本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微縮肽策略的抗菌肽WW及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素的濫用，導(dǎo)致了腸道微生態(tài)失衡、耐藥菌群產(chǎn)生、畜產(chǎn)品中抗生素殘留等嚴重的后果，對人類健康和環(huán)境保護帶來雙重風(fēng)險。各國對畜產(chǎn)品中抗生素殘留已實行了極為嚴厲的限量標(biāo)準，甚至禁用。這給我國畜產(chǎn)品的生產(chǎn)帶來巨大風(fēng)險，例如在“綠色貿(mào)易壁壘”下，頻現(xiàn)退關(guān)處理，經(jīng)濟損失巨大。因此，亟需尋找新型綠色、安全、高效的抗生素替代品。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs),普遍存在于幾乎所有生命機體的防御系統(tǒng)中。在古老的、非特異性的先天免疫系統(tǒng)中有抗菌肽參與，是生物體感染的初始階段的主要的防護機制?？咕耐ǔＳ?2-50個氨基酸殘基組成，分子量小于10kDa，大多數(shù)抗菌肽含有帶正電荷的氨基酸，具有兩親性和陽離子性，對多種細菌、真菌、病毒、寄生蟲甚至是癌細胞都有抑制作用，而且對機體自身的毒性非常低，極強的穩(wěn)定性有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)?？咕呐c抗生素具有不同的抑菌機制，前者以“溫和式”干擾多種生物性功能的發(fā)揮，而非高度特異性作用靶位點使其喪失功能，而后者傾向作用于菌體單一靶點。并且抗菌肽在動物體內(nèi)無殘留，對環(huán)境無污染，符合畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)的需要，適合在飼料生產(chǎn)過程中使用，具有作為新一代綠色飼料添加劑的潛質(zhì)。目前，對抗菌肽的開發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)在畜牧生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域廣泛開展。

但與傳統(tǒng)抗生素相比，天然抗菌肽與生產(chǎn)應(yīng)用還存在差距，活性低、細胞毒性高、生產(chǎn)成本高、半衰期短等缺陷不容忽視。因此人工設(shè)計抗菌肽或分子改造已有天然抗菌肽是高效抗菌制劑發(fā)展的有效途徑之一。但事實上關(guān)于抗菌肽的應(yīng)用上還有兩個不容忽視的問題：一方面經(jīng)改造后的抗菌肽仍保留母肽的痕跡，易存在免疫原性反應(yīng)，若長期使用，可能會抑制動物體自身抗菌肽的分泌，造成免疫系統(tǒng)功能紊亂；另一方面對于全新設(shè)計的抗菌肽，與受飼畜禽動物毫無關(guān)聯(lián)，理論上會存在排斥反應(yīng)，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，不利于畜禽健康和提高生產(chǎn)性能。

鑒于此，如何規(guī)避上述風(fēng)險，需要給予重視。以物種分類學(xué)與系統(tǒng)進化樹為依據(jù)，選擇親緣關(guān)系較遠的物種的抗菌肽為母板，進行微縮和適當(dāng)改造，以獲得抗菌活性強，溶血性低的新型抗菌肽，成為了一條有效的途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種基于微縮肽策略的抗菌肽WW及其制備方法和應(yīng)用；該抗菌肽活性較高而細胞毒性相對較低。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)實現(xiàn)：一種基于微縮肽策略的抗菌肽WW，序列如序列表SEQID No.1所示。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

1、如上所述的一種基于微縮肽策略的抗菌肽WW，其制備方法如下：

(1)以兩棲動物蛙皮膚分泌的dermaseptin家族為基礎(chǔ)，采用微縮肽策略，保留關(guān)鍵物理參數(shù)，由長肽縮短至13個氨基酸長度的抗菌肽；為提高肽的活性采用了中心對稱結(jié)構(gòu)、Trp的陽離子-π作用及其位于首基的錨定作用、C末端酰胺化等策略設(shè)計得到了抗菌肽WW，序列如序列表SEQ No.1所示；

(2)采用固相化學(xué)合成法通過多肽合成儀得到肽樹脂，將得到的肽樹脂經(jīng)過TFA切割后，得到兩條多肽；

(3)經(jīng)過反相高效液相色譜純化和質(zhì)譜鑒定后，即完成多肽的制備。

2、如上所述的一種基于微縮肽策略的抗菌肽WW，在制備治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

通過本方法制備的抗菌肽的實驗技術(shù)簡單，對得到的抗菌肽進行抗菌和溶血活性檢測，發(fā)現(xiàn)WW對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌，枯草芽孢桿菌、糞鏈球菌等菌種有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。綜上所述，WW是一種具有較高應(yīng)用價值的抗菌肽。

附圖說明

圖1為抗菌肽WW的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

抗菌肽的設(shè)計

以兩棲動物蛙皮膚分泌的dermaseptin家族為基礎(chǔ)，采用微縮肽策略，dermaseptin家族是由55條肽組成的，由APD數(shù)據(jù)庫檢索出來的，其抑菌活性均不低于100微摩；本設(shè)計首先根據(jù)dermaseptin家族的一些參數(shù)，進行設(shè)計，同時在WW中還加入必要的提高活性的設(shè)計，如引入兩末端加入Trp，對稱結(jié)構(gòu)等，WW雖是來源于此家族，但與55條母肽的特性相比，已有了明顯的不同，再用其與55母肽分別比對，則無可比性。為了說明其活性，我們用常見的抗菌肽蜂毒素作為對照，可以說明WW的設(shè)計是成功的。

保留關(guān)鍵物理參數(shù)如表1所示，由長肽縮短至13個氨基酸長度的抗菌肽；為提高肽的活性采用了中心對稱結(jié)構(gòu)、Trp的陽離子-π作用及其位于首基的錨定作用、C末端酰胺化等策略設(shè)計得到了WW抗菌肽，序列如表2所示。

表1不同來源肽的物理參數(shù)

表2衍生肽的氨基酸序列

WW的電荷數(shù)為+3，疏水值為-0.32。將肽WW的羧基末端酰胺化以提高一個正電荷并增加肽的穩(wěn)定性。

實施例2

固相化學(xué)合成法合成WW抗菌肽

1、抗菌肽的制備從C端到N端逐一進行，通過多肽合成儀來完成。首先將Fmoc-X(X是每個抗菌肽的C端第一個氨基酸)接入到Wang樹脂，然后脫去Fmoc基團后得到X-Wang樹脂；再將Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y為每個抗菌肽C端第二個氨基酸)；按照這個程序依次從C端合成到N端，直至合成完畢，得到脫去Fmoc基團的側(cè)鏈保護的樹脂；

2、在上述得到的肽樹脂中，加入切割試劑，20℃避光下反應(yīng)2h，過濾；沉淀TFA(三氟乙酸)洗滌，將洗液與上述濾液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再加入10倍左右體積的預(yù)冷無水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g離心10min，收集沉淀，再用無水乙醚洗滌沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割試劑由TFA、水和TIS(三異丙基氯硅烷)按照質(zhì)量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸鈉(磷酸調(diào)節(jié)至pH7.5)進行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，過濾，C18反相常壓柱，采用梯度洗脫(洗脫劑為甲醇和硫酸鈉水溶液按照體積比為30:70～70:30混合)，流速為1mL/min，檢測波為220nm，收集主峰，凍干；再利用反相C18柱進一步純化，洗脫液A為0.1％TFA/乙腈溶液；洗脫液B為0.1％TFA/水溶液，洗脫濃度為50％～90％B，洗脫時間為30min，流速為1mL/min，再同上收集主峰，凍干；

4、抗菌肽的鑒定：將上述得到的抗菌肽經(jīng)過電噴霧質(zhì)譜法分析，質(zhì)譜圖中顯示的分子量(如圖1所示)與表2中的理論分子量基本一致，抗菌肽的純度大于95％。

實施例3：抗菌肽抗菌活性的測定

1、抗菌活性的測定：將肽配置成為一定儲存液以備使用。利用微量肉湯稀釋法測定幾種抗菌肽的最小抑菌濃度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作為稀釋液，使用二倍稀釋法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔細胞培養(yǎng)板中，然后分別添加等體積的待測菌液(～10⁵個/mL)于各孔中。分別設(shè)置陽性對照(含有菌液而不含有抗菌肽)和陰性對照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒溫培養(yǎng)20h，以肉眼未見孔底部有混濁現(xiàn)象的即為最小抑菌濃度。檢測結(jié)果如表3所示。

表3抗菌肽的抑菌活性

通過表3可以看出，WW對于革蘭氏陰性和陽性菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，與蜂毒素ME26相比，WW抑菌活性略低于ME26，說明WW的設(shè)計獲得成功，且從理論上可避免出現(xiàn)免疫原性和異源排斥性的風(fēng)險。

2、溶血活性的測定：采集人的新鮮血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mL PBS溶液中，1000g離心5min，收集紅細胞；用PBS洗滌3遍，再用10mL PBS重懸；取50μL紅細胞懸液與50μL用PBS溶解的不同濃度的抗菌肽溶液混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育1h；l h后取出，4℃、1000g離心5min；取出上清液用酶標(biāo)儀在570nm處測光吸收值；每組取平均值，并比較分析。其中50μL紅細胞加50μL PBS作為陰性對照；50μL紅細胞加50μL0.1％Tritonx-100作為陽性對照。最小溶血濃度是抗菌肽引起5％溶血率時的抗菌肽濃度。檢測結(jié)果如表4所示。

表4抗菌肽溶血活性的測定

通過表4可以看出，WW在檢測范圍內(nèi)未表現(xiàn)出溶血活性，而對照ME26在0.25μM濃度時就表現(xiàn)出高的溶血活性。說明WW適合于在畜禽中的添加。

以上結(jié)果顯示，WW明顯縮短長度，降低了成本，其抗菌活性強，溶血性低。綜合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通過治療指數(shù)(溶血濃度與抑菌濃度的比值)來更全面的評價各個抗菌肽的生物學(xué)活性。由表4可以看出，WW具有較高的治療指數(shù)，表明設(shè)計得到的WW抗菌肽具有較高的替代抗生素的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>基于微縮肽策略的抗菌肽WW及其制備方法和應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Trp Trp Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Trp Trp-NH2

1 5 10 13