本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種TRAIL變體蛋白制備及其應(yīng)用。

二、

背景技術(shù)：

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族一個(gè)新成員，它與腫瘤細(xì)胞上的死亡受體4、5(death receptor 4、5,DR4,DR5)結(jié)合后，形成誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合物(death-inducing signaling complex,DISC)，DISC結(jié)合Caspase8前體，激活Caspase8前體并水解Caspase8前體，進(jìn)而激活caspases-3,-6與-7，從而引起細(xì)胞凋亡。由于TRAIL可以選擇性地誘導(dǎo)黑色素癌，淋巴癌，結(jié)腸癌，肺癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡但是對(duì)大部分正常細(xì)胞的影響很小，因而TRAIL是一個(gè)非常有前景的抗腫瘤藥物(Ichikawa et al.,Cancer Res,2001；Frese et al.,Nat Med,2006)。

為了增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性，一些研究者做了不少有益嘗試。Rozanov等研究表明TRAIL的N端與亮氨酸融合表達(dá)，可以穩(wěn)定TRAIL的三聚體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高TRAIL誘導(dǎo)凋亡活性(Rozanov et al.,Mol Cancer Ther,.2009)。Qin將ELP與His tag融合后，結(jié)果也顯著提高TRAIL誘導(dǎo)凋亡活性(Qin et al.,Nat Med,2001)。之前，我們的研究結(jié)果表明，RGD與TRAIL(RGD-TRAIL)進(jìn)行融合表達(dá)后，可以提高對(duì)于一些含有α_νβ₃和α_νβ₅整聯(lián)蛋白細(xì)胞親和力，在體內(nèi)結(jié)果也顯示有更多RGD-TRAIL融合蛋白進(jìn)入腫瘤組織。RGD-TRAIL存在5個(gè)半胱氨酸或兩對(duì)二硫鍵，若在E.coli進(jìn)行表達(dá)純化，很難獲得可溶性的RGD-TRAIL。此外，RGD-TRAIL粒徑較小(8nm)，在體內(nèi)半衰較短，會(huì)影響其在體內(nèi)的抗腫瘤效果。

因此，提高RGD-TRAIL可溶性表達(dá)，快速且簡(jiǎn)單純化蛋白，提高RGD-TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性及有效放大RGD-TRAIL蛋白粒徑，是本發(fā)明要解決的問(wèn)題。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問(wèn)題是提高RGD-TRAIL可溶性表達(dá)，簡(jiǎn)化蛋白純化工藝，增強(qiáng)其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性及改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)，以取得在體內(nèi)有良好的抗腫瘤效果。

為了解決此問(wèn)題，本發(fā)明是將RGD-TRAIL與類(lèi)彈性蛋白多肽(ELP)進(jìn)行融合表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)融合蛋白可溶性表達(dá)，利用ELP嵌段具有自聚集性質(zhì)，通過(guò)可逆相變方式純化蛋白，以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快速純化蛋白及RGD-TRAIL-ELP自組裝成納米微粒，達(dá)到放大蛋白徑粒目的。所述的類(lèi)彈性蛋白多肽其氨基酸序列是：

GHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVP。

所述融合蛋白R(shí)GD-TRAIL-ELP的序列：

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFY YIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGGGACDCRGDCFCGGPDGHGVGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVPGHGVPGVGVPGHGVPGHGVPGHGVP

所述的可逆相變純化方式是：細(xì)菌破碎液4度12000g離心5分鐘取上清；將上清在40度下加熱，40度下12000g離心取5分鐘，取沉淀部分；將沉淀部分用預(yù)冷的pbs緩沖液溶解，放在4度下15分鐘，4度12000g離心5分鐘取上清，如此4度離心取上清及40度下取沉淀循環(huán)三次；所述的自組裝方法是：純化后的RGD-TRAIL-ELP經(jīng)冷凍干燥的，用生理鹽水溶解(蛋白質(zhì)的終濃度為0.5mg/ml)。

與現(xiàn)有的TRAIL變體相比，本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于：

(1)發(fā)明了一種融合類(lèi)彈性類(lèi)多肽的RGD-TRAIL變體蛋白，實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，并通過(guò)離心的方法純化了該蛋白。該蛋白可以形成較多的三聚體形式，進(jìn)而提高其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性。

(2)發(fā)明了一種RGD-TRAIL變體蛋白可以在生理?xiàng)l件下自組裝成納米微粒，并在腫瘤動(dòng)物模型等證實(shí)該蛋白在體內(nèi)能產(chǎn)生更好地腫瘤抑制效果。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種全新的、高效的、安全的、低廉的、RGD-TRAIL變體蛋白制備方法，該蛋白用于腫瘤抑制。

四、附圖說(shuō)明

圖1、融合類(lèi)彈性類(lèi)多肽的RGD-TRAIL變體蛋白(RGD-TRAIL-ELP)表達(dá)與純化

(1A)SDS-PAGE分析RGD-TRAIL-ELP表達(dá)：泳道1：細(xì)菌未誘導(dǎo)；泳道2：細(xì)菌用IPTG誘導(dǎo)后離心破碎后上清部分；泳道3：第一輪ITC后可溶性蛋白；泳道4：第二輪ITC后可溶性蛋白；泳道5：第三輪ITC后可溶性蛋白；泳道6：Marker。非變性(-DTT)聚丙烯酰胺凝膠電泳(1B)及HPLC(1C)分析RGD-TRAIL-ELP。

圖2、RGD-TRAIL-ELP粒徑表征

動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定0.5mg/ml RGD-TRAIL-ELP在10℃與37℃下粒徑分布(2A)，冷凍蝕刻-透射電鏡測(cè)定RGD-TRAIL粒徑(37℃，2B)及RGD-TRAIL-ELP粒徑(10℃，2C)及(37℃，2D)；37℃及10℃ RGD-TRAIL-ELP溶液(2E)。

圖3、細(xì)胞流式儀檢測(cè)RGD-TRAIL及RGD-TRAIL-ELP濃度與COLO-205細(xì)胞凋亡數(shù)量關(guān)系：(3A)重組蛋白濃度與COLO-205細(xì)胞凋亡率關(guān)系圖；(3B)不同濃度下的重組蛋白誘導(dǎo)COLO-205細(xì)胞凋亡代表性結(jié)果。

圖4、重組蛋白在COLO-205腫瘤模型鼠中的各個(gè)組織中分布情況(4A)，定量分析給藥24小時(shí)后各個(gè)組織中熒光強(qiáng)度(4B與4C)。

圖5、RGD-TRAIL及RGD-TRAIL-ELP給藥后，小鼠腫瘤體積變化圖

五、具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 RGD-TRAIL-ELP質(zhì)粒的構(gòu)建

ELP[VH₄-5]基因序列為：5’-CCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTAGGTGTCCCAGGTCACGGCGTACCGGGCCACGGTGTTCCTGGTCACGGCGTGCCGGGCTGGC-3(其氨基酸序列為VPGVG-VPGHG-VPGVG-VPGHG-VPGHG)，由南京金斯瑞公司合成，ELP[VH₄-40](8個(gè)ELP[VH₄-5]序列重復(fù))由ELP[VH₄-5]通過(guò)RDL方法延長(zhǎng)；ELP[VH₄-40]通過(guò)BamHI及HindIII與帶有RGD-TRAIL基因片段pET-23a進(jìn)行連接。所有目的基因序列用測(cè)序進(jìn)行鑒定(T7及T7-ter)。經(jīng)測(cè)序鑒定，RGD-TRAIL-ELP基因已經(jīng)插入到pET-23a中的NdeI與HindIII中。

實(shí)施例2 RGD-TRAIL-ELP表達(dá)純化及鑒定

帶有RGD-TRAIL-ELP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)后，構(gòu)建工程菌，培養(yǎng)于4升TB培養(yǎng)基，當(dāng)OD值達(dá)到0.6值，加IPTG誘導(dǎo)，于30℃過(guò)夜誘導(dǎo)，收集菌體，用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)菌破碎液4度12000g離心5分鐘取上清；將上清在40度下加熱，40度下12000g離心取5分鐘，取沉淀部分；將沉淀部分用預(yù)冷的pbs緩沖液溶解，放在4度下15分鐘，4度12000g離心5分鐘取上清，如此4度離心取上清及40度下取沉淀循環(huán)三次。

用SDS-PAGE鑒定RGD-TRAIL-ELP在E.coli可溶性表達(dá)情況及分析每輪ITC純化后蛋白純度。用非還原性的PAGE膠(-DTT)鑒定RGD-TRAIL-ELP多聚體含量。

結(jié)果如附件圖1所示：RGD-TRAIL-ELP在E.coli以可溶的形式進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)ITC純化后，得率為10mg/L。純化后的RGD-TRAIL-ELP[V5-40]用變性還原的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。GD-TRAIL-ELP[V5-40]在變性還原條件下均為一條帶，分子量在37kDa左右，與理論分子量接近。非變性膠的結(jié)果表明RGD-TRAIL-ELP[V5-40]存在三條帶。其分子量分別為37,78,與120kDa。經(jīng)初步計(jì)算，RGD-TRAIL-ELP[V5-40]三聚體占總量的38％。

實(shí)施例3 融合蛋白凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的檢測(cè)

用人結(jié)腸癌細(xì)胞(Human COLO rectal carcinoma cells，COLO205 cells)檢測(cè)所純化出來(lái)的RGD-TRAIL-ELP活性。COLO205培養(yǎng)于含有10％牛血清RPMI 1640。細(xì)胞(10⁵)經(jīng)過(guò)一系列濃度梯度的RGD-TRAIL或RGD-TRAIL-ELP誘導(dǎo)處理，經(jīng)胰酶消化后從培養(yǎng)孔中吸出，PBS洗兩遍，300g離心力離心5分鐘，棄上清，然后用300μL結(jié)合緩沖液重懸，加入終濃度為2μg/mL的Annexin V-FITC室溫孵育，10分鐘后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式管子，每管加入1μg的碘化吡啶(PI)后，細(xì)胞在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。

結(jié)果如附件圖3所示，RGD-TRAIL與RGD-TRAIL-ELP半致量(EC50)分別為1與0.35nM(20.57與13.61ng/ml)，因而RGD-TRAIL-ELP誘導(dǎo)凋亡活性可提高3倍。

實(shí)施例4 融合蛋白體內(nèi)腫瘤靶向效應(yīng)的檢測(cè)

5～6周齡雌性裸鼠背部右上側(cè)皮下接種10⁶個(gè)COLO-205結(jié)腸癌細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到300～500mm³時(shí)，隨機(jī)分組，將用Cy5.5標(biāo)記好的蛋白尾靜脈注射小鼠5mg/kg(100μg)，每組三只。尾靜脈注射24小時(shí)后，處死小鼠，取出臟器及腫瘤組織，后用PBS清洗三次，置于黑色的板上，用小動(dòng)物成像儀成像。為檢測(cè)各個(gè)器官的熒光分布，用小動(dòng)物成像儀所內(nèi)置的分析軟件對(duì)小鼠的臟器及腫瘤組織進(jìn)行熒光半定量分析。

結(jié)果如附件圖4所示，RGD-TRAIL與ELP給藥組中，其腫瘤組織只檢測(cè)出微弱的熒光，但在腎臟與肝臟組織中存在較強(qiáng)熒光信號(hào)。而RGD-TRAIL-ELP給藥組中，有強(qiáng)熒光在腫瘤部位富集，而其熒光強(qiáng)度相當(dāng)于2.5倍RGD-TRAIL給藥組中的腫瘤組織，在其它組織中的熒光較弱。

實(shí)施例5 融合蛋白體內(nèi)腫瘤抑制效應(yīng)的檢測(cè)

5～6周齡雌性裸鼠皮下接種2.5×10⁶的COLO-205結(jié)腸癌細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到～100mm³時(shí)，隨機(jī)分組。RGD-TRAIL-ELP在給藥之前，加熱至37℃以形成納米粒。RGD-TRAIL或者RGD-TRAIL-ELP(500μg/mL)組分別給藥1.5及4.5nmol；在聯(lián)合給藥組中，ELP及RGD-TRAIL每種蛋白均注射4.5nmol。包括PBS組在內(nèi)，共有6組的治療組，每組5只，而給藥方式均為腹腔注射，每隔兩天給藥一次，共注射14天。腫瘤的大小用電子游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，腫瘤的體積計(jì)算參照下面的公式：V＝S2×L×0.5，其中V代表腫瘤體積，S代表腫瘤的短徑，L代表腫瘤的長(zhǎng)徑。

結(jié)果如附件圖5所示，在COLO-205腫瘤模型鼠中，30μg(1.4nmol)的RGD-TRAIL低劑量給藥后，同PBS相比，腫瘤生長(zhǎng)只受到輕微抑制，而等摩爾數(shù)的RGD-TRAIL-ELP(1.4nmol,55μg)卻能顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)，且比高劑量的RGD-TRAIL(90μg，4.2nmol)腫瘤抑制效果更明顯。用ELP與RGD-TRAIL進(jìn)行共注射，其產(chǎn)生的治療治療效果與單獨(dú)用RGD-TRAIL給藥差異不是很顯著。尤其是當(dāng)用RGD-TRAIL-ELP進(jìn)行高劑量(4.3nmol，165μg)給藥10天后，小鼠的腫瘤逐漸消退。

本發(fā)明實(shí)施例是將RGD-TRAIL與ELP進(jìn)行融合并且重組表達(dá)，其重組蛋白R(shí)GD-TRAIL-ELP在E.coli以可溶的形式進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)可逆相變純化后，得率為10mg/L。純化后的RGD-TRAIL-ELP用變性還原的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，圖1A結(jié)果顯示RGD-TRAIL-ELP在變性還原條件下均為一條帶，分子量在37kDa左右，與理論分子量接近。非變性膠的結(jié)果表明RGD-TRAIL-ELP存在三條帶。其分子量分別為37,78,與120kDa。經(jīng)初步計(jì)算，RGD-TRAIL-ELP三聚體占總量的38％(圖1B)，RGD-TRAIL三聚體含量?jī)H為12％。因而融合ELP之后，有助于TRAIL形成更多的三聚體。

RGD-TRAIL-ELP分別在37與10℃檢測(cè)其粒徑分布。在10℃時(shí)，RGD-TRAIL-ELP的平均粒徑只有8nm，當(dāng)溫度為37℃時(shí)，其粒徑升至190nm(圖2A)，冷凍蝕刻-透射電鏡觀(guān)察RGD-TRAIL在37℃下，只有8nm(圖2B)，與10℃時(shí)，RGD-TRAIL-ELP的平均粒徑接近；37℃下，RGD-TRAIL-ELP的粒徑約為200nm。

在活性測(cè)試中，RGD-TRAIL作為參照。RGD-TRAIL與RGD-TRAIL-ELP半致死量(EC50)分別為1與0.35nM(20.57與13.61ng/ml)，因此RGD-TRAIL-ELP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性提高近3倍，這與RGD-TRAIL-ELP形成更多的三聚體有關(guān)。

評(píng)價(jià)RGD-TRAIL與RGD-TRAIL-ELP腫瘤靶向性是用COLO-205作為腫瘤模型。尾靜脈注射重組蛋白24小時(shí)后，將小鼠處死后，取出腫瘤組織與其他一些重要臟器，PBS洗滌后，進(jìn)行熒光定量分析。RGD-TRAIL與ELP給藥組中，其腫瘤組織只檢測(cè)出微弱的熒光，但在腎臟與肝臟組織中存在較強(qiáng)熒光信號(hào)(圖4A)。而RGD-TRAIL-ELP給藥組中，有強(qiáng)熒光在腫瘤部位富集(圖4A)，其熒光強(qiáng)度相當(dāng)于2.5倍RGD-TRAIL給藥組中的腫瘤組織，RGD-TRAIL-ELP給藥組中的其它組織熒光較弱(圖4C)

在COLO-205腫瘤模型鼠中，30μg(1.4nmol)的RGD-TRAIL低劑量給藥后，同PBS相比，腫瘤生長(zhǎng)只受到輕微抑制，而等摩爾數(shù)的RGD-TRAIL-ELP(1.4nmol,55μg)卻能顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)，且比高劑量的RGD-TRAIL(90μg，4.2nmol)腫瘤抑制效果更明顯。用ELP與RGD-TRAIL進(jìn)行共注射，其產(chǎn)生的治療治療效果與單獨(dú)用RGD-TRAIL給藥差異不顯著。尤其是當(dāng)用RGD-TRAIL-ELP進(jìn)行高劑量(4.3nmol，165μg)給藥10天后，小鼠的腫瘤逐漸消退(圖5)。

綜上所述，本發(fā)明是將RGD-TRAIL與ELP融合并進(jìn)行重組表達(dá)，該重組蛋白在大腸桿菌中以可溶的形式表達(dá)，該重組蛋白通過(guò)離心方法進(jìn)行純化。純化后的重組蛋白三聚體含量高，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力強(qiáng)，并且在生理?xiàng)l件下可自組裝成納米微粒，在體內(nèi)產(chǎn)生較好的腫瘤抑制效果。本發(fā)明所述的可逆相變純化方法簡(jiǎn)單，快速，易于規(guī)模放大，成本低廉。本發(fā)明所述的自組裝方式依賴(lài)于生理?xiàng)l件，適用于體內(nèi)環(huán)境。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。