本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肺炎克雷伯氏菌的特異基因的新用途，具體是將其應(yīng)用于建立肺炎克雷伯菌檢測(cè)技術(shù)方法中。

背景技術(shù)：

肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）為革蘭陰性桿菌，病變中滲出液粘稠而重，致使葉間隙下墜。細(xì)菌具有莢膜，在肺泡內(nèi)生長(zhǎng)繁殖時(shí)，引起組織壞死、液化、形成單個(gè)或多發(fā)性膿腫。病變累及胸膜、心包時(shí)，可引起滲出性或膿性積液。病灶纖維組織增生活躍，易于機(jī)化；纖維素性胸腔積液可早期出現(xiàn)粘連。

肺炎克雷伯菌是臨床分離及醫(yī)院感染的重要致病菌之一，隨著β-內(nèi)酰胺類及氨基糖苷類等廣譜抗菌素的廣泛使用，細(xì)菌易產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶（AmpC酶）以及氨基糖苷類修飾酶（AMEs），對(duì)常用藥物包括第三代頭孢菌素和氨基糖苷類呈現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥性。肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染率近期逐年增高，且多耐藥性菌株的不斷增加常導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療的失敗和病程遷延。因此，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出肺炎克雷伯菌就顯得尤為重要。

目前臨床應(yīng)用的肺炎克雷伯菌的檢測(cè)方法包括細(xì)菌分離鑒定、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法等，但這些方法都存在一些缺陷。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要采用細(xì)菌前增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察和一系列的生化鑒定以及血清型鑒定等步驟，一般需4至7天，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力；免疫學(xué)方法易污染，且交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽(yáng)性多、靈敏度偏低。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些病原菌保守的核酸序列，在此基礎(chǔ)上建立了眾多的檢測(cè)技術(shù)。其中主要有核酸探針檢測(cè)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)、LAMP和PCR技術(shù)，這些方法因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、省時(shí)等特點(diǎn)已越來越多的被應(yīng)用于微生物鑒定中。

本發(fā)明利用生物信息學(xué)尋找出肺炎克雷伯菌特異基因，并針對(duì)其設(shè)計(jì)特異引物，分別建立了PCR和LAMP兩種肺炎克雷伯菌的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出肺炎克雷伯菌的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明目的是提供一種肺炎克雷伯菌的特異基因的新用途，即其在檢測(cè)肺炎克雷伯菌中的應(yīng)用，該肺炎克雷伯菌特異基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；本發(fā)明通過生物信息學(xué)手段獲取用于鑒定肺炎克雷伯菌的基因，該基因?yàn)閔ypothetical protein，基因名KPHS_07150，Genbank登陸號(hào)為NC_016845.1（754461..754838），該基因?yàn)榉窝卓死撞赜?，與其他物質(zhì)無明顯相似性，具有種間特異，種內(nèi)共有的特性。

本發(fā)明另一目的是提供檢測(cè)肺炎克雷伯菌引物，其包括引物B3、引物F3，各引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明另一目的是提供檢測(cè)肺炎克雷伯菌引物，其包括外游引物B3、外游引物F3、內(nèi)游引物BIP、內(nèi)游引物FIP，各引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

1、上述肺炎克雷伯菌特異基因，經(jīng)由基于基因組的本地BLAST及篩選，并進(jìn)行在線BLAST分析重確認(rèn)而獲得，為hypothetical protein，基因名KPHS_07150，Genbank登陸號(hào)為NC_016845.1（754461..754838）區(qū)段；

2、PCR技術(shù)的檢測(cè)方法

本發(fā)明針對(duì)特異基因設(shè)計(jì)特異引物，所設(shè)計(jì)的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 所示，進(jìn)行PCR反應(yīng)的特異性檢測(cè)，并構(gòu)建了特異基因的陽(yáng)性質(zhì)粒，分別做了陽(yáng)性質(zhì)粒和基因組的靈敏度實(shí)驗(yàn)。實(shí)現(xiàn)了特異并高靈敏度檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的目的。

3、LAMP技術(shù)的檢測(cè)方法

本發(fā)明針對(duì)特異基因設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物，包括一對(duì)外游引物和一對(duì)內(nèi)游引物，即外游引物B3、外游引物F3、內(nèi)游引物BIP、內(nèi)游引物FIP，使用isothermal mastermix試劑分別做了基因組的特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)，特異并高靈敏度地?cái)U(kuò)增出靶序列。

本發(fā)明的有益效果為：針對(duì)肺炎克雷伯菌的特異基因設(shè)計(jì)特異引物，該引物可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)肺炎克雷伯菌。

附圖說明

圖1為本發(fā)明PCR鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，泳道1至泳道6的反應(yīng)模板為部分肺炎克雷伯菌的基因，泳道7至泳道10依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、藤黃微球菌；

圖2為本發(fā)明LAMP鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，管1到管4的反應(yīng)模板為部分肺炎克雷伯菌的基因，管5到管8依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌；

圖3為本發(fā)明PCR鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中圖a為陽(yáng)性質(zhì)粒的靈敏度結(jié)果，圖b為菌液的靈敏度結(jié)果；

圖4為本發(fā)明LAMP鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中管1為陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板的陽(yáng)性對(duì)照，管2到管7的反應(yīng)模板是直接裂解梯度稀釋后菌液，其濃度依次為10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰，管8為去核酸酶稅作為模板的陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。

實(shí)施例1：特異性靶基因篩選及引物設(shè)計(jì)

1、本地BLAST分析

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下載的肺炎克雷伯菌全基因組序列，對(duì)本地的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地BLAST檢索，獲取得到菌種各序列片段與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果。

2、特異性靶基因篩選

使用在線BLAST功能，使用2種策略確認(rèn)其菌種特異性和菌種鑒定可用性。一種策略為BLAST時(shí)排除目的菌種，結(jié)果顯示無任何相似序列者為目的菌種特異基因；第二種策略為BLAST時(shí)選擇在目的菌種內(nèi)進(jìn)行檢索，結(jié)果返回大量相似序列者是目的菌種的不同菌株共有序列。結(jié)合兩種策略，最終找出符合兩種策略標(biāo)準(zhǔn)的目的基因。

3、引物設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以hypothetical protein，基因名KPHS_07150，Genbank登陸號(hào)為NC_016845.1（754461..754838）設(shè)計(jì)特異引物。特異引物通過在線設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物工具Primer Explorer V5 software (https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)設(shè)計(jì)完成，包括一對(duì)外游引物和一對(duì)內(nèi)游引物，該引物用于LAMP技術(shù)檢測(cè)，其中外游引物還用作PCR反應(yīng)的上、下游引物，用于肺炎克雷伯菌的鑒定。

實(shí)施例2：檢測(cè)方法的建立

1、DNA的提取

（1）用北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：

1）取細(xì)菌培養(yǎng)液5mL，12，000rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清；

2）向留有菌體沉淀的離心管中加入500μL細(xì)胞懸浮液，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，37℃溫浴30分鐘；每隔10分鐘顛倒混勻數(shù)次；12，000rpm離心2分鐘，盡量吸凈上清；

3）向菌體沉淀中加入225μL緩沖液A，振蕩至菌體徹底懸?。?/p>

4）向管中加入6μLRNaseA溶液，振蕩15秒，室溫放置5分鐘；

5）向管中加入10μL蛋白酶K溶液，顛倒混勻；

6）加入25μL裂解緩沖液S，顛倒混勻；

7）加入250μL緩沖液B，振蕩10秒，70℃放置10分鐘。12，000rpm離心1分鐘，取上清放入一新管中，棄去沉淀；

8）加入250μL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時(shí)離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

9）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

10）向吸附柱中加入500μL緩沖液C，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

11）向吸附柱中加入700μL漂洗液W₂，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

12）向吸附柱中加入500μL漂洗液W₂，12，000rpm離30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。然后12，000rpm離心2分鐘；將吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

13）將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12，000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

（2）使用直接裂解液，其配方為：

溶液A：125mM NaOH、 1mM EDTA、0.1％ Tween 20；

溶液B：125mM HCl、10mM TrisHCl；

取步驟1）中獲得的菌體加入10μL 溶液A 65℃孵育10min，加入10μL 溶液B，混勻即可。

3、陽(yáng)性質(zhì)粒載體構(gòu)建及獲得

（1）靶序列PCR擴(kuò)增

以肺炎克雷伯菌的基因組DNA為模板，對(duì)特異基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；

（2）目的產(chǎn)物的回收

從脂糖凝膠中切下目的片段，用北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司的小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：

1）將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)放入干凈的離心管中，稱取重量；

2）向膠塊中加入2倍體積溶膠液，55℃水浴10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；

3）將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

4）向吸附柱中加入700μL漂洗液W₂，12，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

5）向吸附柱中加入50μL漂洗液W₂，12，000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

6）將吸附柱放入收集管中，12，000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液；

7）將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。將吸附柱放入一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30μL的洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘。12，000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液。

（3）連接、轉(zhuǎn)化及篩選

1）大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

①挑取單個(gè)DH5α菌落，接種于3mL不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩2小時(shí)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物；

②將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)50mL預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻；

③于4℃下4100rpm離心10分鐘，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置l分鐘以使殘留的培養(yǎng)基流盡；

④每50mL初始培養(yǎng)液且30mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶(80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)重懸細(xì)胞沉淀；

⑤于4℃下4100rpm離心10分鐘，吸出上清液，并將管倒置l 分鐘以使殘留的液體流盡。

⑥每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后備用。

2）連接到PMD19-T Simple

①在微量離心管中加入1μL Takara pMD19-T simple載體、4μL目的基因基因PCR產(chǎn)物及5μL的連接酶緩沖混合物；

②16℃反應(yīng)過夜。

3）轉(zhuǎn)化DH5α

①全量(10μL)加入至100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；

②42℃加熱90秒后，再在冰中放置1分鐘；

③加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μL，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘；

④取200μL涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16h以形成單菌落。

（4）陽(yáng)性克隆的篩選

挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)4h，以M13F（5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'） 和M13R（5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'）為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外觀察，將經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

（5）陽(yáng)性質(zhì)粒提取

挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)4h，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件同前述最優(yōu)反應(yīng)條件。將經(jīng)PCR確證的陽(yáng)性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，160 rpm培養(yǎng)過夜。取每個(gè)菌株過夜培養(yǎng)液5mL，用北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司小量質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，具體操作步驟如下：

1）取5mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12，000rpm離心1分鐘，盡量吸除上清；

2）向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；

3）向離心管中加入250μL溶液2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解；

4）向離心管中加入350μL溶液3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，即出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12，000rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12，000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

5）向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12，000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

6）向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12，000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

7）將吸附柱放入收集管中，12，000rpm離心2分鐘，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

8）將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加60μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12，000rpm離心1分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

（6）陽(yáng)性質(zhì)粒濃度測(cè)定

打開Thermo Scientific BioMate 3S紫外分光光度計(jì)，預(yù)熱15分鐘；選定Mode方式為dsDNA，將比色杯用超純水反復(fù)洗幾次后加入60μL TE緩沖液調(diào)零；將TE緩沖液完全吸出，然后加入待測(cè)樣品(2μL樣品加入58μL TE緩沖液)，選定稀釋倍數(shù)為30倍進(jìn)行測(cè)定，讀取質(zhì)粒DNA濃度。

（7）質(zhì)粒數(shù)目換算及梯度稀釋

陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)完濃度后，分別根據(jù)其所測(cè)濃度換算成質(zhì)粒數(shù)目。質(zhì)粒數(shù)目換算公式為 (注：X為質(zhì)粒濃度ng/μL；Y為目的產(chǎn)物堿基對(duì)數(shù)；N_A為阿伏伽德羅常數(shù)；2692為載體堿基對(duì)數(shù)；660為堿基平均分子量)；取已知濃度的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋到底。

4、菌落計(jì)數(shù)

（1）菌液的培養(yǎng)

配制LB固體培養(yǎng)基，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌121℃，20min。將在-80℃冰箱中保藏的菌種接種于新鮮的MH液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12小時(shí)；

（2）稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)及其步驟

1）融化培養(yǎng)基；

2）制備平皿；

3）梯度稀釋法稀釋原菌樣品；

4）涂平皿：選取1/10⁶、1/10⁷、1/10⁸三個(gè)稀釋度計(jì)數(shù)，每皿取菌液0.1mL，用玻璃刮鏟涂布均勻，每個(gè)稀釋度做一個(gè)重復(fù)；

5）37℃倒置培養(yǎng)2天；

6）計(jì)數(shù)：每mL 原菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)（菌落形成數(shù)，CFU=（同一稀釋度平板上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/原菌樣品體積（mL）。

5、建立PCR鑒定體系

（1）PCR條件優(yōu)化

對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度為6個(gè)梯度，51、53、55、57、59、61℃；具體反應(yīng)體系為：2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL，10 μM的上游引物和下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0μL，加去核酸酶水補(bǔ)足25 μL。

（2）在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：

95℃ 5min；95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 20s, 33個(gè)循環(huán)；72℃ 1min。

（3）特異性檢測(cè)

收集肺炎克雷伯氏菌臨床分離株36株，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、藤黃微球菌各一株，使用試劑盒提取該41株菌的基因組，利用最優(yōu)的反應(yīng)條件進(jìn)行特異性檢測(cè)（圖1），圖中給出部分檢測(cè)結(jié)果，其中1-6泳道為6株不同的肺炎克雷伯氏菌臨床分離株，7-11泳道為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、藤黃微球菌，可見該方法可成功擴(kuò)增出肺炎克雷伯氏菌，特異性良好。

（4）靈敏度檢測(cè)

1）肺炎克雷伯菌陽(yáng)性質(zhì)粒靈敏度

用上述稀釋好的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為：2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL，10 μM的上游引物B3和下游引物F3各1.0 μL，模板DNA 1.0μL，加去核酸酶水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min；95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 20s, 33個(gè)循環(huán)；72℃ 1min。檢測(cè)結(jié)果如圖3a所示，該P(yáng)CR方法每反應(yīng)中可檢測(cè)出1拷貝模板，靈敏度高。

2）肺炎克雷伯菌菌液靈敏度

利用計(jì)數(shù)后的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋后并與小鼠血液按1:1體積混合，使用直接裂解液獲得基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為：2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL，10 μM的上游引物和下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0μL，加去核酸酶水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min；95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 20s, 33個(gè)循環(huán)；72℃ 1min。檢測(cè)結(jié)果如圖3b所示，該P(yáng)CR方法每個(gè)反應(yīng)中可檢測(cè)出1個(gè)細(xì)菌，靈敏度高。

5、建立LAMP鑒定體系

（1）LAMP反應(yīng)

在儀器Genie II中的反應(yīng)體系為：15 μL 2×isothermal mastermix，內(nèi)游引物BIP、內(nèi)游引物FIP各40 μM，外游引物B3、外游引物F3各5 μM，模板DNA 1.0μL，加去核酸酶水補(bǔ)足25 μL；反應(yīng)條件：65℃擴(kuò)增30min，98℃-80℃變性10min。

（2）特異性檢測(cè)

利用前述的41株菌的基因組進(jìn)行特異性檢測(cè)。經(jīng)紫外照射后，陽(yáng)性樣本可顯示明顯的綠色熒光，陰性樣本無明顯顏色。代表性結(jié)果見圖2，其中管1到管4的反應(yīng)模板為部分肺炎克雷伯菌的基因，管5到管8依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌。

（3）靈敏度檢測(cè)

利用計(jì)數(shù)后的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋后并與小鼠血液按1:1體積混合，使用直接裂解液獲得基因組作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)紫外照射后，陽(yáng)性樣本可顯示明顯的綠色熒光，陰性樣本無明顯顏色。結(jié)果見圖4，可見該環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法每個(gè)反應(yīng)中可檢測(cè)出1個(gè)細(xì)菌，靈敏度高。

序列表

<110>昆明理工大學(xué)

<120>一種肺炎克雷伯菌特異基因的應(yīng)用

<160> 7

<170>PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctccgggaca acgattgg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttaccggga tcatggaacc 20

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacgaacctc ggccttggtg ttttaacgcc agcctatctg aaac 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctggtcata cgacggtgac ggttttcgag gctgaccagg ttga 44

<210> 5

<211> 378

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌

<400> 5

atgcgtattt tatctctttt tttggtggtg ttcgctttaa caggctgctc cgggacaacg 60

attggcggta atgaagataa attaacgcca gcctatctga aacaacatct cattgtcgga 120

aaaaccacca aggccgaggt tcgtcagtat tttggtgccc cggattctgg tcatacgacg 180

gtgacggcgt cgggtaaaga gagctggtat tattcagtag ataaagggat caacctggtc 240

agcctcgcgg gttccatgat cccggtaacc ggggcatcgc aagctgccga tgcggtcgat 300

aagtccagcc aaaaagattc gaactcgctg atgattttct tcgatgaaaa aggcgtggtg 360

gaaaactggg tgcgttaa 378

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggaaacag ctatgacc 18