本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從動(dòng)物組織得到的蛋白以及在生物制藥中的用途。

背景技術(shù)：
：

青霉素的發(fā)現(xiàn)使得人們能夠?qū)Ω陡黝?lèi)病原微生物感染所引發(fā)的相關(guān)疾病，由此衍生出的各類(lèi)抗生素更是對(duì)保護(hù)人類(lèi)健康做出了巨大貢獻(xiàn)。但是由于人們對(duì)這些“傳統(tǒng)抗生素”的長(zhǎng)期使用和濫用，導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)它們產(chǎn)生了耐藥性。多重耐藥的超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)使開(kāi)發(fā)新型抗微生物藥物變得尤其緊迫?？咕氖且活?lèi)分子量小于1萬(wàn)，由10-50個(gè)氨基酸組成的、具有殺滅或抑制微生物生長(zhǎng)的活性多肽。最新研究表明：抗菌肽不但具有廣譜的抗微生物活性，同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無(wú)法比擬的優(yōu)越性：如，除了可以直接殺滅微生物和很難誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性外，抗菌肽還可以調(diào)節(jié)宿主的免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)，間接地在感染性疾病治療中發(fā)揮作用(Nat Rev Microbiol,2012,10(4):243-254)。此外，在嚴(yán)重細(xì)菌感染時(shí)，抗菌肽還能夠中和內(nèi)毒素、減輕膿毒癥，在快速殺滅病原微生物的同時(shí)迅速停止或限制感染擴(kuò)散(Antimicrob Agents Chemother,2014,58(9):5363-5371)。因此，抗菌肽有希望成為新一代抗微生物藥物。

目前，對(duì)多肽類(lèi)抗微生物藥物的研制受到了日益廣泛的重視(Future Med Chem,2013，5(3)；315-337)。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，截至目前，至少有20種從不同生物分離得到的活性多肽候選藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段(Future Med Chem,2013,5(3):315-337)。如，Xoma公司研發(fā)的用于治療腦膜炎球菌血癥的孤兒藥Neuprex和Cutanea life science公司研發(fā)的用于治療紅斑痤瘡的Omiganan外用乳膏均進(jìn)入三期臨床研究(Curt Protein Pept Sci,2012,13(7):611-619)；另外，Ellceutix公司研發(fā)的用于治療MRSA引起的皮膚感染藥物PMX-30063已經(jīng)進(jìn)入開(kāi)發(fā)臨床前研究(Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(12):1477-1486)。

很多兩棲類(lèi)動(dòng)物作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥和民族藥物被廣泛應(yīng)用。如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類(lèi)動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報(bào)道藥理活性有：抗微生物、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、對(duì)心血管系統(tǒng)作用等(Dongwuxue Yanjiu,2015,36(4):183-222；Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。在國(guó)外，兩棲類(lèi)皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌物獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已經(jīng)作為抗菌藥物被microbiological biotech公司用于治療糖尿病人足部潰瘍(Curr Protein Pept Sci,2012,13(8):723-738.)。

我國(guó)對(duì)兩棲類(lèi)藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類(lèi)物質(zhì)研究不多。沼水蛙(Hylarana guentheri)主要分布于我國(guó)中南部各省、臺(tái)灣、海南島和香港，是我國(guó)特色資源動(dòng)物之一。

發(fā)明人將本發(fā)明的沼水蛙分泌肽的全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的沼水蛙分泌肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)背景，提供種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽(yáng)性細(xì)菌、真菌和病毒)的沼水蛙分泌肽及其基因和它作為制備病原微生物感染性疾病的治療藥物和美容護(hù)膚藥物的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種沼水蛙分泌肽，所述的沼水蛙分泌肽是由43個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量5005.97道爾頓，等電點(diǎn)9.481，其氨基酸序列為：Gly Leu Phe Ser Lys Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Ser Trp Ile Lys Gly Val Phe Lys Gly Ile Lys Gly Ile Gly Lys Glu Val Gly Gly Asp Val Ile Arg Thr Gly Ile Glu Ile Ala Ala Cys Lys Ile Lys Gly Glu Cys(GLFSKKGGKGGKSWIKGVFKGIKGIGKEV GGDVIRTGIEIAACKIKGEC)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三十七半胱氨酸和第四十三位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述沼水蛙分泌肽的編碼基因由359個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為其序列為(SEQ ID NO.4)：

序列中第133-261位核苷酸編碼具有功能的成熟沼水蛙分泌肽(SEQ ID NO.1)。

所述沼水蛙分泌肽可在制備病原微生物感染性疾病的治療藥物和美容護(hù)膚藥物應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于:

由沼水蛙分泌肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的沼水蛙分泌肽具有顯著的抑制細(xì)菌、真菌、病毒生長(zhǎng)和抗氧化作用。該沼水蛙分泌肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗菌譜系廣的有益特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明沼水蛙分泌肽HPLC純化鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明沼水蛙分泌肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明沼水蛙分泌肽清除DPPH自由基“量-效”關(guān)系曲線；

圖4為本發(fā)明沼水蛙分泌肽清除ABTS自由基“量-效”關(guān)系曲線；

圖5為本發(fā)明沼水蛙分泌肽抑制流感病毒介導(dǎo)的細(xì)胞間融合效果。圖A、B和C中沼水蛙分泌肽濃度分別為10μM、1uM和0μM，圖D是無(wú)病毒無(wú)樣品對(duì)照。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

本發(fā)明的沼水蛙分泌肽，所述的沼水蛙分泌肽由43個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量5005.97道爾頓，等電點(diǎn)9.481，其氨基酸序列為：Gly Leu Phe Ser Lys Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Ser Trp Ile Lys Gly Val Phe Lys Gly Ile Lys Gly Ile Gly Lys Glu Val Gly Gly Asp Val Ile Arg Thr Gly Ile Glu Ile Ala Ala Cys Lys Ile Lys Gly Glu Cys(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三十七半胱氨酸和第四十三位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述沼水蛙分泌肽的基因序列SEQ ID NO.4的第133-261位核苷酸編碼。本發(fā)明的沼水蛙分泌肽及其基因的制備過(guò)程包括如下步驟：

實(shí)施例1，沼水蛙分泌肽基因克隆：

I、沼水蛙皮膚總RNA提?。夯铙w沼水蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為沼水蛙皮膚總RNA。

II、沼水蛙皮膚mRNA的純化：沼水蛙皮膚mRNA分離純化采用美國(guó)PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取沼水蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的沼水蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到沼水蛙皮膚mRNA。

III、沼水蛙皮膚cDNA文庫(kù)構(gòu)建：采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無(wú)菌的離心管加入1μl沼水蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：將通過(guò)PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過(guò)的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl沼水蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過(guò)的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個(gè)單獨(dú)克隆。

Ⅳ、沼水蛙分泌肽基因克隆篩選：擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCTTGAAGAAACC CCTG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35個(gè)循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫(kù)，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過(guò)夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽(yáng)性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

Ⅴ、沼水蛙分泌肽基因序列測(cè)定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)Applied Biosystems 373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)?；驕y(cè)序結(jié)果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

沼水蛙分泌肽基因核苷酸的序列表為：序列長(zhǎng)度為359個(gè)堿基；序列類(lèi)型：核酸；鏈數(shù)：?jiǎn)捂?；拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類(lèi)：cDNA；來(lái)源：沼水蛙皮膚。

根據(jù)沼水蛙分泌肽的基因推斷編碼由功能的成熟活分泌肽為第133-261位核苷酸，氨基酸序列為：GLFSKKGGKGGKSWIKGVFKGIKGIGKEV GGDVIRTGIEIAACKIKGEC(見(jiàn)序列SEQ ID NO.1)

實(shí)施例2，沼水蛙分泌肽的制備：

Ⅰ、沼水蛙分泌肽的制備方法：根據(jù)沼水蛙分泌肽的基因推斷編碼由功能的成熟活分泌肽氨基酸序列后用自動(dòng)多肽合成儀合成多肽。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時(shí)A液體為0.05％TFA+2％CH₃CN，B液為0.05％TFA+90％CH₃CN，多肽出現(xiàn)在15分鐘B液濃度在32-47％，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。

Ⅱ、分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的沼水蛙分泌肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

沼水蛙分泌肽是中國(guó)兩棲類(lèi)動(dòng)物沼水蛙分泌肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，5005.97道爾頓，等電點(diǎn)9.481，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：GLFSKKGGKGGKSWIKGVFKGIKGIGKEVGGDVIRTGIEIAACKIKGEC，其第三十七位半胱氨酸和第四十三位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

實(shí)施例3，沼水蛙分泌肽的活性實(shí)驗(yàn)

Ⅰ、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)能力測(cè)定

抗菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20m1于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5m1菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.l ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1所示，合成的沼水蛙分泌肽能顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

表1.沼水蛙分泌肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)活性

Ⅱ、抑制真菌生長(zhǎng)能力測(cè)定

抗真菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后測(cè)量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于云南大學(xué)微生物研究所，此實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，取幾何平均值，結(jié)果如表2所示，合成的沼水蛙分泌肽能顯著的抑制真菌生長(zhǎng)。

表2.沼水蛙分泌肽抑制真菌生長(zhǎng)活性

Ⅲ、抗氧化能力測(cè)定

1)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

利用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測(cè)定法研究抗氧化多肽。配制濃度為1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2ml，0.1mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液加入到含有2ml不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測(cè)定吸光度，吸光值越小，表明自由基清楚能力越強(qiáng)。

清除率(％)＝【1-(A_i-A_j)/A₀】*100％

式中，A₀為2ml，0.1mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液+2ml的樣品試劑，空白對(duì)照，A_i為2ml,0.1mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液+2ml的樣品，A_j為2ml的無(wú)水乙醇+2ml的樣品。

2)ABTS自由基清除活性的測(cè)定

以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達(dá)到7mmol/L，加入過(guò)硫酸鉀，使過(guò)硫酸鉀的濃度為2.45nmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過(guò)夜12～16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30秒鐘，暗處反應(yīng)10分鐘，然后在734nm下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。

清楚率(％)＝(A_i-A_j)/A₀*100％

式中，A₀為2.9ml ABTS試劑與0.1ml蒸餾水混合液的吸光值，A_j為2.9ml ABTS+0.1ml的酶解液混合液的吸光值。

如圖3和4所示，沼水蛙分泌肽能顯著清除DPPH和ABTS自由基。自由基氧化在老年癡呆癥、帕金森氏癥、糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥引發(fā)的神經(jīng)退行性疾病中有重要作用?；⒓y蛙蛋白酶抑制肽能很好的清除自由基能說(shuō)明其能應(yīng)用于自由基氧化導(dǎo)致的相關(guān)疾病的治療。另外，為了防止自由基對(duì)皮膚造成的損害，在美容護(hù)膚品中添加自由基清除劑比不可少。因此，虎紋蛙蛋白酶抑制肽也可以應(yīng)用于美容護(hù)膚品中。

Ⅳ、流感病毒增殖的抑制能力測(cè)定

1)對(duì)五種不同H5N1假病毒的進(jìn)入抑制能力測(cè)定

H5N1假病毒的制備與藥物處理：細(xì)胞用含10％小牛血清、1％谷氨酰胺、2％青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞以3x10⁵/ml密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃、5％CO₂培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞密度達(dá)到80％左右時(shí)，按照PEI轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)步驟操作。在一支無(wú)菌小管中加入15μl PEI轉(zhuǎn)染試劑和200μl不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，混勻室溫靜置5min。往PEI-DMEM混合液中加入3μg pNL4-3.luc.R-E-,1μg HA,1μg NA質(zhì)粒，混勻室溫靜置30min，以便形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)六孔板，使其分布均勻。5％CO₂，37℃培養(yǎng)10h，將培養(yǎng)液更換成含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，2000rpm離心5min收集細(xì)胞培養(yǎng)，含假病毒的上清液在96孔板中被稀釋到每孔1ng/p24濃度后分別與2倍稀釋到不同濃度的沼水蛙分泌肽和陽(yáng)性對(duì)照藥物CL385319在37℃孵育30min。

假病毒進(jìn)入的抑制作用檢測(cè)：1X10⁴個(gè)/孔MDCK細(xì)胞以接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h。將上述孵育好的假病毒混合液分別加入到含MDCK細(xì)胞的96孔板中在37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸走培養(yǎng)上清，用PBS洗兩次細(xì)胞，每孔加50μl裂解液，震蕩20min，待細(xì)胞裂解后吸取40μl裂解物到白板，加入熒光素酶顯色底物(Promega,Madison,WI,US)，在多功能酶標(biāo)儀(Genios Pro,Tecan,US)上檢測(cè)化學(xué)發(fā)光值，判斷藥物抑制病毒進(jìn)入的活性。化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100,其中E代表實(shí)驗(yàn)組的化學(xué)發(fā)光值，P代表陽(yáng)性也就是不加藥物只加病毒的化學(xué)發(fā)光值，N代表陰性對(duì)照組的化學(xué)發(fā)光值?；衔锏陌霐?shù)抑制濃度(IC₅₀)作為化合物抗病毒活性的指標(biāo)，通過(guò)Calccusyn軟件計(jì)算得出。如表3所示，沼水蛙分泌肽對(duì)各種不同H5N1假病毒均有很好的抑制活性。

表3.沼水蛙分泌肽抗H5N1禽流感假病毒感染的抑制活性

2)對(duì)A/Thailand/Kan353/2004-HA病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合抑制能力測(cè)定

LinXA細(xì)胞以4×10⁵/孔接種到12孔板。16h后，A/Thailand/Kan353/2004-HA質(zhì)粒0.8ugDNA/孔用Lipofectamine LTX(Life Technologies)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h后轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基用含10％FBS的DMEM替換。24h后用無(wú)血清DMEM洗滌細(xì)胞，并用胰酶消化細(xì)胞，10％FBS–DMEM洗滌去掉胰酶，細(xì)胞分別與0.5ml 0.2％FBS–DMEM稀釋的沼水蛙分泌肽和DMSO37℃孵育15min。吸去上清洗滌兩次后細(xì)胞在0.5ml含相應(yīng)濃度或水的pH5.0的DMEM溶液中37℃孵育15min.用10％FBS–DMEM洗滌細(xì)胞，細(xì)胞在1ml完全培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)3h。吸去培養(yǎng)基后用4％甲醛處理，在×100顯微鏡下觀察記錄。如圖5所示，合成的沼水蛙分泌肽能明顯抑制A/Thailand/Kan353/2004-HA介導(dǎo)的細(xì)胞融合。

從表3和圖5所示，沼水蛙分泌肽通過(guò)抑制細(xì)胞融合而具有抑制流感病毒在細(xì)胞內(nèi)增值，因此，其可以用作治療病毒性感冒的藥物。

SEQUENCE LISTING

<110> 1

南方醫(yī)科大學(xué)

<120> 沼水蛙分泌肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 49

<212> PRT

<213> Hylarana guentheri

<400> 1

Gly Leu Phe Ser Lys Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Ser Trp Ile Lys

1 5 10 15

Gly Val Phe Lys Gly Ile Lys Gly Ile Gly Lys Glu Val Gly Gly Asp

20 25 30

Val Ile Arg Thr Gly Ile Glu Ile Ala Ala Cys Lys Ile Lys Gly Glu

35 40 45

Cys

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttcacct tgaagaaacc cctg 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attctagagg ccgaggcggc cgacatg 27

<210> 4

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgttcacct tgaagaaacc cctgttactg attgtccttc ttgggatcat ctccatatct 60

ctctgtgagc aagagagaca tgctgatgaa gaggaggaaa gcgaaataaa aagaggtctt 120

ttctctaaaa aaggcgggaa aggcggcaaa agttggatta agggtgtctt caaagggatc 180

aagggcatag gcaaggaagt tggtggggat gtgatcagaa ctgggataga aattgcagca 240

tgtaaaatta aaggtgaatg ttaaaacctg aattggaatc atctgatgtt caatatcatt 300

tagctaaatg ctaatgtcta ataaacgaaa agcaatgtca aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 359

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24