本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種Clec4F納米抗體，以及該抗體在制備靶向結(jié)合Clec4F陽性巨噬細(xì)胞和競(jìng)爭(zhēng)抑制Clec4F和N-acetylgalactosamine(GalNAc)分子結(jié)合中的用途。

背景技術(shù)：

Clec4F蛋白全稱為C-type lectin domain family 4,member F(簡(jiǎn)稱Clec4F)，是一個(gè)包含550個(gè)氨基酸的二型跨膜C型凝集素(C type Lectin)，蛋白質(zhì)的C末端結(jié)構(gòu)域和其他C型凝集素的碳水化合物識(shí)別區(qū)同源。研究表明，其蛋白質(zhì)集中在肝臟組織巨噬細(xì)胞中表達(dá)，因此，Clec4F也常被稱為柯弗氏細(xì)胞(Kupffer cell)受體。

最初Clec4F在大鼠的肝臟中分離和發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)認(rèn)為它是肝臟海藻糖結(jié)合凝集素(hepatic fucose-binding lectin)。隨后發(fā)現(xiàn)Clec4F與半乳糖(galactose),N-乙酰氨基半乳糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)和糖脂類(Glycolipids)結(jié)合。Clec4F可能在從血液中清除半乳糖和海藻糖的糖蛋白的過程中發(fā)揮了重要作用。

Kupffer cell是位于肝臟血竇部位的最重要的一群肝臟組織巨噬細(xì)胞，Clec4F可以作為表面標(biāo)記物將Kupffer cell與肝臟中其它組織巨噬細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞區(qū)分開。C型凝集素參與了將脂類抗原提呈至抗原遞呈細(xì)胞的過程。NKT細(xì)胞是一種特殊的抗原提呈細(xì)胞，其主要特征為T細(xì)胞受體基因表達(dá)的恒定性、CD1d的限制性以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的迅速、高水平性。NKT細(xì)胞既能增強(qiáng)免疫反應(yīng)又能抑制免疫反應(yīng)，從而在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中發(fā)揮重要的作用。這種細(xì)胞可以被一種叫做α-半乳糖神經(jīng)酰胺(alpha-galactosylceramide，α-GalCer)的糖脂分子激活。NKT細(xì)胞被激活以后可以釋放大量的白介素4(IL-4)，干擾素(IFN-γ)和其他細(xì)胞因子，NKT細(xì)胞也被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)內(nèi)至關(guān)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞。小鼠NKT細(xì)胞占血液、外周淋巴結(jié)和脾臟中總T細(xì)胞數(shù)的0.5％。而超過30％的肝臟T細(xì)胞有NKT細(xì)胞表型，研究表明肝臟中的Kupffer cell是關(guān)鍵的NKT細(xì)胞提呈細(xì)胞。Kupffer cell可以和NKT細(xì)胞通過CD1d形成穩(wěn)定的連接，從而激活NKT細(xì)胞。同時(shí)Clec4F參與了α-GalCer抗原的提呈，α-GalCer與CD1d連接，從而激活NKT細(xì)胞。因此Clec4F可以作為Kupffer cell的表面標(biāo)記物，而且在糖脂抗原的提呈方面也有重要的貢獻(xiàn)。因此針對(duì)競(jìng)爭(zhēng)抑制Clec4F與N-acetylgalactosamine(GalNAc)分子結(jié)合所設(shè)計(jì)的抗體，將阻斷NKT細(xì)胞的激活通路，緩解免疫反應(yīng)。

抗體和抗體衍生物是研究細(xì)胞表面受體最常用的方法，特異性抗體不但可以用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床標(biāo)本檢測(cè)，而且可以作為受體的在體示蹤劑。駱駝屬動(dòng)物體內(nèi)存在缺失輕鏈的天然重鏈抗體，這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(VHH)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，用噬菌體文庫篩選和單克隆表達(dá)獲得VHH單域抗體，也稱為納米抗體(Camelid single-domain antibody-fragment,nanobody,Nb)。納米抗體的大小僅是普通IgG抗體的十分之一，具有高穩(wěn)定性、高親和力及容易標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。通過二十幾年的研究，納米抗體作為檢驗(yàn)、治療等特有的工具應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域。

目前尚未見到Clec4F納米抗體的研究報(bào)道，主要原因在于：Clec4F納米抗體的篩選與免疫動(dòng)物對(duì)Clec4F重組蛋白的免疫反應(yīng)程度、構(gòu)建噬菌體文庫和構(gòu)建表達(dá)載體的技術(shù)水平，以及免疫文庫的篩選等諸多實(shí)驗(yàn)因素有關(guān)。篩選獲得不但可以與Clec4F重組蛋白具有高親和力，而且同時(shí)能與肝臟中自然表達(dá)的Clec4F受體結(jié)合的納米抗體需要大量的實(shí)驗(yàn)積累。另外，Clec4F為新近發(fā)現(xiàn)的凝集素反應(yīng)蛋白家族分子，Clec4F作為構(gòu)建納米抗體的靶標(biāo)需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種Clec4F納米抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)Kupffer cell表面受體Clec4F構(gòu)建納米抗體，作為靶向結(jié)合Kupffer cell的分子探針，可以用于研究組織巨噬細(xì)胞在急慢性肝炎和肝癌中的作用，以及作為NKT細(xì)胞激活的阻斷劑。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開了一種Clec4F納米抗體，包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，該納米抗體特異性識(shí)別Clec4F蛋白(例如能夠抗鼠源Clec4F)。

所述Clec4F納米抗體的VHH鏈包括四個(gè)框架區(qū)域(framework region，F(xiàn)R)FR1～FR4和三個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)域(complementarity-determining region，CDR)CDR1～CDR3；所述Clec4F納米抗體的VHH鏈的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

其中，四個(gè)框架區(qū)域FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分別如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.8所示；三個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.7所示。

本發(fā)明公開了編碼Clec4F納米抗體的核苷酸序列，如SEQ.ID.NO.9所示。該DNA序列編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)選自：Clec4F納米抗體的VHH鏈或者Clec4F納米抗體。

本發(fā)明還提供一種原核表達(dá)載體，它含有上述編碼Clec4F納米抗體的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種原核宿主細(xì)胞，它含有上述原核表達(dá)載體。

本發(fā)明還公開了上述Clec4F納米抗體在炎癥檢測(cè)中的作用，具體為Clec4F納米抗體應(yīng)用于體外或體內(nèi)結(jié)合Kupffer cell表面Clec4F受體，從而監(jiān)測(cè)炎癥的發(fā)生和發(fā)展的過程。所述炎癥包括急性肝炎，慢性肝炎，肝癌等。

本發(fā)明還公開了上述Clec4F納米抗體在制備Clec4F受體拮抗劑中的用途。

本發(fā)明還涉及Clec4F納米抗體在非疾病診斷治療目的的免疫學(xué)檢查分析中的應(yīng)用，可以通過將Clec4F納米抗體在制備吸附Clec4F蛋白的試劑中的使用，例如可以將本發(fā)明Clec4F納米抗體制作成Clec4F免疫親和柱，吸取或者富集Clec4F或富集能與Clec4F結(jié)合的受體或者細(xì)胞，以供進(jìn)一步研究。

本發(fā)明所述的氨基酸序列可以作為前體，進(jìn)行隨機(jī)、點(diǎn)突變或者人源化改造，獲得親和力、特異性或者穩(wěn)定性更高，免疫原性低的突變體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明通過深入研究肝臟中Kupffer cell表面C型凝集素家族成員Clec4F的配體識(shí)別和受體活化的機(jī)制，采用噬菌體展示技術(shù)對(duì)Clec4F納米抗體進(jìn)行表達(dá)；通過生物淘篩技術(shù)篩選出與抗原具有較高結(jié)合力的納米抗體；本發(fā)明表達(dá)并優(yōu)化獲得親和力高且穩(wěn)定均一的Clec4F納米抗體蛋白，開辟了靶向Clec4F的納米抗體在肝炎和肝癌的分子影像學(xué)和NKT細(xì)胞活性抑制劑的新領(lǐng)域，具有良好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為Clec4F納米抗體噬菌體文庫的DNA電泳圖。

圖2為Clec4F納米抗體噬菌體展示文庫的生物淘篩結(jié)果(用ELISA檢查連續(xù)4次生物淘篩的Clec4F特異性噬菌體富集率)。

圖3為Clec4F納米抗體純化鑒定圖，Ladder：相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)。

圖4為用ELISA檢測(cè)Clec4F納米抗體親和力曲線。

圖5為利用納米抗體在刀豆素A(Concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎中測(cè)定Clec4F表達(dá)的結(jié)果，圖中按照從左到右，從上至下的順序分別顯示正常小鼠肝臟(Naive)、ConA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)小鼠肝臟的四種染色的融合結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

根據(jù)前期的肝炎和正常肝組織的表達(dá)譜篩選出了Clec4F分子，并驗(yàn)證了Clec4F對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)的專一性，從而進(jìn)一步確定Clec4F為構(gòu)建納米抗體的靶標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，從羊駝免疫的重鏈抗體中篩選能與靶重組蛋白Clec4F特異性結(jié)合的納米抗體克隆，以作為Kupffer cell的特異性探針，用于肝炎和肝癌的分子探針和NKT細(xì)胞的活性抑制劑。

本發(fā)明采用的Clec4F特異性結(jié)合的納米抗體的篩選路線：1、通用Clec4F重組蛋白對(duì)羊駝進(jìn)行免疫，分離血液中的淋巴細(xì)胞，利用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建噬菌體展示文庫；2、經(jīng)過生物淘篩法獲得與Clec4F蛋白結(jié)合的噬菌體；3、經(jīng)測(cè)序后和生物比對(duì)后，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法篩選出抗Clec4F的高親和力納米抗體，并用Kupper cell細(xì)胞驗(yàn)證納米抗體的結(jié)合能力。

1、以Clec4F為抗原的納米抗體文庫的構(gòu)建

1)羊駝淋巴細(xì)胞中VHH基因的擴(kuò)增

使用小鼠淋巴瘤細(xì)胞系NS0(中科院上海生科院細(xì)胞資源中心)真核表達(dá)體系表達(dá)，并利用N端的His標(biāo)簽純化得到的Clec4F重組蛋白(Entrez Gene IDs：51811，Ala65-Fly548區(qū)域)作為抗原，Clec4F蛋白的糖基增強(qiáng)了抗原的免疫原性，用100μg Clec4F重組蛋白免疫羊駝五次，每次間隔3周，在此過程中免疫動(dòng)物體內(nèi)的漿細(xì)胞分泌大量針對(duì)Clec4F的抗體。獲得全血50mL后，通過淋巴分離液對(duì)不同細(xì)胞組分進(jìn)行分層，分離出淋巴細(xì)胞。用Trizol法提取淋巴細(xì)胞RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)獲得cDNA。隨后通過兩次PCR反應(yīng)確保分離出編碼構(gòu)建VHH的基因：

第一次PCR獲得重鏈抗體基因：用淋巴細(xì)胞的cDNA作為PCR模板，加入覆蓋免疫球蛋白IgG所涉及的上下游引物Primer call 01和Primer call 02，用于擴(kuò)增出IgG的不同亞型，同時(shí)加入dNTP、Taq DNA聚合酶(Roche)等進(jìn)行PCR反應(yīng)，1％瓊脂糖膠鑒定PCR結(jié)果，膠回收IgG2和IgG3的基因條帶(600-800bps)，并測(cè)定膠回收DNA濃度。

第二次巢式PCR獲得VHH基因同時(shí)插入酶切位點(diǎn)：加入覆蓋IgG2和IgG3重鏈區(qū)域VHH序列的Primer A6E和Primer 38作為引物，此上下游引物分別設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)Not I和Nco I，同時(shí)加入dNTP、Taq DNA聚合酶(Roche)等進(jìn)行PCR反應(yīng)，取少量PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖膠鑒定結(jié)果，獲得建庫用VHH大量DNA并用DNA純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物。

2)VHH基因與噬菌體載體pHEN4的鏈接、轉(zhuǎn)染和文庫的表達(dá)

在PCR反應(yīng)過程中通過引物在目的基因兩端加入酶切位點(diǎn)，便于構(gòu)建噬菌體表達(dá)pHEN4質(zhì)粒，具體為將pHEN4噬菌體表達(dá)載體(Addgene)和第二次PCR獲得的DNA產(chǎn)物，用Not I和Nco I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，置于37℃水浴中過夜，1％瓊脂糖膠鑒定酶切結(jié)果，再加入DNA連接酶之后過夜連接酶切DNA和pHEN4載體，并純化重組質(zhì)粒條帶。

通過電轉(zhuǎn)染將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入過夜培養(yǎng)的TG1大腸桿菌(Addgene)感受態(tài)細(xì)胞中，之后將轉(zhuǎn)染宿主菌在LB液體培養(yǎng)基中于37℃搖床培養(yǎng)1小時(shí)，再用LB培養(yǎng)基分別進(jìn)行1/1⁰，1/10²,1/10³倍稀釋，分別取500μL稀釋過的菌液涂布在LB固體培養(yǎng)皿表面，過夜于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)TG1細(xì)胞，第二天根據(jù)平板上的菌落數(shù)計(jì)算出庫容量為2×10⁷。

隨機(jī)挑選30個(gè)克隆，用針對(duì)pHEN4質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)的RP和GIII上下游引物，同時(shí)加入dNTP、Taq DNA聚合酶(Roche)等進(jìn)行PCR反應(yīng)，如圖1所示，經(jīng)過1％瓊脂糖膠鑒定確定噬菌體展示文庫的插入率達(dá)到為74％以上，證明文庫構(gòu)建成功。

2、采用噬菌體展示技術(shù)篩選與Clec4F蛋白結(jié)合的噬菌體

1)噬菌體文庫中的生物淘篩環(huán)節(jié)，是保證獲得特異性結(jié)合Clec4F噬菌體的重要步驟，本發(fā)明進(jìn)行了連續(xù)4次生物淘篩，淘篩中的洗脫步驟去除不能和Clec4F抗原結(jié)合的噬菌體，而能與抗原結(jié)合的噬菌體在每一輪淘篩中得到了富集。具體操作為在96孔板的兩孔中分別包被(coating)或者不包被(uncoating)Clec4F重組蛋白，標(biāo)記為“+”或“-”，隨后將噬菌體文庫分別與2個(gè)孔在室溫進(jìn)行孵育。第1輪生物淘篩用PBST緩沖液(Sigma)洗滌多次后，去除不能與Clec4F結(jié)合的噬菌體，剩下能夠與Clec4F結(jié)合的噬菌體，使用TEA溶液(Sigma)將其溶解下來并與helper phage(Thermo fisher)同時(shí)感染TG1宿主菌，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，進(jìn)入下一輪新的篩選，過程同上。

2)ELISA法檢測(cè)生物淘篩富集率，用脫脂奶粉封閉Clec4F包被的ELISA平板，分別加入4輪生物淘篩的噬菌體培養(yǎng)液，隨后加入辣根過氧化物酶anti-phage antibody-HRP抗體(Life technology)，室溫孵育1小時(shí)后，再加入酶底物ABTS和H₂O₂，經(jīng)過分光光度計(jì)OD405nm測(cè)定ELISA顯色結(jié)果，從圖2可以看出，每一輪篩選，表達(dá)VHH的噬菌體與Clec4F的結(jié)合酶學(xué)反應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)，從而判斷Clec4F特異性噬菌體在連續(xù)4輪篩選中得到了富集。

3、用酶聯(lián)免疫學(xué)方法篩選和Clec4F結(jié)合的陽性單克隆

從每輪生物淘篩的TG1細(xì)菌培養(yǎng)皿中隨機(jī)挑選克隆，置于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)菌指數(shù)生長期后加入IPTG誘導(dǎo)劑，過夜表達(dá)蛋白。第二天去除每個(gè)克隆的培養(yǎng)基上清，裂解TG1細(xì)胞后將細(xì)胞裂解液，加入提前用脫脂奶粉封閉過的Clec4F包被的ELISA平板，再加入anti-HA mouse antibody單克隆抗體(Covance)，室溫孵育1h，最后加入堿性磷酸酶標(biāo)記anti-mouse IgG Ab(Life technology)和堿性磷酸酶底物，經(jīng)過分光光度計(jì)A405nm測(cè)定ELISA顯色結(jié)果。對(duì)吸光度值高于陰性對(duì)照3倍的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序(見表1)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果按照IMGT法將納米抗體進(jìn)行比對(duì)和分組，從互補(bǔ)確定區(qū)(complementarity-determining region)CDR3相同組中選取表達(dá)量高的有代表性的納米抗體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1.生物淘篩中隨機(jī)挑選TG1細(xì)胞單克隆的PE-ELISA統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表1為生物淘篩第2和3輪(Round 2and Round 3)隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行PE-ELISA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，表1中斜體數(shù)字顯示2輪篩選中的陽性克隆數(shù)，陽性信號(hào)(Specific signal)高于背景信號(hào)(background)3倍(>3fold)的克隆被定義為陽性克隆。

4、納米抗體大量表達(dá)和純化

用Nco I和Eco9II限制性內(nèi)切酶對(duì)含有納米抗體基因的pHEN4質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將所得目的基因片段插入pHEN6空質(zhì)粒載體(Addgene)后，轉(zhuǎn)染Escherichia coli WK6(Addgene)感受態(tài)大腸桿菌。將WK6在1L培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長指數(shù)期，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)納米抗體，過夜培養(yǎng)后離心收集WK6，獲得含有納米抗體的細(xì)菌裂解液，用金屬螯合親和色譜(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)親和層析法進(jìn)行初步純化，用0.5M咪唑洗脫帶有His tag的納米抗體，再用體積排阻層析(size exclusion chromatography)對(duì)納米抗體進(jìn)行二次純化，用PBS進(jìn)行洗脫，通過A 260測(cè)定納米抗體濃度，蛋白質(zhì)凝膠電泳方法和考馬斯亮藍(lán)法染色鑒定納米抗體的純度和分子量大小，并計(jì)算納米抗體的表達(dá)量(見圖3、表2)。

表2.Clec4F納米抗體在1升TB培養(yǎng)基中的表達(dá)量

表2中：2.22代表第2組第22個(gè)，5.10代表第5組第10個(gè)，6.19代表第6組第19個(gè)，8.37代表第8組第37個(gè)，10.16代表第10組第16個(gè)，12.75代表第12組第75個(gè)，NbBCII10作為陰性對(duì)照。

參見圖3，經(jīng)過IMAC親和層析法和體積排阻層析法純化后，用12％SDS-PAGE凝膠電泳分析Clec4F納米抗體和陰性對(duì)照抗體的純度，考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，結(jié)果說明納米抗體的大小在15kDa左右，無其它雜蛋白。

5、采用ELISA技術(shù)測(cè)定納米抗體與Clec4F蛋白的親和力

用Clec4F重組蛋白包被96孔平板過夜，用脫脂奶粉室溫封閉平板2小時(shí)，將納米抗體(Nb2.22納米抗體的VHH鏈包括四個(gè)框架區(qū)域FR1～FR4和三個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)域CDR1～CDR3；納米抗體的VHH鏈的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示)進(jìn)行1/2梯度稀釋后加入平板孵育1小時(shí)，再加入anti-mouse His Ab單克隆抗體(eBioscience)和堿性磷酸酶標(biāo)記的anti-mouse IgG Ab-AP單克隆抗體(Roche)，加入底物反應(yīng)后，用微孔讀板儀測(cè)OD 405nm的值。

進(jìn)行梯度稀釋的Clec4F納米抗體與包被在ELISA平板上的Clec4F重組蛋白反應(yīng)，通過將實(shí)驗(yàn)獲得的A405值用X＝log(X)方程進(jìn)行對(duì)數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)化，之后用縱坐標(biāo)濃度數(shù)據(jù)取標(biāo)準(zhǔn)誤，再用Sigmoidal擬合曲線法進(jìn)行ELISA的曲線繪制和擬合，納米抗體Nb2.22、5.10、6.19、8.37、10.16和12.75都和Clec4F重組蛋白有結(jié)合反應(yīng)，因此酶學(xué)反應(yīng)為陽性，同型對(duì)照抗體BCII10和Clec4F完全沒有結(jié)合，據(jù)此證明Clec4F納米抗體可以特異結(jié)合Clec4F重組蛋白(見圖4)。

6、納米抗體在小鼠刀豆素A(Concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)的急性肝炎中測(cè)定Clec4F表達(dá)。

如采用步驟5中納米抗體和anti-HA-AF594(Molecular Probes)，聯(lián)合DAPI，F(xiàn)4/80(巨噬細(xì)胞標(biāo)記)單克隆抗體anti-F4/80-AF488(Invitrogen)或CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記)單克隆抗體anti-CD31-AF647(Invitrogen)對(duì)小鼠肝臟冰凍切片進(jìn)行染色，結(jié)果表明(圖5)，在正常小鼠肝臟中顯示大量Kupffer cell，隨著炎癥的發(fā)生ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝炎后3小時(shí)，6小時(shí)和12小時(shí)后Kupffer cell凋亡，48小時(shí)后Kupffer cell在肝臟中重新出現(xiàn)，證明納米抗體能夠通過檢測(cè)Kupffer cell表面Clec4F標(biāo)志物，從而觀測(cè)急性肝炎中肝臟的損傷、修復(fù)和組織巨噬細(xì)胞的再生。

序列表

<110> 西安交通大學(xué)

<120> 一種Clec4F納米抗體及其應(yīng)用

<160> 9

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213>Alpaca

<400> 1

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Phe Ile

16 20 25 30

Thr Tyr Gly Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg

31 35 40 45

Glu Phe Val Val Thr Gly Asn Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Leu Pro

46 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

61 65 70 75

Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

76 80 85 90

Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Arg Arg Trp Val Pro Ala Thr Ala Val

91 95 100 105

Asp Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

106 110 115 120

Ser

121

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 2

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

16 20 25

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 3

Gly Ala Thr Phe Ile Thr Tyr Gly

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 4

Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

1 5 10 15

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 5

Val Thr Gly Asn Gly Ala Gly Thr

1 5

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 6

Thr Tyr Leu Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro

16 20 25 30

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

31 35

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Alpaca

<400>7

Gly Gly Arg Arg Trp Val Pro Ala Thr Ala Val Asp Gly Val Ala Tyr

1 5 10 15

<210>8

<211>11

<212> PRT

<213> Alpaca

<400>8

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>9

<211>390

<212> DNA

<213> 人工合成

<400>9

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggt ttggttcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgcgcag cctctggagc cactttcatt acgtatggca tgacctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtggcagct gtgaccggga atggtgccgg cacaacgtat 180

ctgccctccg tgaagggccg atttaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga gcagcctgaa gcctgaggac acggccgttt attactgtgg cgggcggcga 300

tgggtacccg ctactgcagt cgatcaagtc gcgtactggg gccaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctcac accaccatca ccatcactaa 390