本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及用于胰腺癌臨床預(yù)后診斷的分子標(biāo)記物在預(yù)后診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是一種消化道常見腫瘤，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查，胰腺癌位居歐美等發(fā)達(dá)國家惡性腫瘤死亡率第四位，全球每年約250萬人死于胰腺癌。近20年來我國胰腺癌的發(fā)病率持續(xù)增高，目前胰腺癌位居惡性腫瘤死亡率第五位。在胰腺癌的治療中，早期診斷困難，其起病隱匿，缺乏典型臨床癥狀，且預(yù)后極差，胰腺癌侵襲性強(qiáng)，惡性度高，外科手術(shù)、化療及放療等手段的療效均不盡人意，其術(shù)后1年生存率不到20％，5年生存率僅為4％，早期確診率低和術(shù)后轉(zhuǎn)移是胰腺癌死亡率高的主要原因。因此，胰腺癌的早期診斷和早期治療是提高和改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵，尤其是發(fā)現(xiàn)一種特有的、可用于早期診斷和預(yù)后的標(biāo)記物和靶向分子，對于戰(zhàn)勝胰腺癌具有重要意義，成為目前國內(nèi)外腫瘤專家的研究熱點(diǎn)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在癌癥疾病的相關(guān)研究中，越來越多的非編碼基因或非編碼RNA被報(bào)道，如lncRNA、micRNA、假基因等。非編碼RNA(ncRNAs)是一類具有重要生物學(xué)功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。越來越多的權(quán)威研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進(jìn)腫瘤的作用。目前己有較多l(xiāng)ncRNAs被證實(shí)在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達(dá)并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。假基因則是一段具有與正常功能基因相似的序列，但是與正常的基因存在結(jié)構(gòu)上的差異。這些差異包括在不同部位上程度不等的核苷酸缺失或插入，在基因內(nèi)含子和外顯子連接區(qū)發(fā)生序列變化，在編碼序列當(dāng)中含有終止密碼子，或在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)出現(xiàn)缺陷等。這些變化使此類基因不能轉(zhuǎn)錄翻譯，或者產(chǎn)生有缺陷的蛋白質(zhì)從而失去原有的生物學(xué)功能。長期以來，人們認(rèn)為假基因是貌似正常、卻沒有功能的“死亡基因”，是基因組進(jìn)化的“化石記錄”。但是近年來，關(guān)于假基因的討論日益增多，越來越多的試驗(yàn)證實(shí)假基因能夠轉(zhuǎn)錄并且表達(dá)。假基因在基因表達(dá)調(diào)控、基因組進(jìn)化等方面發(fā)揮著重要作用。對于胰腺癌這類發(fā)病隱匿、進(jìn)展快且預(yù)后極差的疾病，更需要使用準(zhǔn)確、靈敏、特異性強(qiáng)的標(biāo)記物來輔助胰腺癌的診斷或預(yù)后，lncRNAs或者假基因表達(dá)分析研究或許可以幫助我們發(fā)現(xiàn)一些新的生物標(biāo)記物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供用于胰腺癌預(yù)后診斷的分子標(biāo)記物。本發(fā)明的還一目的是提供所述的胰腺癌預(yù)后診斷分子標(biāo)記物在制備胰腺癌預(yù)后診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供用于胰腺癌臨床預(yù)后診斷的分子標(biāo)記物，所述分子標(biāo)記物為LOC100271722(NR_027036.1,lncRNA)、LOC100302650(NR_028308.1,lncRNA)和PI4KAP1(NR_003563.1,pseudogene)中的一種或多種基因。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述的分子標(biāo)記物在制備胰腺癌預(yù)后診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述預(yù)后為監(jiān)測、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。優(yōu)選的，所述試劑包括檢測所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因表達(dá)量的寡聚核苷酸片段；所述試劑盒為檢測所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因表達(dá)量的試劑盒。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種用于胰腺癌預(yù)后診斷的試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因的引物序列。優(yōu)選的，所述引物序列包括：LOC100271722的引物對：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；LOC100302650的引物對：SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；PI4KAP1的引物對：SEQIDNO.5和SEQIDNO.6中的一組或多組。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：(1)組織樣本或血液中總RNA提取試劑：Trizol、氯仿、異丙醇和75％乙醇等。(2)反轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制劑和T重復(fù)寡核苷酸OligodT。(3)定量PCR試劑：PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs組成的SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，引物和RNaseFreeH2O。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了檢測受試者樣本中LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因表達(dá)量的寡聚核苷酸片段在制備胰腺癌預(yù)后試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，利用所述的寡聚核苷酸片段檢測LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因表達(dá)量來進(jìn)行受試者預(yù)后評估的方法為：確定來自受試者治療前的樣本中所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因表達(dá)量以獲得第一值，對受試者施用癌癥治療，確定在其后由受試者獲得的后續(xù)樣品中所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因的表達(dá)量以獲得治療值，將所述第一值與所述治療值相比較，當(dāng)所述治療值低于第一值時(shí)，指示所述受試者預(yù)后不良。優(yōu)選的，當(dāng)所述治療值低于第一值35％以上時(shí)，指示所述受試者胰腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。優(yōu)選的，所述樣本選自組織、血液、血漿、血清、胰腺分泌物和胰腺細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了與胰腺癌相關(guān)的基因LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1，并進(jìn)一步證實(shí)上述的一種或多種基因可以作為胰腺癌預(yù)后診斷的分子標(biāo)記物。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記物監(jiān)測胰腺癌預(yù)后，不僅精確度大大提高，同時(shí)對后續(xù)臨床研究的開展具有指導(dǎo)意義。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行胰腺癌的生存分析，篩選3個(gè)候選基因：LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1，現(xiàn)有研究中并沒有關(guān)于上述基因和胰腺癌相關(guān)的報(bào)道。進(jìn)一步，發(fā)明人對于從確診的胰腺癌患者采集的血液樣本作為待測樣品進(jìn)行研究，通過使用RNA提取和定量PCR對胰腺癌患者血液中上述基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)合胰腺癌患者的跟蹤隨訪資料，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示上述基因與胰腺癌患者預(yù)后有密切的關(guān)系。上述基因的表達(dá)與胰腺癌患者的生存狀況有一定的相關(guān)性。提示上述基因可能具有很好的輔助診斷價(jià)值，可成為胰腺癌標(biāo)志物。LOC100271722(longintergenicnon-proteincodingRNA899，長鏈非編碼蛋白RNA899，lncRNA,又名LINC00899)，位于第22號染色體上。LOC100302650(又名BRE-AS1，全稱BREantisenseRNA1，lncRNA)，位于第2號染色體上。PI4KAP1(phosphatidylinositol4-kinasealphapseudogene1，磷脂酰肌醇4-激酶α假基因1，假基因)，位于第22號染色體上。PI4KA(phosphatidylinositol4-kinasealpha磷脂酰肌醇4-激酶α)為一種編碼蛋白，催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，是一種不被腺苷抑制的Ⅲ型酶，與其相關(guān)的途徑有代謝和皮代謝。本發(fā)明所述的基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息可以在Genbank中查到，來源于人類基因組。本發(fā)明采用RT-PCR方法檢測上述基因在胰腺癌患者生物學(xué)樣品中的表達(dá)情況。熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。在本發(fā)明中，“預(yù)后”是指癌癥患者在通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結(jié)果。預(yù)后可以是通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時(shí)的生機(jī)狀態(tài)。預(yù)后可以通過檢查標(biāo)志物來評估，所述的標(biāo)記物選自LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種基因。預(yù)后評估可以這樣進(jìn)行：根據(jù)標(biāo)志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。實(shí)施例1基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因1、臨床信息篩選檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌患者臨床信息，截至2015年12月10日，TCGA數(shù)據(jù)庫中總共記載了185例胰腺癌臨床病例。對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，共有160例患者納入研究。篩選時(shí)排除具有其他惡性腫瘤病史、曾接受過放療或化療的患者，同時(shí)納入研究的患者需含臨床信息和mRNA數(shù)據(jù)。2、生存期研究樣本統(tǒng)計(jì)160例胰腺癌患者生存時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表所示:表1160例胰腺癌患者生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)生存期時(shí)間t(年)期初進(jìn)入研究人數(shù)期內(nèi)死亡人數(shù)期內(nèi)失訪人數(shù)t<116027741≤t<25922152≤t<3221023≤t<410224≤t<560.15≤t5413、mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)生存分析研究方案(1)對胰腺癌高通量mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索、數(shù)據(jù)下載及樣本挑選和歸類。由下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析篩選得出與胰腺癌生存時(shí)間相關(guān)的mRNA。(2)用Cytoscape軟件構(gòu)建由mRNAs組成的生物信息網(wǎng)絡(luò)，通過DAVID對生物信息網(wǎng)絡(luò)中與胰腺癌生存時(shí)間相關(guān)的mRNA進(jìn)行GO分析和Pathway分析。4、胰腺癌mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的生存分析結(jié)果將胰腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載后，去除readcount＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100個(gè)mRNA。提取mRNA基因表達(dá)量和胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫生存時(shí)間數(shù)據(jù)，采用survival包的coxph函數(shù)完成，經(jīng)單因素Cox回歸分析，篩選得到單因素Cox回歸中p值<0.05的mRNA有580個(gè)，包括328個(gè)風(fēng)險(xiǎn)性mRNA和252個(gè)保護(hù)性mRNA。為了更好的研究與生存時(shí)間相關(guān)的mRNA的功能，我們通過GORILLA和GeneCodis軟件對胰腺癌生存時(shí)間相關(guān)的mRNA進(jìn)行GO功能富集合KEGG通路富集，篩選標(biāo)準(zhǔn)皆為FDR<0.05。篩選出3個(gè)基因LOC100271722(P＝0.040，HR＝0.68，95％CI＝0.47-0.98)，LOC100302650(P＝0.027，HR＝0.78，95％CI＝0.62-0.97)和PI4KAP1(P＝0.008，HR＝0.70，95％CI＝0.53-0.91)，均為保護(hù)性mRNA(HR<1)。實(shí)施例2胰腺癌臨床預(yù)后診斷分子標(biāo)記物的鑒定1、研究對象收集50例經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胰腺癌的患者，并對其進(jìn)行跟蹤隨訪。所有患者在經(jīng)過有效治療后均未再進(jìn)行任何其他輔助治療?；颊邩颖緛碓从诒本﹨f(xié)和醫(yī)院就診的胰腺癌患者，所有收集的患者均經(jīng)過有效治療，臨床資料及隨訪資料完整。首先采集50例胰腺癌患者治療前的血液，檢測血液中基因的相對表達(dá)量，結(jié)合跟蹤隨訪的預(yù)后信息研究LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。然后選取其中5例在有效治療后的第三年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的胰腺癌患者，研究其在治療前后以及治療后三年中相應(yīng)基因表達(dá)量的變化情況。對該5例胰腺癌患者需在其治療結(jié)束后的每年定期采集血液一次。本研究的所有臨床樣本，均對患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。2、試驗(yàn)方法2.1對血液樣本進(jìn)行RNA提取采用TrizolLS(Invitrogen:10296-010)對采集的血液樣本進(jìn)行RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)的具體操作如下：取收集到的新鮮血液，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10,000rpm離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。(1)入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；(2)加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫放置3-5分鐘；(3)12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的界面。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；(4)12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下8000rpm離心2分鐘；(5)棄去乙醇液體，室溫下放置2分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；(6)用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。2.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，具體操作為：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.4Real-TimePCR2.4.1引物設(shè)計(jì)采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，基因序列參照LOC100271722(NR_027036.1,lncRNA)、LOC100302650(NR_028308.1,lncRNA)和PI4KAP1(NR_003563.1,pseudogene)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表2所示：表2引物序列2.4.3具體操作過程(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，Tm退火45sec，72℃延伸35sec)×40個(gè)循環(huán)，具體Tm參照表2。表3RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別對目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。3、數(shù)據(jù)處理ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，計(jì)算基因在胰腺癌患者血液樣本中的相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)應(yīng)用采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、結(jié)果分析4.1LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1表達(dá)與胰腺癌預(yù)后通過對50例胰腺癌患者的跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后>1年和預(yù)后≤1年的患者LOC100271722平均表達(dá)水平分別為(5.72±0.76)和(4.34±0.21)，平均生存時(shí)間分別為(23.12±2.13)個(gè)月、(10.23±1.32)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)后>1年和預(yù)后≤1年的患者LOC100302650平均表達(dá)水平分別為(7.67±0.84)和(3.78±0.63)，平均生存時(shí)間分別為(21.24±1.83)個(gè)月、(9.28±1.47)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)后>1年和預(yù)后≤1年的患者PI4KAP1平均表達(dá)水平分別為(8.84±0.94)和(6.49±0.23)，平均生存時(shí)間分別為(22.12±2.53)個(gè)月、(9.48±1.52)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1表達(dá)水平高的患者平均生存時(shí)間明顯高于LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1表達(dá)水平低的患者。提示LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1可以作為判斷胰腺癌預(yù)后的重要參考指標(biāo)。4.25例胰腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者血液中基因的表達(dá)量變化LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1在5例胰腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者血液中的表達(dá)量變化結(jié)果如表4和表5所示。從表中的數(shù)據(jù)可以看出，LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1在治療后表達(dá)水平均顯著升高，同時(shí)在治療后的三年內(nèi)LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1的表達(dá)水平每年均在下降。治療后第3年5例胰腺癌患者均出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的情況，該年LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1的表達(dá)水平顯著下降并且均低于治療前的表達(dá)水平。表4LOC100271722在胰腺癌患者血液中的表達(dá)量變化表6LOC100302650在胰腺癌患者血液中的表達(dá)量變化表7PI4KAP1在胰腺癌患者血液中的表達(dá)量變化實(shí)施例3試劑盒的制備基于實(shí)施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述用于胰腺癌預(yù)后診斷的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴(kuò)增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一種或多種的引物對如表2所示，具體為：1、試劑盒1包括特異性擴(kuò)增LOC100271722的引物對；2、試劑盒2包括特異性擴(kuò)增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的引物對。和特異擴(kuò)增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；試劑盒還包括RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表7所示：表7PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，55℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個(gè)循環(huán)，72℃延伸15min。實(shí)施例4試劑盒監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)選取10例經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胰腺癌的患者，對其進(jìn)行跟蹤隨訪?；颊邩颖緛碓从诒本﹨f(xié)和醫(yī)院就診的胰腺癌患者，所有收集的患者均經(jīng)過有效治療，臨床資料及隨訪資料完整。首先采集10例胰腺癌患者治療后六周首次采集患者血液，檢測血液中相應(yīng)基因的表達(dá)量，以后每三個(gè)月檢測一次，跟蹤九個(gè)月，共檢測四次。利用實(shí)施例3所述的兩種試劑盒檢測10例胰腺癌患者血液中相應(yīng)基因的相對表達(dá)量。具體實(shí)施方法同實(shí)施例2。根據(jù)胰腺癌患者治療后6周、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月時(shí)血液樣本中相應(yīng)基因的相對表達(dá)量與治療前相比變化的水平來判斷胰腺癌患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。判斷標(biāo)準(zhǔn)定為：治療后基因的相對表達(dá)量與治療前相比下降大于或等于35％時(shí)，判斷為轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；治療后基因的相對表達(dá)量與治療前相比下降小于35％時(shí)，判斷為無進(jìn)展生存。兩種試劑盒的檢測判斷結(jié)果如表8和表9所示。同時(shí)，醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀判斷這10例患者治療9個(gè)月后是否轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的結(jié)果也列在表8和表9中。如下表所示：試劑盒1為包括特異性擴(kuò)增LOC100271722的試劑盒；試劑盒2為包括特異性擴(kuò)增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的試劑盒。試劑盒2中基因的相對表達(dá)量為LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1相對表達(dá)量的平均值。表8試劑盒1監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)結(jié)果患者編號6周3個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月臨床評價(jià)1升高23％升高20％升高22％升高19％無進(jìn)展生存2升高20％升高12％下降17％下降47％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)3升高24％升高20％升高21％升高18％無進(jìn)展生存4升高17％升高15％升高8％升高2％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)5升高25％升高23％升高20％升高19％無進(jìn)展生存6升高19％升高17％升高10％下降3％無進(jìn)展生存7升高21％升高10％升高2％下降50％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)8升高20％升高18％升高15％升高12％無進(jìn)展生存9升高22％升高9％下降22％下降62％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)10升高23％升高6％升高3％下降45％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)表9試劑盒2監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)結(jié)果患者編號6周3個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月臨床評價(jià)1升高18％升高16％升高12％升高11％無進(jìn)展生存2升高15％升高12％下降23％下降37％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)3升高19％升高17％升高19％升高18％無進(jìn)展生存4升高13％升高10％下降13％下降38％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)5升高17％升高13％升高8％下降5％無進(jìn)展生存6升高16％升高14％升高10％升高9％無進(jìn)展生存7升高17％升高10％下降12％下降54％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)8升高14％升高15％升高13％升高10％無進(jìn)展生存9升高18％升高13％下降2％下降52％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)10升高12％升高7％下降3％下降40％轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)由表8和表9可知，臨床診斷結(jié)果顯示10例胰腺癌患者中有5例治療后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，5例無進(jìn)展生存。試劑盒1檢測的結(jié)果顯示10例胰腺癌患者中有4例治療后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，6例無進(jìn)展生存。其中編號為4的患者試劑盒檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果有誤；試劑盒2檢測結(jié)果顯示10例胰腺癌患者中有5例治療后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，其余5例無進(jìn)展生存，試劑盒檢測結(jié)果與臨床診斷一致。據(jù)此推斷，試劑盒2比試劑盒1檢測準(zhǔn)確性更高。并且使用本發(fā)明的試劑盒監(jiān)控胰腺癌，可早于臨床癥狀和體征發(fā)現(xiàn)，為醫(yī)生提前進(jìn)行干預(yù)提供參考。綜上所述，LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的一種或多種基因可以作為診斷和預(yù)示胰腺癌的標(biāo)記物，并且同時(shí)檢測多個(gè)標(biāo)記物的準(zhǔn)確性高于檢測單一標(biāo)志物。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>北京致成生物醫(yī)學(xué)科技有限公司<120>胰腺癌預(yù)后診斷分子標(biāo)記物<130>P16yxa70<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1cccaagaatgacccagcac19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2catcccggttcccacgaa18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3cctgttacgtgaggctgtg19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4aaaggtgctgctgtccaa18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5cggctgcgtgaagacata18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6caaactcccgctggtaaaa19<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>7ggagtccactggcgtctt18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>8ggagtccactggcgtctt18當(dāng)前第1頁1 2 3