本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：底蛻膜，是與囊胚滋養(yǎng)層接觸的蛻膜，與滋養(yǎng)細胞一起構(gòu)成胎盤的母體部分，底蛻膜間充質(zhì)干細胞(DBMSC)作為一個母體間充質(zhì)干細胞的重要來源，能安全地用于母體治療免疫系統(tǒng)疾病。同時，由于其具有多向分化能力，使得底蛻膜間充質(zhì)干細胞也能用于自體或異基因的組織再生。然而，目前獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞的方法仍有待改進。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：目前常用的底蛻膜間充質(zhì)干細胞分離方法是將底蛻膜剪碎后直接用組織塊法培養(yǎng)；或用酶消化方法進行多次酶消化,很容易造成細胞的損傷，難以獲得大量且純度較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，酶消化處理過程中，酶的種類、用量、消化時間等因素顯著影響酶消化處理效果，尤其是酶的種類，進而影響底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率及活性。發(fā)明人經(jīng)深入研究發(fā)現(xiàn)，單一酶的消化效果不佳，難以獲得大量且純度較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞，而混合酶能夠有效地對底蛻膜進行消化，從而獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。進一步地，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的混合酶的消化效果最佳。為此，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：利用混合酶制劑將底蛻膜進行消化處理，得到消化產(chǎn)物；以及從所述消化產(chǎn)物中分離所述底蛻膜間充質(zhì)干細胞，其中，所述混合酶制劑包括：胰酶；膠原酶Ⅳ；以及膠原酶Ⅱ。利用消化處理方法，能夠?qū)⒌淄懩そM織中細胞之間的蛋白質(zhì)降解，從而分離出單個細胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，單一酶很難將底蛻膜消化完全，所得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞量較少，由此需要進行多次消化。但是，多次消化容易造成細胞的損傷，難以獲得大量且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。進而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用混合酶制劑進行消化的效果較好，且無需多次消化，以減少對細胞的損傷。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用包括胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的混合酶制劑進行消化，能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。然而，利用其他種類酶的效果不佳。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞的方法還可以具有下列附加技術(shù)特征：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述混合酶制劑包括：0.05質(zhì)量％～0.25質(zhì)量％的胰酶；1～2μg/mL的膠原酶Ⅳ；以及0.1質(zhì)量％的膠原酶Ⅱ。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的濃度顯著影響消化效率，進而影響底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率、純度及活性。在上述最優(yōu)濃度下，底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率、純度及活性較高。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，混合酶制劑中胰酶濃度可以為0.08質(zhì)量％、0.10質(zhì)量％、0.13質(zhì)量％、0.18質(zhì)量％或0.21質(zhì)量％。當(dāng)胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的濃度過高，將對底蛻膜間充質(zhì)干細胞造成損傷，使其活性下降，若胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ濃度過低，無法充分消化，從而使得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率及純度較低。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞的方法能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述混合酶制劑與底蛻膜的用量比為0.5～2:1，優(yōu)選1:1。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，混合酶制劑的添加量顯著影響消化處理效果，進而影響底蛻膜間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)率及活性。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)混合酶制劑與底蛻膜的用量比為0.5～2:1，優(yōu)選1:1時，能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。若添加量過多，容易造成細胞損傷，活性下降；若添加量過少，酶消化不充分，從而導(dǎo)致底蛻膜間充質(zhì)干細胞得率較低。在實際情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇消化處理條件，例如反應(yīng)溫度、時間，對此本申請不作嚴格限定，只要能夠得到底蛻膜間充質(zhì)干細胞即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述消化處理是在35-37℃的溫度、100～200rpm的轉(zhuǎn)速下震蕩30～60min。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述消化處理是在37℃的溫度、150rpm的轉(zhuǎn)速下震蕩30min。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在此條件下能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。其中，消化處理溫度顯著影響酶活性，溫度過高或過低都將造成酶活力過低，導(dǎo)致消化效率降低，所得到的細胞量較少；消化處理時間顯著影響酶活性，消化處理時間過長，會造成細胞損傷，使其活性降低，時間過短，酶消化不充分，所得到的細胞量較少。若震蕩時間過長，將破壞細胞的結(jié)構(gòu)，造成損傷。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，消化處理后，通過向消化反應(yīng)體系中加入胎牛血清(FBS)，以終止消化反應(yīng)。需要說明的是，對于從消化產(chǎn)物中分離底蛻膜間充質(zhì)干細胞的方法不作嚴格限定，只要能夠獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，為了得到純度較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞，所述分離包括：將所述消化產(chǎn)物進行稀釋及過濾，收集濾液；將所述濾液進行離心，棄上清，加入生理鹽水重懸并定容，得到細胞懸液；以及將所述細胞懸液加入裝有淋巴細胞分離液的離心管中，并將得到的混合液進行離心，收集所得到的離心液中的白膜層，以便獲得所述底蛻膜間充質(zhì)干細胞。由此，能夠有效地除去附著于細胞上的消化液，且避免對細胞造成損傷，從而獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將裁剪成尺寸為2cm×2cm的所述底蛻膜進行消化處理，得到消化產(chǎn)物；將所述消化產(chǎn)物進行稀釋，并利用100目篩網(wǎng)將所得到的稀釋液進行過濾，收集濾液；將所述濾液在2000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，加入生理鹽水重懸并定容，得到細胞懸液；將所述細胞懸液加入裝有淋巴細胞分離液的離心管中，并將得到的混合液在2000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20min，收集所得到的離心液中的白膜層；以及用生理鹽水重懸所述白膜層，再將得到的懸液于1200rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，收集細胞，并用生理鹽水洗滌，以便獲得所述底蛻膜間充質(zhì)干細胞。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。需要說明的是，自離心管口至離心管底部方向，所述離心液分為上清層、白膜層、分離液層及血細胞層。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法進一步包括擴增處理，所述擴增處理包括：將所述底蛻膜間充質(zhì)干細胞重懸于培養(yǎng)基中，得到混合液；以及將所述混合液接種于所述培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下培養(yǎng)至出現(xiàn)克隆，長至傳代。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，分離獲得的底蛻膜間充質(zhì)干細胞為單個細胞，將其進行擴增以得到大量的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。在上述最優(yōu)擴增處理條件下，擴增的同時還可以使其活性進一步提高。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒包括：胰酶；膠原酶Ⅳ；以及膠原酶Ⅱ。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒用于獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞。利用消化處理方法，能夠?qū)⒌淄懩そM織中細胞之間的蛋白質(zhì)降解，從而分離出單個細胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，單一酶很難將底蛻膜消化完全，所得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞量較少，由此需要進行多次消化。但是，多次消化容易造成細胞的損傷，難以獲得大量且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。進而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用混合酶制劑進行消化的效果較好，且無需多次消化，以減少對細胞的損傷。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用包括胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的混合酶制劑進行消化，能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒包括：0.05質(zhì)量％～0.25質(zhì)量％的胰酶；1～2μg/mL的膠原酶Ⅳ；以及0.1質(zhì)量％的膠原酶Ⅱ。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的濃度顯著影響消化效率，進而影響底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率、純度及活性。在上述最優(yōu)濃度下，底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率、純度及活性較高。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，胰酶濃度可以為0.08質(zhì)量％、0.10質(zhì)量％、0.13質(zhì)量％、0.18質(zhì)量％或0.21質(zhì)量％。當(dāng)胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ的濃度過高，將對底蛻膜間充質(zhì)干細胞造成損傷，使其活性下降，若胰酶、膠原酶Ⅳ以及膠原酶Ⅱ濃度過低，無法充分消化，從而使得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率及純度較低。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑盒能夠獲得大量、純度較高且活性較高的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的顯微鏡照片，其中，(A)為放大40倍，(B)為放大100倍；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的細胞表型鑒定分析圖，其中，(A)為間質(zhì)干細胞標志CDl05；(B)為間質(zhì)干細胞標志CD90；(C)為間質(zhì)干細胞標志CD73；(D)為造血細胞標志CD19；(E)為造血細胞標志CD34；(F)為造血細胞標志CD45；(G)為造血細胞標志CD14；(H)為人白細胞抗原HLA-DR；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的放大倍數(shù)為400倍的顯微鏡照片，其中(A)為成脂細胞，染色劑為油紅O；(B)為早期成骨細胞，染色劑為茜素紅；(C)為晚期成骨細胞，染色劑為VonKossa；(D)為成軟骨細胞的HE染色；(E)為成軟骨細胞，染色劑為阿爾辛蘭；(F)為成軟骨細胞，染色劑為甲苯胺藍；以及圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的細胞活力分析圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例在該實施例中，按照下列方法獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞：(1)用手術(shù)刀沿著胎盤小葉，割下表面的一層底蛻膜，放入盛有冰生理鹽水的培養(yǎng)皿中，盡量將血洗掉，放入西林瓶中剪至尺寸為2cm×2cm，再將5g剪好的底蛻膜轉(zhuǎn)移到50ml離心管中；(2)每管加入5ml的混合酶制劑，其中含0.25％胰酶，2μg/mL膠原酶Ⅳ和0.1質(zhì)量％的膠原酶Ⅱ，37℃的溫度、150rpm的轉(zhuǎn)速下震蕩30min，再加入FBS終止胰酶消化，并向所得到的消化產(chǎn)物中加入生理鹽水，稀釋5倍，得到稀釋液；(3)將稀釋液通過100目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，2000rpm離心5min，棄上清，加入2ml生理鹽水重懸，再定容至總體積5ml，得到細胞懸液；(4)向15ml離心管中分別加入5ml人淋巴細胞分離液，靜置至室溫，將細胞懸液加入含淋巴細胞分離液的離心管中(傾斜10ml離心管，沿壁緩慢加入，加入后紅色液體在分離液之上，保持液面穩(wěn)定)，2000rpm離心20min，分出四層(自離心管口至離心管底部方向分別是上清層、白膜層、分離液層、血細胞層)；(5)吸取白膜層置于離心管中，加入生理鹽水重懸細胞，1200rpm離心5min，生理鹽水洗2次，棄上清，得到底蛻膜間充質(zhì)干細胞；(6)將底蛻膜間充質(zhì)干細胞加入2ml原代培養(yǎng)基重懸并接種，直至克隆出現(xiàn)，長至傳代，期間每隔48h換液一次，以得到擴增的底蛻膜間充質(zhì)干細胞。對比例按照實施例的方法獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞，區(qū)別在于，步驟(2)中，利用2μg/mL膠原酶Ⅳ進行消化。對實施例擴增后的底蛻膜間充質(zhì)干細胞進行檢測1.細胞形態(tài)：將底蛻膜間充質(zhì)干細胞在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯毎N壁，呈梭形，片狀生長。2.細胞表型鑒定：取傳至3代的底蛻膜間充質(zhì)干細胞，消化后成單細胞懸液，按4×105個每管進行分裝。1×PBS洗一次，300g離心5min；棄上清。100μL1×PBS重懸細胞，每管分別加入攜帶熒光標記的一抗CD90-FITC、CD73-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE、CD14-FITC及HLA-DR-PE(購自美國BDPharmingen公司，按說明書給量)，設(shè)一管為直標抗體PE-isotype空白對照，一管為直標抗體FITC-isotype空白對照，4℃搖床，避光反應(yīng)40min。1×PBS清洗3次，每次300g離心5min，1％多聚甲醛固定，4℃放置，流式細胞儀檢測。結(jié)果如圖2和表1所示，可以看出，細胞表型均一，細胞表達間質(zhì)細胞標記CD73、CD90、CD105，不表達造血細胞標記CD34、CD14、CD45、CD19，且不表達人白細胞抗原HLA-DR，完全符合“國際細胞治療協(xié)會”關(guān)于間充質(zhì)干細胞表面標志物規(guī)定的標準。表1流式細胞儀檢測細胞表型檢測值正常參考值CD9098.55％>95％CD7399.81％>95％CD10597.76％>95％CD340.82％<2％CD451％<2％CD140.31％<2％CD190.09％<2％HLA-DR0％<2％3.三系分化：3.1脂肪誘導(dǎo)分化：3.1.1取傳至3代的底蛻膜間充質(zhì)干細胞以1.0×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞密度達到100％時，棄上清(用移液槍輕輕吸走)加入提前配置好的成脂分化誘導(dǎo)A液(成脂誘導(dǎo)啟動培養(yǎng)基)，3天后再換成誘導(dǎo)B液(成脂誘導(dǎo)維持培養(yǎng)基)。24h后再換成A液，如此循環(huán)3-5個周期，完成后用B液換掉舊的B液，每三天跟換一次，再放置七天。3.1.2油紅O染色鑒定脂滴形成誘導(dǎo)細胞去掉培養(yǎng)基，PBS洗一次，加入4％多聚甲醛固定30min，蒸餾水洗3次，原液(0.5％油紅O)6ml，加蒸餾水4ml，靜置5～10min，濾紙過濾；染色20min，蒸餾水洗3次，鏡下觀察照相，如圖3所示?？梢钥闯觯T導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的脂滴，油紅O染色呈陽性，說明細胞具有較強的向脂肪細胞分化的能力。3.2成骨誘導(dǎo)分化3.2.1取傳至3代的底蛻膜間充質(zhì)干細胞以5×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，正常培養(yǎng)24h后棄上清(用移液槍輕輕吸走)加入提前配置好的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天換液。3.2.2成骨誘導(dǎo)檢測方法3.2.2.1茜素紅染色：誘導(dǎo)14d底蛻膜間充質(zhì)干細胞，得到早期成骨細胞，吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS沖洗，4％多聚甲醛室溫固定30min，雙蒸水沖洗，使用茜素紅工作液37℃孵育30min，雙蒸水沖洗。3.2.2.2Vonkossa染色：誘導(dǎo)21d底蛻膜間充質(zhì)干細胞，得到晚期成骨細胞，參照細胞VonKossas鈣染色試劑盒進行染色。分別將染色后的早期成骨和晚期成骨在顯微鏡下觀察，如圖3所示?？梢钥闯?，早期成骨細胞的茜素紅染色呈陽性，說明細胞具有較強的向成骨細胞分化的能力。晚期成骨細胞Vonkossa染色為陽性，說明誘導(dǎo)分化的細胞已形成骨細胞的鈣化結(jié)節(jié)，證明細胞具有較強的向成骨細胞分化的能力。3.3軟骨誘導(dǎo)分化3.3.1取傳至3代的底蛻膜間充質(zhì)干細胞以5×105/管接種于15ml離心管中，正常培養(yǎng)24h后棄上清(用移液槍輕輕吸走)加入提前配置好的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，臨用加TGF-β3，每3天換一次液。3.3.2軟骨誘導(dǎo)檢測方法形成的微團在上述體系內(nèi)培養(yǎng)4周，每隔3天換液，誘導(dǎo)完畢后，進行石蠟包埋和切片。切片經(jīng)1％甲苯胺藍、阿爾辛蘭染色、HE染色鑒定軟骨特異性蛋白聚糖。如圖3所示。可以看出，HE染色、甲苯胺藍染色、阿爾辛蘭染色呈陽性，說明細胞具有很強的向軟骨細胞分化的能力?；盍y定比較實施例和對比例的步驟(5)所得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞的活力，具體步驟如下：將細胞用生理鹽水洗兩2遍，加入不含動物成分的TrypLEExpress消化約30s，鏡下可見短梭形貼壁細胞變圓并懸浮起來后，加入生理鹽水吹打細胞并將細胞轉(zhuǎn)移至離心管，1200rpm離心5min，棄掉上清液，用2ml的生理鹽水重懸，通過細胞活力分析儀檢測細胞的活力。實施例步驟(5)所得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞活力為92.5％。說明利用本發(fā)明的方法獲得底蛻膜間充質(zhì)干細胞過程中，消化處理條件溫和，對底蛻膜間充質(zhì)干細胞損傷較小，使得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞活性較強。對比例所得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞的活力僅為70.2％(如圖4所示)，且實施例步驟(5)的底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率為對比例的3倍。說明本發(fā)明的方法所得到的底蛻膜間充質(zhì)干細胞的得率及活性均較高。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁1 2 3