本發(fā)明涉及分子生物學、基因工程技術(shù)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及皮膚癌檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

皮膚癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，可大致分為惡性黑色素瘤和非黑色素瘤性皮膚癌，后者主要包括鱗狀細胞癌和基底細胞癌。皮膚癌嚴重者可危及生命，其發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為了一個全球性的公共健康問題。多種危險因素可導致皮膚癌的發(fā)生，包括內(nèi)源性因素(遺傳因素、基因突變等)和外源性因素(如紫外線暴露，化學致癌物質(zhì)和其他環(huán)境壓力)。早期診斷和治療，可以減少因該病所造成的死亡和畸型。然而，皮膚癌發(fā)生的確切分子機制仍不清楚，這嚴重的影響了對于該病的治療和預防。

活化T細胞核因子(NFAT)在活化的T細胞的核提取物中被認為是與白介素-2(IL-2)啟動子結(jié)合的誘導型核酸結(jié)合因子。NFAT可分布于細胞核和細胞質(zhì)。細胞核中NFAT作為活化蛋白1(AP-1)的轉(zhuǎn)錄因子。純化的NFAT是一個高度磷酸化的蛋白，能夠被鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin)去磷酸化。NFAT轉(zhuǎn)錄因子在很多脊椎動物的組織、器官的發(fā)育過程中起關(guān)鍵性的作用。此外，NFAT信號的失調(diào)與細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)展也密切相關(guān)。NFAT3屬于NFAT家族。已報道NFAT3作為Ras-JNK1/2-AP-1誘導的NIH-3T3細胞轉(zhuǎn)化的負調(diào)控因子。NFAT3在骨關(guān)節(jié)炎、乳腺癌細胞、非小細胞肺癌、嗜鉻細胞瘤細胞、膠質(zhì)瘤細胞系中的作用均有報道。NFAT3可以被p38MAPK磷酸化Ser168和Ser170以及被JNK1和JNK2磷酸化Ser213和Ser217位點。丙氨酸替換Ser168和Ser170可促進NFAT3的核轉(zhuǎn)運并增加NFAT3介導的轉(zhuǎn)錄活性，而JNK1和JNK2的磷酸化位點的突變抑制NFAT3轉(zhuǎn)錄活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新的磷酸化NFAT3突變體及其應用。

本發(fā)明提供了一種磷酸化NFAT3突變體，NFAT3的第259位由Ser突變?yōu)锳la。

一種所述的突變體在制備用于皮膚癌檢測的試劑上的應用。

一種皮膚癌檢測試劑盒，包括所述的突變體。

一種所述的突變體在制備用于抑制皮膚癌細胞增殖的試劑上的應用。

所述皮膚癌細胞是人皮膚鱗狀癌細胞A431。

本發(fā)明具有以下有益效果：NFAT3的Ser259位點的磷酸化影響皮膚癌細胞的增殖，具有抗癌應用價值，可用于靶向NFAT3的藥物研發(fā)以及皮膚癌檢測。

附圖說明

圖1是點突變后對人永生化表皮細胞HaCaT增殖影響圖，其中vector為空載體；

圖2為點突變對人永生化表皮細胞HaCaT軟瓊脂克隆形成影響圖；

圖3為點突變后對人皮膚鱗狀癌細胞A431增殖影響圖；

圖4為點突變對人皮膚鱗狀癌細胞A431平板克隆形成影響圖；

圖5為Ser259位磷酸化NFAT3在人正常皮膚和皮膚癌組織中表達情況的免疫熒光染色圖；

圖6為Ser259位磷酸化NFAT3在人正常皮膚和皮膚癌組織中表達情況的統(tǒng)計結(jié)果圖；

圖7為Ser259位磷酸化NFAT3在人正常皮膚和三種不同類型的皮膚癌組織中表達情況的統(tǒng)計結(jié)果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的說明。

下述實施方式中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用DNA引物均由Invitrogen合成；NFAT3表達質(zhì)粒pEGFP-C1-NFAT3購自Addgene；各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄酶購自Life Technologies公司；點突變試劑盒購自Agilent Technologies公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自HyClone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine購自Invitrogen公司；黑色素瘤細胞培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。人皮膚組織芯片購自Biomax?？贵w購自Santa Cruz。如無特別說明，本實施方式采用的其它試劑均為市售商品。

1.構(gòu)建表達野生型NFAT3和NFAT3-S259A突變體的慢病毒質(zhì)粒

將pEGFP-C1-NFAT3質(zhì)粒中NFAT3的編碼序列亞克隆至慢病毒表達載體pCDH-puro，獲得表達野生型NFAT3(NFAT3-wt)慢病毒質(zhì)粒，命名為pCDH-NFAT3。pEGFP-C1-NFAT3質(zhì)?？梢再徸訟ddgene，質(zhì)粒編號如#10961。pCDH-puro的序列如SEQ ID NO：3所示。

根據(jù)試劑盒Quick Change Lightning Site-directed Mutagenesis Kit(Agilent Life Sciences,Santa Clara,CA,USA)說明書設計上游引物NFAT-S259-F:gcccaccccagccGCCccgcggcctgc(SEQ ID NO:1)和下游引物NFAT-S259-R:gcaggccgcggGGCggctggggtgggc(SEQ ID NO:2)，以pCDH-NFAT3為模板，使用點突變試劑盒將NFAT3的259位Ser突變成Ala，獲得表達NFAT3-S259A突變體的慢病毒質(zhì)粒，命名為pCDH-NFAT3-S259A。

2.S259A點突變抑制NFAT3對人永生化表皮細胞HaCaT增殖的促進作用

100mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293T細胞至50％覆蓋率。將質(zhì)粒pCDH/Δ8.2/VSV-G按4：3：2的比例轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后6小時更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時后，收集培養(yǎng)上清，用0.45μm濾膜過濾，即可獲得空載體對照慢病毒或表達野生型NFAT3或NFAT3-S259A突變體的慢病毒。

在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人永生化表皮細胞HaCaT至90％-100％覆蓋率，細胞1：6傳至6孔板，按細胞懸液和慢病毒液1：1加入慢病毒感染細胞。細胞感染24h后更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選，用未感染病毒細胞作為篩選陰性對照。待嘌呤霉素篩選至未感染病毒細胞全部死亡，存活的感染病毒的細胞為穩(wěn)定株。命名為HaCaT-vector(此為用pCDH-puro參與構(gòu)建的慢病毒感染并用嘌呤霉素篩選過的HaCaT細胞)，HaCaT-NFAT3-wt(此為用過表達NFAT-wt的慢病毒，即pCDH-NFAT3參與構(gòu)建的慢病毒，感染后用嘌呤霉素篩選后的HaCaT細胞株)和HaCaT-NFAT3-S259A(此為用過表達NFAT-S259A的慢病毒，即pCDH-NFAT3-S259A參與構(gòu)建的慢病毒，感染后用嘌呤霉素篩選后的HaCaT細胞株)。

在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)穩(wěn)定株細胞HaCaT-vector，HaCaT-NFAT3-wt和HaCaT-NFAT3-S259A至90％-100％覆蓋率，消化收集細胞，按每孔2000個細胞的密度重新接種到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3d。分別在接種后0hr、24hrs、48hrs、72hrs時加入MTS，4hrs后檢測。細胞增殖結(jié)果如圖1所示，S259A點突變能夠抑制NFAT3對人永生化表皮細胞HaCaT增殖的促進作用。

3.S259A點突變抑制NFAT3對人永生化表皮細胞HaCaT軟瓊脂克隆形成的促進作用

將3％低熔點Agarose與兩倍體積的37℃完全培養(yǎng)基混合得到含有1％的Agarose。在六孔板每孔加入2ml 1％Agarose混合物，室溫靜置30分鐘至下層膠完全凝固。在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)穩(wěn)定株細胞HaCaT-vector，HaCaT-NFAT3-wt和HaCaT-NFAT3-S259A至90％-100％覆蓋率，消化收集細胞，將消化好的細胞調(diào)整密度至5000個/ml。取1ml細胞液與1ml含0.8％Agarose的混合物混合后將2ml混合物加入到下層膠已凝固的6孔板孔中。4℃靜置30分鐘后放入培養(yǎng)箱。14天后，用0.005％的結(jié)晶紫溶液對細胞進行染色，2小時候后用清水漂洗至能看到明顯的細胞克隆，晾干拍照。如圖2所示，S259A點突變能夠抑制NFAT3對人永生化表皮細胞HaCaT軟瓊脂克隆形成的促進作用。

4.S259A點突變抑制NFAT3對人皮膚鱗狀癌細胞A431平板克隆形成的促進作用

如上述實施方式相同的方法，用空載體對照慢病毒或表達野生型NFAT3或NFAT3-S259A突變體的慢病毒感染皮膚癌細胞A431，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定株，命名為A431-vector，A431-NFAT3-wt和A431-NFAT3-S259A，分別和空載體慢病毒、表達野生型NFAT3的慢病毒和表達NFAT3-S259A突變體的慢病毒對應，命名方式同上述HaCaT。

在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)穩(wěn)定株細胞A431-vector，A431-NFAT3-wt和A431-NFAT3-S259A至90％-100％覆蓋率，消化收集細胞，按每孔250個細胞的密度重新接種到6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)7d后，用2％的結(jié)晶紫溶液對細胞進行染色，15min后用清水漂洗，晾干。如圖3所示，S259A點突變可以抑制NFAT3對人皮膚鱗狀癌細胞A431平板克隆形成的促進作用。

5.S259A點突變顯著回復NFAT3對人皮膚鱗狀癌細胞A431在裸鼠皮下成瘤的能力的促進作用

在100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)穩(wěn)定株細胞A431-vector，A431-NFAT3-wt和A431-NFAT3-S259A至90％-100％覆蓋率，消化收集細胞。將5×10⁶穩(wěn)定株細胞注射到4周齡BALB/c裸鼠后腿靠近背部皮下，觀察腫瘤生長情況，并用游標卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積(mm³)的計算方法為長×寬×寬/2。如圖4所示，S259A點突變顯著回復NFAT3對人皮膚鱗狀癌細胞A431在裸鼠皮下成瘤的能力的促進作用。

6.人皮膚組織標本中Ser259位點磷酸化NFAT3的表達檢測和統(tǒng)計分析

人皮膚組織芯片SK801b經(jīng)脫蠟、梯度水化、抗原修復后，用5％羊血清室溫封閉1小時。NFAT3-S259磷酸化抗體4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2小時。用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照(代表性免疫熒光照片如圖5所示)，將照片轉(zhuǎn)變成8-bit灰度后，用ImageJ計算其平均灰度值。如圖6所示，NFAT3-S259磷酸化水平在皮膚癌(Cancer)組織中的表達顯著高于正常組織(Normal)對照。進一步根據(jù)組織類型將皮膚癌組織分為鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma),基底細胞癌(basal cell carcinoma)和黑色素瘤(malignant melanoma)，如圖7所示，在三種類型的腫瘤中，NFAT3-S259磷酸化表達水平均顯著高于正常組織，且在黑色素瘤中表達最高。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大學

<120> 磷酸化NFAT3突變體及其應用

<130> 16I23534

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> NFAT-S259上游引物序列

<400> 1

gcccacccca gccgccccgc ggcctgc 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> NFAT-S259下游引物序列

<400> 2

gcaggccgcg gggcggctgg ggtgggc 27

<210> 3

<211> 7377

<212> DNA

<213> pCDH-puro序列

<400> 3

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840

gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900

taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960

acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020

cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140

tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200

gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260

aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320

gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380

aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800

taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860

aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga 1920

tactagtatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1980

gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 2040

tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 2100

ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 2160

caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 2220

cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag attctagagc 2280

tagcgaattc gaatttaaat ggatccgcgg ccgcaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc 2340

gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca 2400

attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact 2460

ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga 2520

acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca 2580

tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg ttgagtcgcg 2640

ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa 2700

agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc 2760

ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg 2820

ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gctagatgac cgagtacaag 2880

cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac cctcgccgcc 2940

gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca catcgagcgg 3000

gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg 3060

gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg 3120

gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg 3180

cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg 3240

gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc 3300

cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc 3360

cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc 3420

gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagtcga caatcaacct 3480

ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg 3540

ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc 3600

attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt 3660

gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc 3720

attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg 3780

gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact 3840

gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt 3900

gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg 3960

gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc 4020

cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat 4080

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 4140

gctaattcac tcccaacgaa aataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 4200

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 4260

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 4320

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg 4380

tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa 4440

cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 4500

taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 4560

tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 4620

catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 4680

ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctagact tttgcagaga cggcccaaat 4740

tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 4800

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 4860

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 4920

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 4980

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 5040

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 5100

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 5160

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 5220

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 5280

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 5340

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 5400

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 5460

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 5520

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 5580

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 5640

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 5700

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 5760

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 5820

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 5880

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 5940

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 6000

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 6060

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 6120

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 6180

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 6240

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 6300

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 6360

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 6420

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 6480

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 6540

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 6600

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 6660

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 6720

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 6780

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 6840

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 6900

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 6960

aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 7020

ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 7080

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