本發(fā)明屬于生物技術(shù)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種VDR-His融合蛋白及其DNA序列、表達(dá)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

維生素D（vitamin D）是人體重要的健康元素，可促進(jìn)鈣磷的吸收，影響骨骼的生長(zhǎng)和代謝，特別適于中老年人緩解和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。同時(shí)，維生素D還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，預(yù)防和緩解免疫疾病的癥狀，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有抑制作用，因而能防癌抗癌。維生素D還可以防治心腦血管疾病的發(fā)生。因此，維生素D是機(jī)體不可缺少的活性調(diào)節(jié)因子，一般情況下，機(jī)體中維生素D的生理濃度范圍應(yīng)該在 30-60 ng/mL，即75-150 nmol/L。

機(jī)體內(nèi)的維生素D在細(xì)胞微粒體中受25-羥化酶系統(tǒng)催化生成骨化二醇，經(jīng)腎近曲小管細(xì)胞1-羥化酶系統(tǒng)催化，生成具有生物活性的骨化三醇（1, 25(OH)VD₃）?；钚缘墓腔伎梢酝ㄟ^(guò)與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)特殊蛋白質(zhì)結(jié)合才能控制基因的表達(dá)，這個(gè)蛋白質(zhì)叫做維生素D受體（vitamin D receptor，簡(jiǎn)稱(chēng)VDR）。因此，針對(duì)靶蛋白VDR開(kāi)發(fā)了一系列維生素D類(lèi)藥物。這些藥物用于治療多種骨疾病如佝僂病、軟骨癥和骨質(zhì)疏松癥。近年來(lái)，這些藥物也用于治療各類(lèi)甲狀旁腺功能亢奮癥，療效顯著。

另外，維生素D藥物篩選模型是以VDR為靶點(diǎn)，通過(guò)藥物與VDR蛋白的結(jié)合力判斷藥物的活力大小。目前，VDR蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)，通過(guò)免疫沉淀技術(shù)分離獲得，這一方法產(chǎn)量有限，且依賴(lài)于抗體的質(zhì)量，操作復(fù)雜，分離效率較低。

多聚組氨酸親和標(biāo)簽肽（6×His tag）的分子量相對(duì)較小且?guī)в须姾桑瑤缀醪挥绊懩康牡鞍椎幕钚?，其純化產(chǎn)物可直接用于蛋白功能的研究。目前，我國(guó)對(duì)維生素D類(lèi)藥物產(chǎn)品的需求與維生素D類(lèi)藥物的研發(fā)之間存在遲緩的矛盾，加上VDR蛋白與維生素D藥物的結(jié)合力可以判斷藥物的活性大小。因此，提供一種維生素D受體（VDR）與組氨酸標(biāo)簽肽（6×His tag）融合蛋白及其表達(dá)在維生素D類(lèi)藥物研發(fā)過(guò)程中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種維生素D受體（VDR）與組氨酸標(biāo)簽肽（6×His tag）融合蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)VDR-His融合蛋白，可以用于維生素D藥物的篩選和維生素D活性的評(píng)估，同時(shí)，本發(fā)明還提供所述融合蛋白的DNA序列及其表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)方法，可以實(shí)現(xiàn)體外快速分離和純化該融合蛋白。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種VDR-His融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其中，本發(fā)明中所述的VDR-His融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者在SEQ ID No.2所述氨基酸序列中經(jīng)突變或同義氨基酸取代后的序列，且這些序列與SEQ ID No.2所示的序列有相同功能，即實(shí)現(xiàn)VDR-His融合蛋白的表達(dá)。

上述VDR-His融合蛋白的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID No.1所示。其中，本發(fā)明中所述的VDR-His融合蛋白DNA序列指上述SEQ ID No.1所述整個(gè)DNA 序列，或者是不包含擴(kuò)增引物的序列，或者所述VDR-His融合蛋白在SEQ ID No.1所示DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物，且這些序列是與SEQ ID No.1所示的序列具有編碼相同功能蛋白的DNA序列。

一種含有上述VDR-His融合蛋白的DNA序列的表達(dá)載體。

優(yōu)選地，上述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。

更優(yōu)選地，上述真核表達(dá)載體為pcDNA3.1/His質(zhì)粒。

一種含有上述VDR-His融合蛋白的DNA序列或含有上述表達(dá)載體的宿主菌。

優(yōu)選地，上述宿主菌為大腸桿菌。

一種上述的VDR-His融合蛋白的表達(dá)方法，包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增人VDR的 cDNA序列的上、下游引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增程序獲得人VDR的cDNA片段；

（2）利用重組技術(shù)將人VDR的cDNA片段與6×His tag的cDNA實(shí)現(xiàn)連接，其間插入12個(gè)甘氨酸cDNA序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體；

（3）將步驟（2）得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)、純化。

上述VDR-His融合蛋白的表達(dá)方法中步驟（2）所述的表達(dá)載體為pcDNA3.1/His質(zhì)粒。

一種上述VDR-His融合蛋白在維生素D藥物的篩選、活性評(píng)估的應(yīng)用。因?yàn)楸景l(fā)明所制備的VDR-His融合蛋白具有維生素D藥物誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性，可以用于研究維生素D類(lèi)藥物與受體蛋白的相互作用，進(jìn)而應(yīng)用于維生素D藥物篩選和活性評(píng)估方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的表達(dá)系統(tǒng)及VDR-His融合蛋白的表達(dá)方法能夠成功實(shí)現(xiàn)VDR-His融合蛋白的表達(dá)，并利用His標(biāo)簽肽與鎳離子的結(jié)合特性，在體外可以快速分離和制備VDR-His融合蛋白。同時(shí)，本發(fā)明所制備的VDR-His融合蛋白具有維生素D藥物誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性，可以用于研究維生素D類(lèi)藥物與受體蛋白的相互作用，進(jìn)而應(yīng)用于維生素D藥物篩選和研發(fā)領(lǐng)域，以及保健品或食物、藥物中維生素D活性的評(píng)估方面，在實(shí)際中有較好的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1 VDR-His融合蛋白序列連接于pcDNA3.1/His質(zhì)粒中的示意圖。A為pcDNA3.1/VDR-His的示意圖，B為VDR-His融合蛋白表達(dá)盒（expression cassette）的示意圖，其中明示出了VDR與His標(biāo)簽肽的相關(guān)位置（從左至右依次為CMV 啟動(dòng)子（P_CMV）、維生素D受體（VDR）、12個(gè)甘氨酸序列（Gly12）、組氨酸標(biāo)簽肽（6×His tag）、PolyA結(jié)構(gòu)（PolyA））。

圖2 對(duì)本發(fā)明的pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。A，菌液PCR鑒定結(jié)果（M：DL2000；1和2是陰性克??；3為陽(yáng)性克?。籅，載體雙酶切鑒定結(jié)果（M：DL2000；1為Hind III單酶切；2為Hind III和EcoR I雙酶切；3為EcoR I單酶切）。

圖3 VDR融合蛋白表達(dá)效率檢測(cè)。

圖4 表達(dá)VDR-His融合蛋白的HEK293細(xì)胞經(jīng)活性1, 25(OH)VD₃處理后的qPCR分析圖。

圖5 利用穩(wěn)定表達(dá)VDR-His融合蛋白的HEK293細(xì)胞測(cè)定兩種維生素D藥物中的維生素D生物活性的分析結(jié)果圖（橫坐標(biāo)1～5分別為0、0.01、0.1、1、10 nM的藥物處理濃度；縱坐標(biāo)是CYP24A1的相對(duì)表達(dá)量）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

1. 獲得人VDR的cDNA片段

（1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增人VDR的cDNA序列的的上、下游引物

上游引物：（帶有Hind III酶切位點(diǎn)以及Kozak序列）5’-CGATGCAAGCTTCGCCACCATGGAGTGGAGGAATAAGAAAAGGAG-3’，其中，斜體加粗部分為Hind III酶切位點(diǎn)，有下劃線的部分為Kozak序列；

下游引物：（帶有EcoR I酶切位點(diǎn)，為了與His序列融合表達(dá)，VDR去掉終止密碼子，加入12個(gè)甘氨酸殘基序列（Gly12），以保護(hù)VDR的功能不受影響）5’-ATATTAGAATTCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCGGAGATCTCATTGCCAAACACTTC-3’，其中，斜體加粗部分為EcoRI酶切位點(diǎn)，有下劃線的部分為12個(gè)甘氨酸殘基序列；

（2）通過(guò)PCR擴(kuò)增程序獲得人VDR的cDNA片段

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火60 s，55℃延伸2 min，循環(huán)30次，72℃延伸10 min，16℃保存。

得到人VDR的cDNA片段，產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1480 bp。

2. pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用重組技術(shù)將人VDR的cDNA片段與6×His tag的cDNA實(shí)現(xiàn)連接，其間插入12個(gè)甘氨酸cDNA序列，構(gòu)建pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體，具體操作如下：

（1）線性化pcDNA 3.1/His載體：對(duì)pcDNA 3.1/His載體進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，備用；

（2）雙酶切人VDR的cDNA序列：對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的人VDRcDNA片段進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，備用；

（3）連接：將（1）和（2）得到的產(chǎn)物按照1：5的比例混合后，在16 ℃的條件下，過(guò)夜連接；

（4）轉(zhuǎn)化：將（3）獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于含100 mg/L氨芐霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR及質(zhì)粒雙酶切鑒定后，委托Invitrogen公司測(cè)序。

驗(yàn)證正確的克隆即為所要獲得的pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體。只有經(jīng)過(guò)真核細(xì)胞表達(dá)，能得到VDR-His融合蛋白的載體，才能說(shuō)明其是能夠產(chǎn)生VDR-His融合蛋白的真核表達(dá)載體。

其中，圖1為VDR-His融合蛋白DNA序列連接于pcDNA3.1/His質(zhì)粒中的示意圖。A為pcDNA3.1/VDR-His的示意圖，B為VDR-His融合蛋白表達(dá)盒的示意圖，其中明示出了VDR與His標(biāo)簽肽的相關(guān)位置：從左至右依次為CMV 啟動(dòng)子（P_CMV）、維生素D受體（VDR）、12個(gè)甘氨酸序列（Gly12）、組氨酸標(biāo)簽肽（6×His tag）、PolyA結(jié)構(gòu)（PolyA）。

圖2為對(duì)本實(shí)施例的pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。A，菌液PCR鑒定結(jié)果（M：DL2000；1和2是陰性克?。?為陽(yáng)性克?。籅，載體雙酶切鑒定結(jié)果（M：DL2000；1為Hind III單酶切；2為Hind III和EcoRI雙酶切；3為EcoRI單酶切）。

由圖1、圖2可以看出，本發(fā)明提供的pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

本發(fā)明還提供一種宿主菌，即含有上述真核表達(dá)載體pcDNA3.1/VDR-His的大腸桿菌。用于外源DNA序列，比如本實(shí)施例中VDR-His融合蛋白的DNA序列的保存、分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)等方面。

實(shí)施例2

VDR-His融合蛋白具有鎳離子結(jié)合活性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

（1）傳代培養(yǎng)真核細(xì)胞12 h，本實(shí)施例選用HEK293細(xì)胞，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將實(shí)施例1構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/VDR-His轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞內(nèi)；

（2）用含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟（1）所得的細(xì)胞48 h，至細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)瓶的90％；

（3）配制細(xì)胞裂解液，各成分及含量為：2 M HEPES（pH 7.0）200 μl，4 M NaCl 500 μl，DTT 3 μl，Brij 100 μl，PMSF 200 μl，H₂O 19 ml，混合即可。取配制好的該細(xì)胞裂解液2mL，加入步驟（2）的培養(yǎng)瓶中，用超聲波破碎細(xì)胞，超聲時(shí)每次10 s，共20次；離心，收集上清液，因?yàn)閴A性有利于His標(biāo)簽肽與鎳離子的結(jié)合，所以再加入100 μL細(xì)胞蛋白提取液，即100 μL pH=8.0的1M Tris-HCl Buffer到上清液中；

（4）分離純化：在空鎳柱中緩慢滴加300 μL Ni-NTA Agarose的鎳填料，待其完全沉淀后，再用2 ml的AT Buffer 平衡柱子1 h，加2 ml細(xì)胞蛋白提取液，即2 mL pH=8.0的1M Tris-HCl Buffer 到鎳柱中，待樣液流過(guò)柱子后，用2 ml 的AT buffer清洗柱子。隨后用1 ml的Salt Washing Buffer清洗柱子，去除非特異性結(jié)合蛋白。最后，用300 μl的Elution Buffer洗脫特異性結(jié)合的VDR-His融合蛋白；

（5）純化目標(biāo)蛋白的鑒定：用SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白提取液和純化的融合蛋白樣品，按蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)鑒定融合蛋白上的VDR蛋白和His標(biāo)簽肽。VDR蛋白的鑒定使用VDR抗體，His標(biāo)簽肽的鑒定使用His標(biāo)簽肽抗體。

結(jié)果如圖3所示，說(shuō)明該表達(dá)系統(tǒng)成功生產(chǎn)了VDR-His融合蛋白。經(jīng)表達(dá)后產(chǎn)生的VDR-His融合蛋白的DNA序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。也說(shuō)明了實(shí)施例1構(gòu)建的pcDNA3.1/VDR-His真核表達(dá)載體含有VDR-His融合蛋白的DNA序列，轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)后可以產(chǎn)生VDR-His融合蛋白。同時(shí)，利用融合蛋白的鎳離子結(jié)合活性，可以實(shí)現(xiàn)VDR-His融合蛋白的快速分離與純化。

圖3為VDR-His融合蛋白的表達(dá)效率檢測(cè)結(jié)果圖。在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后收集HEK293的總蛋白，驗(yàn)證了VDR融合蛋白的表達(dá)效率。結(jié)果顯示，在經(jīng)His和VDR抗體孵育后，可分別檢測(cè)出VDR和His蛋白的表達(dá)。同時(shí)，在pcDNA3.1/VDR-His轉(zhuǎn)染組中VDR蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。說(shuō)明該真核表達(dá)載體pcDNA3.1/VDR-His可增強(qiáng)VDR融合蛋白的表達(dá)量。同時(shí)，利用His標(biāo)簽肽的鎳離子結(jié)合作用，可對(duì)VDR-His融合蛋白進(jìn)行快速有效的分離和純化。

實(shí)施例3

VDR-His融合蛋白具有維生素D藥物誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

（1）傳代培養(yǎng)真核細(xì)胞12 h，本實(shí)施例選用HEK293細(xì)胞，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將實(shí)施例1構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/VDR-His轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞內(nèi)；

（2）用含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟（1）所得的細(xì)胞48 h，至細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)瓶90％；

（3）用含有0、0.01、0.1、1、10 nM的活性1, 25(OH)VD₃培養(yǎng)基處理穩(wěn)定表達(dá)VDR-His融合蛋白的HEK293細(xì)胞，連續(xù)孵育12 h后收集總mRNA，進(jìn)行qPCR分析。

結(jié)果如圖4所示，1 nM的活性1, 25(OH)VD₃能顯著增加VDR下游基因CYP24A1基因的表達(dá)量（P<0.05），說(shuō)明VDR-His融合蛋白能夠有效應(yīng)答活性1, 25(OH)VD₃的處理，激活下游靶基因CYP24A1基因的表達(dá)，證明VDR-His融合蛋白具有維生素D藥物的基因轉(zhuǎn)錄活性。

實(shí)施例4

VDR-His融合蛋白可用于維生素D類(lèi)藥物的篩選的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

（1）傳代培養(yǎng)真核細(xì)胞12 h，本實(shí)施例選用HEK293細(xì)胞，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將實(shí)施例1構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/VDR-His轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞內(nèi)；

（2）用含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟（1）所得的細(xì)胞48 h，至細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)瓶90％；

（3）用活性1, 25(OH)VD₃和兩種維生素D藥物（藥物A為O₂C₃，藥物B為MART-10）處理穩(wěn)定表達(dá)VDR-His融合蛋白的細(xì)胞，連續(xù)孵育12 h后收集總mRNA，進(jìn)行qPCR分析，以活性1, 25(OH)VD₃的處理為陽(yáng)性對(duì)照。

結(jié)果如圖5所示，可以看出，含有真核表達(dá)載體pcDNA3.1/VDR-His的細(xì)胞模型能夠響應(yīng)活性1, 25(OH)VD₃的藥物處理，并在一定的藥物濃度范圍內(nèi)，CYP24A1的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。由實(shí)施例3已經(jīng)證明該VDR-His融合蛋白具有維生素D藥物的基因轉(zhuǎn)錄活性，因此根據(jù)VDR靶基因CYP24A1的相對(duì)表達(dá)量可以反映出維生素D藥物的生物活性，可用于維生素D藥物的篩選和鑒別工作。從結(jié)果可知，兩種維生素D藥物的處理結(jié)果略有差異，說(shuō)明不同藥物中維生素D的活性與藥物種類(lèi)有關(guān)。

SEQUENCE LISTING

<110> 陜西理工學(xué)院

<120> 一種VDR-His融合蛋白及其DNA序列、表達(dá)方法和應(yīng)用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcttcgcc accatggagt ggaggaataa gaaaaggagc gattggctgt cgatggtgct 60

cagaactgct ggagtggagg aagcctttgg gtctgaagtg tctgtgagac ctcacagaag 120

agcacccctg ggctccactt acctgccccc tgctccttca gggatggagg caatggcggc 180

cagcacttcc ctgcctgacc ctggagactt tgaccggaac gtgccccgga tctgtggggt 240

gtgtggagac cgagccactg gctttcactt caatgctatg acctgtgaag gctgcaaagg 300

cttcttcagg cgaagcatga agcggaaggc actattcacc tgccccttca acggggactg 360

ccgcatcacc aaggacaacc gacgccactg ccaggcctgc cggctcaaac gctgtgtgga 420

catcggcatg atgaaggagt tcattctgac agatgaggaa gtgcagagga agcgggagat 480

gatcctgaag cggaaggagg aggaggcctt gaaggacagt ctgcggccca agctgtctga 540

ggagcagcag cgcatcattg ccatactgct ggacgcccac cataagacct acgaccccac 600

ctactccgac ttctgccagt tccggcctcc agttcgtgtg aatgatggtg gagggagcca 660

tccttccagg cccaactcca gacacactcc cagcttctct ggggactcct cctcctcctg 720

ctcagatcac tgtatcacct cttcagacat gatggactcg tccagcttct ccaatctgga 780

tctgagtgaa gaagattcag atgacccttc tgtgacccta gagctgtccc agctctccat 840

gctgccccac ctggctgacc tggtcagtta cagcatccaa aaggtcattg gctttgctaa 900

gatgatacca ggattcagag acctcacctc tgaggaccag atcgtactgc tgaagtcaag 960

tgccattgag gtcatcatgt tgcgctccaa tgagtccttc accatggacg acatgtcctg 1020

gacctgtggc aaccaagact acaagtaccg cgtcagtgac gtgaccaaag ccggacacag 1080

cctggagctg attgagcccc tcatcaagtt ccaggtggga ctgaagaagc tgaacttgca 1140

tgaggaggag catgtcctgc tcatggccat ctgcatcgtc tccccagatc gtcctggggt 1200

gcaggacgcc gcgctgattg aggccatcca ggaccgcctg tccaacacac tgcagacgta 1260

catccgctgc cgccacccgc ccccgggcag ccacctgctc tatgccaaga tgatccagaa 1320

gctagccgac ctgcgcagcc tcaatgagga gcactccaag cagtaccgct gcctctcctt 1380

ccagcctgag tgcagcatga agctaacgcc ccttgtgctc gaagtgtttg gcaatgagat 1440

ctccggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga gaattctgca gatatccagc 1500

acagtggcgg ccgctcgagt ctagagggcc cttcgaacaa aaactcatct cagaagagga 1560

tcatctgaat atgcataccg gtcatcatca ccatcaccat tgagtttaaa cccgctgatc 1620

agcctcgact gtgccttcta g 1641

<210> 2

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Trp Met Lys Lys Arg Ser Asp Trp Leu Ser Met Val Leu Arg

1 5 10 15

Thr Ala Gly Val Glu Glu Ala Phe Gly Ser Glu Val Ser Val Arg Pro

20 25 30

His Arg Arg Ala Pro Leu Gly Ser Thr Tyr Leu Pro Pro Ala Pro Ser

35 40 45

Gly Met Glu Ala Met Ala Ala Ser Thr Ser Leu Pro Asp Pro Gly Asp

50 55 60

Phe Asp Arg Asn Val Pro Arg Ile Cys Gly Val Cys Gly Asp Arg Ala

65 70 75 80

Thr Gly Phe His Phe Asn Ala Met Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe

85 90 95

Phe Arg Arg Ser Met Lys Arg Lys Ala Leu Phe Thr Cys Pro Phe Asn

100 105 110

Gly Asp Cys Arg Ile Thr Lys Asp Asn Arg Arg His Cys Gln Ala Cys

115 120 125

Arg Leu Lys Arg Cys Val Asp Ile Gly Met Met Lys Glu Phe Ile Leu

130 135 140

Thr Asp Glu Glu Val Gln Arg Lys Arg Glu Met Ile Leu Lys Arg Lys

145 150 155 160

Glu Glu Glu Ala Leu Lys Asp Ser Leu Arg Pro Lys Leu Ser Glu Glu

165 170 175

Gln Gln Arg Ile Ile Ala Ile Leu Leu Asp Ala His His Lys Thr Tyr

180 185 190

Asp Pro Thr Tyr Ser Asp Phe Cys Gln Phe Arg Pro Pro Val Arg Val

195 200 205

Asn Asp Gly Gly Gly Ser His Pro Ser Arg Pro Asn Ser Arg His Thr

210 215 220

Pro Ser Phe Ser Gly Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Asp His Cys Ile

225 230 235 240

Thr Ser Ser Asp Met Met Asp Ser Ser Ser Phe Ser Asn Leu Asp Leu

245 250 255

Ser Glu Glu Asp Ser Asp Asp Pro Ser Val Thr Leu Glu Leu Ser Gln

260 265 270

Leu Ser Met Leu Pro His Leu Ala Asp Leu Val Ser Tyr Ser Ile Gln

275 280 285

Lys Val Ile Gly Phe Ala Lys Met Ile Pro Gly Phe Arg Asp Leu Thr

290 295 300

Ser Glu Asp Gln Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Ala Ile Glu Val Ile

305 310 315 320

Met Leu Arg Ser Asn Glu Ser Phe Thr Met Asp Asp Met Ser Trp Thr

325 330 335

Cys Gly Asn Gln Asp Tyr Lys Tyr Arg Val Ser Asp Val Thr Lys Ala

340 345 350

Gly His Ser Leu Glu Leu Ile Glu Pro Leu Ile Lys Phe Gln Val Gly

355 360 365

Leu Lys Lys Leu Asn Leu His Glu Glu Glu His Val Leu Leu Met Ala

370 375 380

Ile Cys Ile Val Ser Pro Asp Arg Pro Gly Val Gln Asp Ala Ala Leu

385 390 395 400

Ile Glu Ala Ile Gln Asp Arg Leu Ser Asn Thr Leu Gln Thr Tyr Ile

405 410 415

Arg Cys Arg His Pro Pro Pro Gly Ser His Leu Leu Tyr Ala Lys Met

420 425 430

Ile Gln Lys Leu Ala Asp Leu Arg Ser Leu Asn Glu Glu His Ser Lys

435 440 445

Gln Tyr Arg Cys Leu Ser Phe Gln Pro Glu Cys Ser Met Lys Leu Thr

450 455 460

Pro Leu Val Leu Glu Val Phe Gly Asn Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln

485 490 495

Trp Arg Pro Leu Glu Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser

500 505 510

Glu Glu Asp His Leu Asn Met His Thr Gly His His His His His His

515 520 525