按表4配制PCR體系，2)充分混勻，瞬時離心，進行如下PCR程序：98℃2min；98℃20s、65℃30s、72℃Zmin，X循環(huán)；72℃5min。其中，1-2K的延伸時間為2min，6循環(huán)；2-3K的延伸時間為3min，8循環(huán)；3-6K的延伸時間為5min，8循環(huán)。反應(yīng)完成后使用1倍體積的AMPure PB磁珠進行純化，最后使用37uL的無核酸酶水進行洗脫；使用安捷倫2100檢測篩選后擴增的PCR產(chǎn)物長度分布，結(jié)果如圖4所示，其第一個峰為擴增的1-1.5K的PCR產(chǎn)物，第二個峰為擴增的1.5-2K的PCR產(chǎn)物，第三個峰為擴增的2-6K的PCR產(chǎn)物，表明擴增片段大小與篩選范圍一致。

表4混合樣品PCR體系

5.DNA損傷修復

按表5配制DNA損傷修復體系，充分混勻，瞬時離心，37℃孵育20min，置于冰上。

表5DNA損傷修復體系

6.末端修復

按表6配制DNA損傷修復體系，充分混勻，瞬時離心，25℃孵育5min；使用1倍體積的AMPure PB磁珠進行純化，最后使用31uL的無核酸酶水進行洗脫。

表6末端修復體系

7.連接接頭

按表7配制接頭連接體系，充分混勻，瞬時離心，25℃孵育15min，65℃孵育10min使連接酶失活。

表7接頭連接體系

8.核酸外切酶消化

按表8配制核酸外切酶消化體系，充分混勻，瞬時離心，37℃孵育1h；孵育結(jié)束后使用1倍體積的AMPure PB磁珠進行純化，最后使用11μL的無核酸酶水洗脫。

表8核酸外切酶消化體系

9.文庫質(zhì)檢

取1μL文庫，稀釋5倍，取2μL稀釋液進行Qubit定量，計算文庫濃度；取1μL稀釋液進行2100檢測，確定文庫大小。

10上機測序

根據(jù)文庫質(zhì)檢的結(jié)果，按照PacBio測序的操作說明對1-1.5KB、1.5-2KB、2-6KB的混樣文庫分別進行上機測序，三個混樣文庫各測序1個芯片；

對測序結(jié)果進行分析，混樣文庫不同barcode的全長轉(zhuǎn)錄本識別比例差異誤差在±30％以內(nèi)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。