本發(fā)明涉及一種將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells）分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)的方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來源于中胚層，是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，后來在臍帶、胎盤、脂肪和肌肉等組織中相繼發(fā)現(xiàn)。由于MSC具有可擴增性、多向分化和低免疫原性，還可調(diào)控免疫反應(yīng)和旁分泌功能，因此被認(rèn)為是組織工程中理想的種子細(xì)胞和臨床細(xì)胞替代治療的一種途徑。然而，MSC組織來源復(fù)雜，使其增殖速度、分泌細(xì)胞因子譜和免疫調(diào)節(jié)能力等生物學(xué)特性具有差異，此外提取的可行性和可提取的數(shù)量等問題導(dǎo)致對細(xì)胞的質(zhì)控較復(fù)雜。因此獲得來源相同、質(zhì)量統(tǒng)一的MSC非常重要。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）是由成體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)導(dǎo)入重編程而來的具有與胚胎干細(xì)胞相似功能的細(xì)胞，不但具備自我更新和多向分化潛能，還克服了胚胎干細(xì)胞存在的倫理和免疫原性等問題，成為研究人來疾病發(fā)病機制、組織細(xì)胞替代治療的重要細(xì)胞來源。以iPSC作為來源細(xì)胞，可以將其在體外擴增并誘導(dǎo)分化為特定的組織細(xì)胞。

目前，從ESC和iPSC誘導(dǎo)分化為MSC的方法很多，以擬胚體（Embryoid body ，EB)法為主，主要存在誘導(dǎo)過程復(fù)雜、時間長和效率不高等缺點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，可以解決傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)過程復(fù)雜、誘導(dǎo)時間長、誘導(dǎo)效率不高的缺點，為提供統(tǒng)一來源、足量、質(zhì)優(yōu)的MSC打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明建立了一個簡便、高效誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，不需經(jīng)擬胚體形成，直接將iPSC誘導(dǎo)分化為MSC，其方案是先將iPSC解離為單細(xì)胞，隨后使用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化為間充質(zhì)樣干細(xì)胞，再進(jìn)一步培養(yǎng)使其成熟，包括以下步驟：

（1）制備iPS單細(xì)胞懸液。

將iPSC解離成單個細(xì)胞后重懸。

其中可使用含ROCK抑制劑的 mTeSR 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

（2）誘導(dǎo)分化。

將單細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，使用分化培養(yǎng)基B進(jìn)行培養(yǎng)，再更換為分化培養(yǎng)基A。

細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下分化培養(yǎng)基B培養(yǎng)24~48h；隨后分化培養(yǎng)基A繼續(xù)培養(yǎng)8~12d。

所述細(xì)胞培養(yǎng)板為I型膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板。

（3）誘導(dǎo)成熟。

將形成的MSC-Like細(xì)胞使用0.25%胰酶消化，MSC培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于新的I型膠原包被的細(xì)胞板中，采用MSC培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

所述MSC培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加%FBS、GlutaMAX-I和非必需氨基酸的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成間充質(zhì)干細(xì)胞的分化培養(yǎng)基。

如上述步驟（1）中將iPSC解離為單個細(xì)胞所用解離液為Accutase，消化iPSC的溫度為37℃，時間為7min。

如上述步驟（2）中所述，所述分化培養(yǎng)基A是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血小板衍生因子（PDGF AB）、地塞米松和10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基B為分化培養(yǎng)基A和mTeSR1培養(yǎng)基的混合液；所述細(xì)胞培養(yǎng)板為I型膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板。

如上所述分化培養(yǎng)基A中PDGF AB的終濃度為0.5~20ng/ml，地塞米松的終濃度為50~150Mm;所述分化培養(yǎng)基B中mTeSR1培養(yǎng)基的終濃度為30%~70%(體積百分含量)。

優(yōu)選地，上述分化培養(yǎng)基A中PDGF AB的終濃度為5ng/ml，地塞米松的終濃度為100nM。優(yōu)選地上述分化培養(yǎng)基B中mTeSR1的終濃度為50%。

如上述步驟（2）中，所述分化培養(yǎng)基A中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM、α-MEM、DMEM/F12，優(yōu)選地基礎(chǔ)培養(yǎng)基為α-MEM。

如上述步驟（2）的培養(yǎng)條件為37℃培養(yǎng)24~48h, 優(yōu)選48h,上述步驟（3）中培養(yǎng)條件37℃培養(yǎng)8~12d, 優(yōu)選10d。

附圖說明

圖1為iPSC誘導(dǎo)分化為MSC的技術(shù)路線圖。

圖2為iPSC和MSC形態(tài)圖。左圖為iPS集落明場圖，右圖為誘導(dǎo)分化后的白光下MSC中Scale bar=100μm。

圖3為iPSC誘導(dǎo)分化為MSC過程中相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

圖4為流式細(xì)胞術(shù)檢測由iPSC誘導(dǎo)分化的MSC表面標(biāo)志物。

圖5為iPSC誘導(dǎo)分化的MSC在體外培養(yǎng)過程中的生長曲線，呈“S”型生長。

圖6為由iPSC誘導(dǎo)分化的MSC的成骨、成脂和軟骨分化后染色鑒定圖。a為誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞的油紅O染色鑒定；b為誘導(dǎo)分化的成脂細(xì)胞的茜素紅S染色鑒定；c為誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞阿辛藍(lán)染色鑒定。其中放大倍數(shù)為100×。

圖7為誘導(dǎo)分化的MSC的成骨、成脂和軟骨分化后特異性基因表達(dá)檢測圖。

具體實施例

本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

下述實施例中所用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法,下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明實施例對使用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)方法使人iPSC向MSC分化誘導(dǎo)的情況進(jìn)行說明。

（1）本發(fā)明的試驗路線示意圖（圖1）。

（2）用于流式細(xì)胞術(shù)分選 MSC 的熒光標(biāo)記抗體如下：

熒光素PE標(biāo)記的抗人表面識別分子CD29抗體（SC59829，Santa Cruz ）

熒光素APC標(biāo)記的抗人表面識別分子CD44抗體（170441，Affymetrix eBioscience ）

熒光素FITC標(biāo)記的抗人表面識別分子CD34抗體（110349，Affymetrix eBioscience ）

熒光素PerCP-Cyanine5.5標(biāo)記的抗人表面識別分子CD90抗體（450909，Affymetrix eBioscience ）

熒光素PE標(biāo)記的同型對照抗體（sc2867，Santa Cruz）

熒光素APC標(biāo)記的同型對照抗體（174031，Affymetrix eBioscience ）

熒光素FITC標(biāo)記的同型對照抗體（114714，Affymetrix eBioscience ）

熒光素PerCP-Cyanine5.5標(biāo)記的同型對照抗體（454714，Affymetrix eBioscience ）

（3）用于qPCR和RT-PCR檢測的引物序列如下：

實施例1 誘導(dǎo)人iPSC向MSC的分化

1．人iPS細(xì)胞的培養(yǎng)

本實施例中，使用的人iPS細(xì)胞（DYR0100，中國科學(xué)院細(xì)胞庫）培養(yǎng)在Matrigel(BD，354277)上，用mTeSRTM1(STEMCELL TECHNOLOGIES，05850)維持培養(yǎng)，如圖2a所示。具體培養(yǎng)方法包括以下步驟：

①從冰箱中取出培養(yǎng)基及所需試劑， 37℃水浴鍋中預(yù)熱15min左右；

②取出細(xì)胞，吸棄原培養(yǎng)基，用DPBS(no calcium, no magnesium)（Invitrogen ，14190250)將細(xì)胞洗一遍；

③加入1mg/ml膠原酶IV（溶解于HBSS緩沖液中，0.22μm過濾除菌）（Invitrogen 17104019）進(jìn)行消化，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5min左右，在顯微鏡下觀察，克隆邊緣卷起尚未完全脫離培養(yǎng)皿時終止消化；

④吸棄膠原酶IV，用DPBS洗滌后，加入適量mTeSRTM1培養(yǎng)基；

⑤用細(xì)胞刮刀或無菌玻璃管將細(xì)胞克隆從培養(yǎng)皿底部刮下，轉(zhuǎn)移到離心管，輕輕吹打5~10次使細(xì)胞克隆變?yōu)榇笮≥^均一的小細(xì)胞團(tuán)；

⑥取出提前用Matrigel包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿，將小細(xì)胞團(tuán)懸液均勻加入到細(xì)胞皿中，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換新鮮培養(yǎng)基，一般5~7天傳代1次，但當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞克隆過大或過密及出現(xiàn)自發(fā)分化等情況時則需及時進(jìn)行處理。

人iPS細(xì)胞向MSC的誘導(dǎo)分化

分化培養(yǎng)基A：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基α-MEM培養(yǎng)基（Gibco）中添加血小板衍生因子（PDGF AB）（PeproTech，AF10014B）和地塞米松（Sigma，D4902）得到的培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基A中，PDGF AB的終濃度為5ng/ml，地塞米松的終濃度為100nM。

分化培養(yǎng)基B：分化培養(yǎng)基A和mTeSRTM1混合得到的培養(yǎng)基，其中mTeSRTM1培養(yǎng)基的終濃度為50%（體積百分含量）。

誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞向MSC分化，包括以下步驟：

①解離為單細(xì)胞：取培養(yǎng)的iPSC，吸棄原培養(yǎng)液，使用DPBS洗滌1遍，加入Accutase(Invitrogen ，A1110501)，在37℃處理5~10min，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓、集落間細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞開始脫落時終止消化，加入適量α－MEM培養(yǎng)基，吹打重懸細(xì)胞，1000rmp離心5min，棄上清，使用分化培養(yǎng)基B重懸細(xì)胞；

②誘導(dǎo)分化：取出I型膠原蛋白預(yù)包被細(xì)胞培養(yǎng)板（greiner bio-one）在室溫預(yù)熱，將iPS單細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中使用分化培養(yǎng)基B進(jìn)行培養(yǎng)，48h后更換為分化培養(yǎng)基A培養(yǎng)細(xì)胞，每2~3天更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)直至10天；

③流式分選：將獲得的MSC-Like細(xì)胞使用0.25%Trypsin-EDTA(Gibco)消化成單個細(xì)胞，加入1mlPBS后重懸，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后調(diào)整密度，使用抗CD29和CD44的流式抗體(SANTA CRUZ)標(biāo)記細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀（BD FACS AriaII）先對IgG陰性對照組細(xì)胞懸液進(jìn)行流式上樣，選出陰性熒光信號區(qū)域作為陰性對照，收集熒光強度高于陰性對照組10倍以上的CD29+/CD44+雙陽性細(xì)胞。

④CD29+/CD44+雙陽性細(xì)胞的擴增：按5×104/cm2密度將細(xì)胞接種于新的細(xì)胞板中，加入適量MSC SFM（Gibco，A1033201）培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，如圖2所示，獲得形態(tài)較均一的MSC。

實施例2 人iPS細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化的檢測

（1）相關(guān)基因在誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)情況

Trizol（Invitrogen）法抽提iPS誘導(dǎo)0、3、6、9、12d細(xì)胞和iPS-MSC-P2的總RNA，

采用M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄為cDNA及SYBR Premix Ex Taq（Takara）進(jìn)行Realtime PCR檢測Nanog、Oct4、CD73、CD105和內(nèi)參基因actin的表達(dá)情況（圖3）。隨著誘導(dǎo)時間的延長，多能性基因Nanog和Oct4的表達(dá)量下降，而CD73和CD105的表達(dá)量逐漸升高，MSC-P2僅表達(dá)少量的Nnaog和Oct4，而CD73和CD105幾乎100%表達(dá)。

（2）MSC表面Marker鑒定

將獲得的MSC細(xì)胞（P2）消化成單細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體CD29、CD34、CD44和CD90和同型陰性對照小鼠抗小鼠IgG單克隆抗體并混勻，4℃避光孵育30min后加入1%牛血清白蛋白(BSA)，混勻，1000rmp離心5min，棄上清，加入適量1%BSA，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測相應(yīng)抗原表達(dá)情況，圖4所示，獲得的MSC的CD29、CD44和CD90表達(dá)陽性，陽性率分別為100%、98.62%和99.1%，而CD34表達(dá)陰性。

實施例3 人iPS細(xì)胞分化的MSC的生長曲線的測定

取人iPS細(xì)胞分化的MSC(P5)消化成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后按5×103/cm2的密度鋪于24孔細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在接種后每天取3孔細(xì)胞計數(shù)。圖5可知，由人iPS細(xì)胞分化而來的MSC在培養(yǎng)過程中呈“S”型生長，2~5d為對數(shù)生長期，第6天進(jìn)入平臺期，表面由iPS細(xì)胞分化的MSC在體外培養(yǎng)過程中能很好地進(jìn)行自我更新和增殖。

實施例4 人iPS細(xì)胞分化的MSC的三系分化能力的鑒定

取培養(yǎng)至第5代的由人iPS細(xì)胞分化而來的MSC，分別采用間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂和成軟骨分化培養(yǎng)基（Biowit）進(jìn)行培養(yǎng)，每2~3日換液。

待培養(yǎng)至2~3周，分別對誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和軟骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅、油紅O和阿辛藍(lán)染色鑒定，并用RT-PCR方法檢測PPAR-γ、Osteopontin、ALP、 Aggrecan和Sox9基因的表達(dá)。

圖6所示，a為誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞的油紅O染色鑒定；b為誘導(dǎo)分化的成脂細(xì)胞的茜素紅S染色鑒定；c為誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞阿辛藍(lán)染色鑒定，均為陽性。對成脂細(xì)胞特異性基因PPAR-γ、成骨細(xì)胞特異性基因Osteopontin和ALP以及軟骨細(xì)胞特異性基因Aggrecan和Sox9的RT-PCR檢測均為陽性表達(dá)（圖7）。表明由人iPS細(xì)胞分化的MSC具有成骨、成脂和軟骨分化能力。