技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體內(nèi)利用CLDN6靶標(biāo)定向之抗體的癌癥治療。

背景技術(shù)：

癌癥在全世界范圍內(nèi)是一個重大的健康問題并且仍是最主要的死因之一。癌細(xì)胞在生物學(xué)上顯著不同于它們所來源的非惡性細(xì)胞。這些區(qū)別是由于癌癥發(fā)生期間所獲得的遺傳改變，還導(dǎo)致在癌癥細(xì)胞中形成定性或定量地改變的分子結(jié)構(gòu)。特別地，這種癌癥相關(guān)結(jié)構(gòu)是遺傳產(chǎn)物，其表達(dá)在惡性轉(zhuǎn)化期間被誘導(dǎo)或增強(qiáng)。

免疫系統(tǒng)能夠通過兩種不同的模式識別并破壞細(xì)胞：固有免疫和獲得性免疫。固有組分由巨噬細(xì)胞、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞組成。這些細(xì)胞識別涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子形式并且釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。固有應(yīng)答針對外源抗原缺乏記憶能力，其為獲得性免疫應(yīng)答中所存在的特征。后者這一免疫系統(tǒng)組分也以針對外源抗原的特異性為特征，該特異性由淋巴細(xì)胞上受體的存在所賦予。抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)也在獲得性應(yīng)答中起重要作用-它們吞食外源抗原并且以主要組織相容性復(fù)合體的形式將它們呈遞給淋巴細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞具有以II型MHC分子途徑識別的抗原的受體，之后其能夠使它們釋放細(xì)胞因子并進(jìn)一步活化CD8+淋巴細(xì)胞(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；CTL)或B細(xì)胞。CTL是細(xì)胞介導(dǎo)免疫的一部分，能夠通過凋亡或穿孔素(perforin)介導(dǎo)的細(xì)胞裂解來清除以I型MHC分子途徑呈遞的細(xì)胞。普遍認(rèn)為T-細(xì)胞介導(dǎo)免疫在抗腫瘤應(yīng)答中具有非常重要的作用。B細(xì)胞參與釋放免疫球蛋白并因此是體液免疫系統(tǒng)的一部分。

如果適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行靶向或增強(qiáng)，可在治療上利用免疫功能以控制甚至根除惡性病變。參與癌癥發(fā)生的遺傳和后天變化產(chǎn)生抗原，其以與微生物抗原類似的方式被免疫系統(tǒng)所識別。

在過去的十年間，抗體已被成功地引入臨床用于癌癥治療，并且已成為腫瘤學(xué)中最有希望的療法。與常規(guī)藥物相比，基于抗體的癌癥治療具有較高特異性和較低副作用的潛力。原因是抗體在正常和腫瘤細(xì)胞之間的精確區(qū)分，及其作用方式依賴毒性較小的免疫抗腫瘤機(jī)制(例如，補(bǔ)體激活和募集細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞)的事實。

密蛋白(claudin)是位于上皮與內(nèi)皮的緊密連接內(nèi)的整合膜蛋白。預(yù)測密蛋白具有四個跨膜區(qū)段以及兩個細(xì)胞外環(huán)，并且N末端和C末端位于胞質(zhì)中。跨膜蛋白質(zhì)的密蛋白(claudin，CLDN)家族在上皮與內(nèi)皮緊密連接的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且還可能在細(xì)胞骨架的維持中以及在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。

我們發(fā)現(xiàn)CLDN6在多種癌癥的組織中表達(dá)，而在正常非癌癥組織中的表達(dá)限于胎盤。這樣的癌癥包括卵巢癌癥(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺部癌癥(包括小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃部癌癥、乳癌、肝部癌癥、胰腺癌癥、皮膚癌癥(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸部癌癥(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌癥、膀胱癌癥(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎部癌癥(特別是腎細(xì)胞癌，包括透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌癥、小腸癌癥(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌癥、睪丸癌癥(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎睪丸癌癥)和子宮癌癥，及其轉(zhuǎn)移形式。

此外，我們能夠產(chǎn)生能夠與表達(dá)CLDN6之完整細(xì)胞表面上的CLDN6特異性結(jié)合的抗體。對于這些抗體，表達(dá)除了CLDN6之外的密蛋白(特別是CLDN3、CLDN4和CLDN9)的細(xì)胞或者不表達(dá)任何這些CLDN蛋白的細(xì)胞未觀察到結(jié)合。

這里，我們通過證明結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面上的CLDN6的抗體足以賦予顯著的腫瘤生長抑制擴(kuò)展了這些觀察結(jié)果。轉(zhuǎn)染了CLDN6的腫瘤細(xì)胞和非轉(zhuǎn)染的異種移植物的腫瘤生長體內(nèi)評估顯示由結(jié)合CLDN6的抗體介導(dǎo)的CLDN6轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤生長特異性抑制。另外，證明了結(jié)合CLDN6的抗體足以抑制體內(nèi)內(nèi)源性表達(dá)CLDN6之腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長。這建立了以下的原理性證明(proof-of-principle)：結(jié)合CLDN6的抗體有效地抑制腫瘤生長，并且提供了以下證據(jù)，對于旨在通過靶向CLDN6來抑制腫瘤生長的治療抗體，CLDN6是引人注意的靶標(biāo)。

另外，證明了在體內(nèi)結(jié)合CLDN6的抗體有效地抑制人CLDN6陽性生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系的腫瘤生長，這證明結(jié)合CLDN6的抗體可用作選擇性治療劑以靶向并誘導(dǎo)生殖細(xì)胞腫瘤(例如睪丸生殖細(xì)胞腫瘤)的殺傷。

因此，我們首次提供了直接證據(jù)：與腫瘤細(xì)胞表面上的CLDN6相結(jié)合的抗體在體內(nèi)引起腫瘤生長減少，并且提供證明：特異性結(jié)合CLDN6引起使得腫瘤生長減少的治療性干預(yù)。另外，我們提供證據(jù)：與腫瘤細(xì)胞表面上的CLDN6相結(jié)合的抗體在體內(nèi)導(dǎo)致存活延長和腫瘤患者的壽命增加。

因此，本發(fā)明涉及使用結(jié)合CLDN6的抗體治療和/或預(yù)防與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞相關(guān)的腫瘤疾病，特別是癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移。本申請證明抗體與腫瘤細(xì)胞表面上的CLDN6的結(jié)合足以抑制腫瘤的生長并足以延長存活并增加腫瘤患者的壽命。另外，抗體與CLDN6的結(jié)合有效地抑制CLDN6陽性生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)的生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個方面中，本發(fā)明涉及體內(nèi)抑制腫瘤生長的抗體，其中所述腫瘤的細(xì)胞表達(dá)密蛋白6(CLDN6)并且其中所述抗體能夠結(jié)合CLDN6。在一個實施方案中，所述抗體通過結(jié)合CLDN6抑制腫瘤的生長。在一個實施方案中，所述抗體對于CLDN6是特異性的。在一個實施方案中，所述抗體為單克隆、嵌合、人或人源化抗體，或者是抗體片段或合成抗體。所述腫瘤可選自卵巢癌癥(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺部癌癥(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃部癌癥、乳癌、肝部癌癥、胰腺癌癥、皮膚癌癥(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸部癌癥(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌癥、膀胱癌癥(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎部癌癥(特別是腎細(xì)胞癌，包括透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌癥、小腸癌癥(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌癥、睪丸癌癥(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎睪丸癌癥)和子宮癌癥，及其轉(zhuǎn)移形式。所述腫瘤可以是生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎癌)。所述生殖細(xì)胞腫瘤可以是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及選自下列的抗體：(i)由以如下登錄號保藏的克隆產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體：DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)、DSM ACC3058(GT512muMAB 27A)或DSM ACC3057(GT512muMAB 5F2D2)；(ii)(i)中抗體的嵌合化或人源化形式的抗體；(iii)具有(i)中抗體的特異性的抗體；以及(iv)包含(i)中抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點的抗體。所述(i)抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點可包含(i)中抗體的可變區(qū)。

根據(jù)上述方面中任何一者的抗體可以連接至少一個治療效應(yīng)子部分，例如，放射性標(biāo)記、細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性酶(cytotoxic enzyme)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生根據(jù)上述上述方面中任何一者的抗體的雜交瘤。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及以登錄號DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)，DSM ACC3058(GT512muMAB 27A)或DSMACC3057(GT512muMAB 5F2D2)保藏的雜交瘤。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含根據(jù)上述方面中任何一者的抗體。所述藥物組合物可為治療性或預(yù)防性腫瘤疫苗的形式。在一個實施方案中，所述藥物組合物用于治療和預(yù)防腫瘤疾病。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及治療患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發(fā)生風(fēng)險的患者的方法，其中所述腫瘤的細(xì)胞表達(dá)密蛋白6(CLDN6)并且其中所述方法包括施用能夠結(jié)合CLDN6的抗體。在一個實施方案中，所述抗體在施用至患者時通過結(jié)合CLDN6來抑制患者中腫瘤的生長。在一個實施方案中，所述抗體連接至少一個治療效應(yīng)子部分(例如，放射性標(biāo)記、細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性酶)。所述抗體可以是CLDN6特異性的。所述抗體可以是單克隆、嵌合、人或人源化抗體，或者是抗體片段或合成抗體。在一個實施方案中，所述方法包括施用根據(jù)上述方面中任何一者的藥物組合物。

在任何上述方面中，所述腫瘤疾病可選自：卵巢癌癥(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺部癌癥(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃部癌癥、乳癌、肝部癌癥、胰腺癌癥、皮膚癌癥(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸部癌癥(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌癥、膀胱癌癥(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎部癌癥(特別是腎細(xì)胞癌，包括透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌癥、小腸癌癥(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌癥、睪丸癌癥(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎睪丸癌癥)和子宮癌癥，及其轉(zhuǎn)移形式。

在任何上述方面中，所述腫瘤疾病可以是生殖細(xì)胞腫瘤疾病，例如以畸胎癌或胚胎癌為特征的疾病。所述生殖細(xì)胞腫瘤疾病可以是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤。

在任何上述方面中，所述CLDN6可包含由包含序列表SEQ ID NO：1之核酸序列或者所述核酸序列之變體的核酸所編碼的氨基酸序列，和/或可包含序列表SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體。

本文所述的抗體能夠結(jié)合CLDN6并且優(yōu)選能夠結(jié)合與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的CLDN6。優(yōu)選地，所述抗體基本不能與CLDN3相結(jié)合(尤其當(dāng)與表達(dá)CLDN3之細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)時)和/或基本不能與CLDN4相結(jié)合(尤其當(dāng)與表達(dá)CLDN4之細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)時)。優(yōu)選地，所述抗體基本不能與CLDN9相結(jié)合(尤其當(dāng)與表達(dá)CLDN9之細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)時)。最優(yōu)選地，所述抗體基本不能與CLDN6以外的其他CLDN蛋白相結(jié)合(尤其當(dāng)與表達(dá)所述CLDN蛋白質(zhì)之細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)時)，并且是CLDN6特異性的。優(yōu)選地，表達(dá)所述CLDN蛋白質(zhì)的所述細(xì)胞是完整細(xì)胞，特別是非透化的細(xì)胞，并且與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的所述CLDN蛋白具有天然的(即非變性的)構(gòu)象。優(yōu)選地，所述抗體能夠與一個或更多個天然構(gòu)象的CLDN6表位相結(jié)合。

在一些具體的優(yōu)選實施方案中，本文所述的抗體與存在于活細(xì)胞表面上的CLDN6天然表位(例如，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的表位)相結(jié)合。在另一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是表達(dá)CLDN6之腫瘤細(xì)胞特異性的，并且不與不表達(dá)CLDN6的癌細(xì)胞相結(jié)合。優(yōu)選地，本文所述的抗體與CLDN6特異性結(jié)合。

在一個實施方案中，本文所述的抗體能夠與位于CLDN6的細(xì)胞外部分中的表位相結(jié)合，其中CLDN6的所述細(xì)胞外部分優(yōu)選地包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO：5的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述抗體能夠與位于SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的表位相結(jié)合。

在一個實施方案中，所述抗體可通過包括以下步驟的方法來獲得：用具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之氨基酸序列的肽免疫接種動物，更優(yōu)選SEQ ID NO：5的氨基酸序列或免疫上等同的肽或者表達(dá)所述肽的核酸或宿主細(xì)胞。

在一些不同的實施方案中，所述抗體能夠結(jié)合的CLDN6具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。尤其優(yōu)選地是，所述抗體能夠與具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的CLDN6相結(jié)合，并且能夠與具有SEQ ID NO：6之氨基酸序列的CLDN6相結(jié)合。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本文所述的抗體具有以下活性中的一種或更多種：(i)殺傷表達(dá)CLDN6的細(xì)胞，(ii)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的增殖，(iii)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的集落形成，和(iv)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?？蓪?xì)胞、抑制細(xì)胞的增殖和/或抑制細(xì)胞的集落形成治療性地用于抑制腫瘤生長，其包括防止和/或預(yù)防腫瘤生長、延緩腫瘤生長和/或減少現(xiàn)有腫瘤的尺寸，從而可治療性地用于治療或預(yù)防癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性散布。

優(yōu)選地，文中描述的抗體通過誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)介導(dǎo)的裂解、抗體依賴性細(xì)胞毒作用(antibody dependent cellularcytotoxicity，ADCC)介導(dǎo)的裂解、凋亡、同質(zhì)性黏附(homotypic adhesion)和/或吞噬作用介導(dǎo)對細(xì)胞的殺傷，優(yōu)選通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解。

優(yōu)選地，ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解在效應(yīng)細(xì)胞存在時發(fā)生，所述效應(yīng)細(xì)胞在具體實施方案中選自單核細(xì)胞(monocyte)、單個核細(xì)胞(mononuclear cell)、NK細(xì)胞和PMN，吞噬作用是通過巨噬細(xì)胞來實現(xiàn)。

可通過在使用溴脫氧尿苷(5-溴-2-脫氧尿苷，BrdU)的測定中測定表達(dá)CLDN6之癌細(xì)胞的增殖來體外測量抑制或降低表達(dá)CLDN6之細(xì)胞(優(yōu)選癌細(xì)胞)增殖的活性。BrdU是合成的核苷，其是胸苷的類似物，并且可被并入復(fù)制中細(xì)胞(在細(xì)胞周期的S期中)的新合成DNA中，在DNA復(fù)制的過程中替代胸苷。使用例如BrdU特異性的抗體檢出所并入的化學(xué)物質(zhì)表明細(xì)胞正在活躍地復(fù)制其DNA。

在克隆生成測定(clonogenic assay)中，可體外測量抑制或降低表達(dá)CLDN6之細(xì)胞(優(yōu)選癌細(xì)胞)集落形成的活性?？寺∩蓽y定是用于研究特定藥劑對細(xì)胞存活和增殖之有效性的微生物學(xué)技術(shù)。其在癌癥研究的實驗室中經(jīng)常使用，用于測定藥物或輻射對增殖的腫瘤細(xì)胞的作用。該實驗涉及三個主要的步驟：(i)向細(xì)胞(特別是癌細(xì)胞)樣品施加處理，(ii)將細(xì)胞鋪板于組織培養(yǎng)容器中，以及(iii)使細(xì)胞生長。對所產(chǎn)生的集落進(jìn)行固定、染色、計數(shù)。如果個別腫瘤細(xì)胞定植(colonize)器官，對于轉(zhuǎn)移的形成來說，集落形成是重要的。抗體的抑制作用表明其抑制轉(zhuǎn)移形成的潛力。在克隆生成測定中，具有抑制或降低集落形成之活性的抗體尤其可用于治療或預(yù)防癌細(xì)胞(特別是本文中提及的癌類型)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本文所述的抗體表現(xiàn)出對抗帶有天然構(gòu)象CLDN6之細(xì)胞的一種或更多種免疫效應(yīng)子功能，其中所述一種或更多種免疫效應(yīng)子功能優(yōu)選地選自補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、誘導(dǎo)凋亡以及抑制增殖，優(yōu)選地所述效應(yīng)子功能是ADCC和/或CDC。

優(yōu)選地，本文所述的抗體表現(xiàn)出腫瘤生長抑制或者免疫效應(yīng)子功能是由所述抗體與CLDN6相結(jié)合(優(yōu)選與位于CLDN6的細(xì)胞外部分之內(nèi)的表位相結(jié)合)而誘導(dǎo)的，其中CLDN6的所述細(xì)胞外部分優(yōu)選地包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)CLDN6的細(xì)胞優(yōu)選地具有下述特征：CLDN6與其細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。表達(dá)CLDN6之細(xì)胞或者以CLDN6與其細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)或帶有天然構(gòu)象CLDN6為特征的細(xì)胞優(yōu)選地是腫瘤細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)，優(yōu)選來自本文所述的癌的癌細(xì)胞。

本文所述的抗體可以連接一個或更多個治療效應(yīng)子部分(例如，放射性標(biāo)記、細(xì)胞毒素、治療性酶(therapeutic enzyme)、誘導(dǎo)凋亡的藥劑等)以提供靶向的細(xì)胞毒性(即，殺傷腫瘤細(xì)胞)。

在一個實施方案中，本文所述的抗體(i)與表達(dá)CLDN6的細(xì)胞相結(jié)合，并且(ii)不與不表達(dá)CLDN6的細(xì)胞相結(jié)合。本文所述的抗體優(yōu)選(i)介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLDN6的細(xì)胞和/或抑制其增殖，并且(ii)不介導(dǎo)殺傷不表達(dá)CLDN6之細(xì)胞和/或不抑制其增殖。

在一個實施方案中，本文所述的抗體可以具有一個或更多個以下特性：

a)對CLDN6的特異性；

b)約100nM或更低的與CLDN6的結(jié)合親和力，優(yōu)選約5～10nM或更低，以及更優(yōu)選約1～3nM或更低，

c)清除表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞的能力；

d)防止或延緩表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞之增殖的能力；

e)延長具有表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞之對象存活的能力。

在一個實施方案中，本文所述的抗體降低腫瘤細(xì)胞生長和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，因此具有腫瘤抑制或腫瘤破壞作用。

本文所述的優(yōu)選的抗體是由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體，所述雜交瘤細(xì)胞保藏在DSMZ(Inhoffenstr.7B，38124 Braunschweig，Germany)，并且具有以下命名和登錄號之一：

1.GT512muMAB 36A，登錄號DSM ACC3059，保藏于2010年4月13日；

2.GT512muMAB 27A，登錄號DSM ACC3058，保藏于2010年4月13日；或

3.GT512muMAB 5F2D2，登錄號DSM ACC3057，保藏于2010年4月13日。

本文中通過參照抗體的命名和/或通過參照產(chǎn)生抗體的克隆來命名本發(fā)明的抗體，例如muMAB 36A。

另一些優(yōu)選的抗體具有由上述雜交瘤產(chǎn)生或可從其獲得的抗體之特異性的那些，并且特別地包含與由上述雜交瘤產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點(特別是可變區(qū))相同或高度同源的抗體。預(yù)期優(yōu)選的抗體包括具有與由上述雜交瘤產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體的CDR區(qū)相同或高度同源之區(qū)域的抗體?！案叨韧础敝荚诒硎究蛇M(jìn)行1至5個(優(yōu)選1至4個，例如1至3個或者1或2個)替換。尤其優(yōu)選的抗體是由上述雜交瘤產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體的嵌合化和人源化形式。

本發(fā)明還涉及細(xì)胞，例如產(chǎn)生本文所述的抗體的雜交瘤細(xì)胞。

優(yōu)選的雜交瘤細(xì)胞是保藏于DSMZ(Inhoffenstr.7B，38124 Braunschweig，Germany)的雜交瘤細(xì)胞，并且其具有以下命名和登錄號之一：

1.GT512muMAB 36A，登錄號DSM ACC3059，保藏于2010年4月13日；

2.GT512muMAB 27A，登錄號DSM ACC3058，保藏于2010年4月13日；或

3.GT512muMAB 5F2D2，登錄號DSM ACC3057，保藏于2010年4月13日。

本發(fā)明還涉及核酸，所述核酸包含編碼本文所述的抗體或其部分(例如，抗體鏈)的基因或核酸序列。所述核酸可包含于載體(vector)(例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或者例如常規(guī)地用于基因工程中的其他載體)中。所述載體可包含另外的基因，例如標(biāo)志物基因，其允許在合適的宿主細(xì)胞和在合適的條件下選擇所述載體。此外，所述載體可包含表達(dá)控制元件，其允許在合適的宿主中適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)編碼區(qū)。這樣的控制元件是技術(shù)人員已知的，并且可包括啟動子、剪接盒(splice cassette)和翻譯起始密碼子。

優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸與允許在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制元件可操作地連接。確保在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的控制元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

用于構(gòu)建核酸分子的方法，用于構(gòu)建包含核酸分子之載體的方法，用于將載體引入到合適的所選宿主細(xì)胞中的方法，或用于引起或?qū)崿F(xiàn)核酸分子表達(dá)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。

本發(fā)明的另一個方面涉及包含本文中所公開的核酸或載體的宿主細(xì)胞。

在一個方面中，本發(fā)明提供包含本文所述的抗體或抗體組合的組合物(例如，藥物和診斷組合物/試劑盒)。本發(fā)明的藥物組合物可包含可藥用載劑(carrier)，并且可任選地包含一種或更多種輔料、穩(wěn)定劑等。在一個具體的實施方案中，所述組合物包含抗體的組合，所述抗體與獨特的表位結(jié)合或者具有獨特的功能特征(例如，誘導(dǎo)CDC和/或ADCC)。

在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是治療性或預(yù)防性抗腫瘤疫苗。

在一個方面中，本發(fā)明提供治療和預(yù)防的方法，其治療患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發(fā)生風(fēng)險的患者。在一個方面中，本發(fā)明提供用于抑制腫瘤生長的方法。在一個方面中，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的方法。這些方面可包括向患者施用本文所述的抗體或組合物。

本發(fā)明還包括同時或順序施用兩種或更多種抗CLDN6抗體，其中優(yōu)選至少一種所述抗體是嵌合抗CLDN6抗體，并且至少一種其他抗體是人抗CLDN6抗體，所述抗體與相同或不同的CLDN6表位相結(jié)合。優(yōu)選地，首先施用本發(fā)明的嵌合CLDN6抗體，隨后施用人抗CLDN6抗體，其中優(yōu)選長時間(即，作為維持治療)施用所述人抗CLDN6抗體。

本文所述的抗體或組合物可用于抑制表達(dá)CLDN6之腫瘤細(xì)胞的生長和/或選擇性殺傷表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞并因此抑制腫瘤生長的多種方法，其通過使細(xì)胞與有效量的抗體或組合物接觸來進(jìn)行，從而抑制細(xì)胞的生長和/或殺傷細(xì)胞。在一個實施方案中，所述方法包括殺傷表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞，任選地在效應(yīng)細(xì)胞存在下，例如通過CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通過這些機(jī)制中的兩種或更多種的組合來進(jìn)行殺傷。

本文所述的抗體或組合物可用于通過向患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發(fā)生風(fēng)險的患者施用所述抗體或組合物而治療和/或預(yù)防涉及表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的腫瘤疾病。

本發(fā)明可涉及腫瘤疾病的預(yù)防性和/或治療性治療，即用于治療患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發(fā)生風(fēng)險的患者。在一個方面中，本發(fā)明提供用于抑制腫瘤生長的方法，其包括施用一種或更多種本文所述的抗體和組合物。

優(yōu)選地，以這樣的方式施用本文所述的抗體和組合物，以使所述治療活性物質(zhì)(特別是抗體)不被遞送或基本不被遞送至沒有腫瘤時也表達(dá)CLDN6的組織或器官(例如，胎盤組織或胎盤)。為此，可局部施用本文所述的藥劑和組合物。

在一個方面中，本發(fā)明提供本文所述的抗體用于本文所述的治療方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本文所述的藥物組合物用于本文所述的治療方法。

本文所述的治療可與外科切除術(shù)和/或輻射和/或傳統(tǒng)化學(xué)療法結(jié)合。

通過以下的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將十分清楚。

發(fā)明詳述

在整個本說明書和隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文中有另外要求，詞語“包含(comprise)”以及變化形式(例如，“comprises”和“comprising”)將被理解為意指包括所陳述的成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，但是在一些實施方式中，可排除這樣的其他成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，即主題由所陳包含的成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組組成。除非本文中另外指明或者與上下文明確地相矛盾，描述本發(fā)明的上下文中(特別地在權(quán)利要求書的上下文中)使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞要解釋為一個/種或更多個/種。本文中值的范圍的記載僅意在充當(dāng)分別表示落入該范圍的每個分別的值的簡略表示方法。除非本文中另外指明，每個單獨的值均如同其在本文中被單獨記載那樣而并入本說明書。除非本文中另外指明或者與上下文明確地相矛盾，可以以任何合適的順序進(jìn)行本本文所述的所有方法。除非另外要求，本文中提供的任何和全部實施例或示例性語言(例如，“例如”)的使用僅意在更好地舉例說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的范圍作出限制。本說明書中沒有語言應(yīng)當(dāng)被解釋為表明對實施本發(fā)明至關(guān)重要的任何不要求保護(hù)之元素。

密蛋白是蛋白質(zhì)家族，是緊密連接的最重要成分，其中所述緊密連接建立了控制上皮細(xì)胞之間胞間間隙中分子流的細(xì)胞旁屏障(paracellular barrier)。密蛋白是4次跨膜的跨膜蛋白質(zhì)，其N-末端和C-末端均位于胞質(zhì)中。第一細(xì)胞外環(huán)由平均53個氨基酸組成，而第二細(xì)胞外環(huán)由約24個氨基酸組成。CLDN6和CLDN9是CLDN家族中最相似的成員。

本文中使用的術(shù)語“CLDN”意為密蛋白，其包括CLDN6、CLDN9、CLDN4和CLDN3。優(yōu)選地，CLDN是人CLDN。

術(shù)語“CLDN6”優(yōu)選地表示人CLDN6，并且尤其表示下述蛋白質(zhì)，即所述蛋白質(zhì)包含(i)由包含序列表SEQ ID NO：1之核酸序列或所述核酸序列之變體的核酸所編碼的氨基酸序列，和/或(ii)序列表SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體。CLDN6的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：2中所示或SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的28至80位氨基酸，更優(yōu)選28至76位氨基酸，例如，SEQ IDNO：3中所示的氨基酸序列。CLDN6的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ IDNO：2中所示氨基酸序列或SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的138至160位氨基酸，優(yōu)選141至159位氨基酸，更優(yōu)選145至157位氨基酸，例如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。所述第一和/或第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN6的細(xì)胞外部分。

術(shù)語“CLDN9”優(yōu)選地表示人CLDN9，并且尤其表示下述蛋白質(zhì)，即所述蛋白質(zhì)包含序列表SEQ ID NO：7的氨基酸序列或所述氨基酸的變體。CLDN9的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的28至76位氨基酸。CLDN9的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的141至159位氨基酸。所述第一和/或第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN9的細(xì)胞外部分。

術(shù)語“CLDN4”優(yōu)選地表示人CLDN4，并且尤其表示下述蛋白質(zhì)，即所述蛋白質(zhì)包含序列表SEQ ID NO：8的氨基酸序列或所述氨基酸的變體。CLDN4的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的28至76位氨基酸。CLDN4的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的141至159位氨基酸。所述第一和/或第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN4的細(xì)胞外部分。

術(shù)語“CLDN3”優(yōu)選地表示人CLDN3，并且尤其表示下述蛋白質(zhì)，即所述蛋白質(zhì)包含序列表SEQ ID NO：9的氨基酸序列或所述氨基酸的變體。CLDN3的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的27至75位氨基酸。CLDN3的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的140至158位氨基酸。所述第一和/或第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN3的細(xì)胞外部分。

上文中描述的CLDN序列包括所述序列的任何變體，特別是突變體，剪接變體，構(gòu)象、同種型、等位基因變體，物種變體和物種同源物，特別是天然存在的變體。等位基因變體表示基因正常序列的改變，其意義通常是不清楚的。完整的基因測序通常鑒定出給定基因的很多等位基因變體。物種同源物是給定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。術(shù)語“CLDN”應(yīng)包括(i)CLDN剪接變體，(ii)CLDN翻譯后修飾變體，特別地包括具有不同糖基化(例如，N-糖基化狀態(tài))的變體，(iii)CLDN構(gòu)象變體，(iv)CLDN癌相關(guān)的和CLDN非癌相關(guān)的變體。優(yōu)選地，CLDN以其天然構(gòu)象存在。

術(shù)語“部分(portion)”是指級分(fraction)。對于具體結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列或蛋白質(zhì))，術(shù)語其“部分”可表示所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)或不連續(xù)級分。優(yōu)選地，氨基酸序列的部分包含所述氨基酸序列之氨基酸的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、優(yōu)選至少40％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、甚至更優(yōu)選至少80％以及最優(yōu)選至少90％。優(yōu)選地，如果所述部分是不連續(xù)級分，所述不連續(xù)級分是由結(jié)構(gòu)的2、3、4、5、6、7、8或更多個部件組成，每個部件是連續(xù)的結(jié)構(gòu)元件。例如，氨基酸序列的不連續(xù)級分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8或更多個(優(yōu)選不超過4個)部件組成，其中每個部件優(yōu)選地包含所述氨基酸序列的至少5個連續(xù)的氨基酸、至少10個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選至少20個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選至少30個連續(xù)的氨基酸。

術(shù)語“部件(part)”和“片段(fragment)”在本文中可互換使用，并且是指連續(xù)的元件。例如，結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列或蛋白質(zhì))的部分是指所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)元件。結(jié)構(gòu)的部分(portion)、部件(part)或片段(fragment)優(yōu)選地包含所述結(jié)構(gòu)的一個或更多個功能特征。例如，表位或肽的部分(portion)、部件(part)或片段(fragment)優(yōu)選地與從其來源的表位或肽是免疫學(xué)上等同的。

在本發(fā)明的情況下，術(shù)語“CLDN的細(xì)胞外部分”是指CLDN朝向細(xì)胞外空間的部件，并優(yōu)選地可從所述細(xì)胞的外側(cè)接近，例如被位于細(xì)胞外的抗體所接近。優(yōu)選地，該術(shù)語是指CLDN的一個或更多個細(xì)胞外環(huán)或其部件或者任何其他細(xì)胞外部件(所述其他細(xì)胞外部件優(yōu)選地是所述CLDN特異性的)。優(yōu)選地，所述部件包含至少5個、至少8個、至少10個、至少15個、至少20個、至少30個或至少50個或者更多個氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明，由細(xì)胞表達(dá)的CLDN優(yōu)選與所述細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。術(shù)語“與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的CLDN”意為CLDN與所述細(xì)胞的質(zhì)膜相關(guān)聯(lián)并位于所述質(zhì)膜，其中CLDN的至少一部分(優(yōu)選細(xì)胞外部分)朝向所述細(xì)胞的細(xì)胞外空間，并且可從所述細(xì)胞的外側(cè)接近，例如被位于細(xì)胞外的抗體所接近。所述關(guān)聯(lián)可以是直接或間接的。例如，所述關(guān)聯(lián)可以是通過一個或多個跨膜結(jié)構(gòu)域、一個或多個脂質(zhì)錨和/或通過與可見于細(xì)胞質(zhì)膜外層(outer leaflet)的任何其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖或其他結(jié)構(gòu)的相互作用。例如，與細(xì)胞表面關(guān)聯(lián)的CLDN可以是具有細(xì)胞外部分的跨膜蛋白質(zhì)(即，整合膜蛋白)或者可以是通過與其他蛋白質(zhì)(其為跨膜蛋白質(zhì))相互作用而與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。

如果CLDN6位于所述細(xì)胞的表面并且可被添加至細(xì)胞的CLDN6特異性抗體接近并結(jié)合，則CLDN6與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。要理解的是，在細(xì)胞表達(dá)CLDN6的情況下，與所述細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的CLDN6可僅是所表達(dá)的CLDN6的一部分。

術(shù)語“帶有CLDN的細(xì)胞”優(yōu)選地意為所述細(xì)胞在其表面上帶有CLDN，即CLDN與所述細(xì)胞的表面相關(guān)聯(lián)。

按照現(xiàn)有技術(shù)中通常的意義使用“細(xì)胞表面”或“細(xì)胞的表面”，并且因此包括可被蛋白質(zhì)和其他分子接近并結(jié)合的細(xì)胞的外側(cè)。

詞語“表達(dá)于細(xì)胞表面上的CLDN”意為細(xì)胞所表達(dá)的CLDN與所述細(xì)胞的表面相關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明，如果表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平低于胎盤細(xì)胞或胎盤組織中的表達(dá)和關(guān)聯(lián)，則CLDN6基本不表達(dá)于細(xì)胞中并且基本不與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，表達(dá)和關(guān)聯(lián)的水平低于胎盤細(xì)胞或胎盤組織中表達(dá)和關(guān)聯(lián)的10％，優(yōu)選低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或者甚至更低。優(yōu)選地，如果表達(dá)和關(guān)聯(lián)的水平超過除了胎盤組織之外的非腫瘤發(fā)生性、非癌性的組織中表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平的2倍(優(yōu)選1.5倍)并且優(yōu)選地不超過所述非腫瘤發(fā)生性、非癌性的組織中的表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平，則CLDN6基本不表達(dá)于細(xì)胞中并且基本不與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，如果表達(dá)或關(guān)聯(lián)水平低于檢出限和/或如果表達(dá)或關(guān)聯(lián)水平太低而使添加至細(xì)胞的CLDN6特異性抗體無法結(jié)合，則CLDN6基本不表達(dá)于細(xì)胞中并且基本不與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明，如果表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平超過除了胎盤組織之外的非腫瘤發(fā)生性、非癌性組織中表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平，優(yōu)選超過2倍，優(yōu)選10倍、100倍、1000倍或10000倍，則CLDN6表達(dá)于細(xì)胞中并且與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，如果表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平高于檢出限和/或如果表達(dá)和關(guān)聯(lián)水平足夠高以使添加至細(xì)胞的CLDN6特異性抗體結(jié)合，則CLDN6表達(dá)于細(xì)胞中并且與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，表達(dá)于細(xì)胞中的CLDN6表達(dá)或暴露于所述細(xì)胞的表面上。

術(shù)語“筏(raft)”是指位于細(xì)胞質(zhì)膜的外層區(qū)域中的富含鞘脂和膽固醇的膜微結(jié)構(gòu)域(microdomain)。某些蛋白質(zhì)與這樣的結(jié)構(gòu)域關(guān)聯(lián)的能力及其形成“聚集體”或“焦點聚集體(focal aggregate)”的能力可影響蛋白質(zhì)的功能。例如，被本發(fā)明的抗體結(jié)合之后，CLDN6分子轉(zhuǎn)位到這樣的結(jié)構(gòu)中，在質(zhì)膜中產(chǎn)生高密度的CLDN6抗原-抗體復(fù)合物。這樣的高密度的CLDN6抗原-抗體復(fù)合物可使CDC過程中的補(bǔ)體系統(tǒng)有效激活。

術(shù)語“抗體”是指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈的糖蛋白，并且包括任何包含其抗原結(jié)合部分的分子。術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體及其片段或衍生物，包括但不限于人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、單鏈抗體(例如，scFv′s)和抗原結(jié)合的抗體片段(例如，F(xiàn)ab和Fab′片段)，并且還包括抗體的所有重組形式，例如原核細(xì)胞中表達(dá)的抗體、非糖基化的抗體以及本文所述的任何抗原結(jié)合的抗體片段和衍生物。每個重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。每個輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)。VH和VL區(qū)還可再分為高變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region，CDR))，其間散布著較為保守的區(qū)域(稱為框架區(qū)(framework region，F(xiàn)R))。VH和VL各自由三個CDR和四個FR構(gòu)成，按照以下順序從氨基末端向羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q))的結(jié)合。

術(shù)語“人源化抗體”是指具有基本衍生自來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的分子，其中所述分子的其余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是基于人免疫球蛋白之結(jié)構(gòu)和/或序列的?？乖Y(jié)合位點可包含與恒定結(jié)構(gòu)域融合的完整可變結(jié)構(gòu)域或僅包含移植到可變結(jié)構(gòu)域中合適框架區(qū)上的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點可以是野生型或者可通過一個或更多個氨基酸替換而被修飾，例如被修飾成更接近于人免疫球蛋白。人源化抗體的一些形式保留所有CDR序列(例如，含有小鼠抗體全部6個CDR的人源化小鼠抗體)。另一些形式具有相對于初始抗體改變的一個或更多個CDR。

術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中每個重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與衍生自特定物種的抗體中的相應(yīng)序列同源，而所述鏈的其余區(qū)段與另一物種中相應(yīng)的序列同源。一般來說，輕鏈和重鏈的可變區(qū)都類似于衍生自一個哺乳動物物種之抗體的可變區(qū)，而恒定部分與衍生自另一物種的抗體序列同源。這種嵌合形式的一個明顯的優(yōu)勢是，可變區(qū)可便利地使用容易獲得的來自非人宿主生物的B細(xì)胞或雜交瘤與衍生自目前已知的來源，其與衍生自例如人細(xì)胞制備物的恒定區(qū)相組合。雖然可變區(qū)具有方便制備以及特異性不受來源影響的優(yōu)勢，但當(dāng)注射所述抗體時，人的恒定區(qū)比來自非人來源的恒定區(qū)引起更低可能性的人對象免疫應(yīng)答。然而，該定義不限于這個特定的實例。

術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或者簡單地“結(jié)合部分”)是指抗體的一個或更多個片段，其保留與抗原特異性的結(jié)合能力。已證明可通過全長抗體的片度來進(jìn)行抗體的抗原結(jié)合功能。包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域組成的一價片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通過鉸鏈區(qū)中二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，以及(vii)可任選地通過合成接頭(synthetic linker)連接的兩種或更多種分離的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域(VL和VH)是由分開的基因所編碼的，可使用重組方法通過合成接頭將它們連接，所述合成接頭使它們作為單個蛋白質(zhì)鏈而制造，其中VL和VH區(qū)配對以形成一價分子(被稱為單鏈Fv(singel chain Fv，scFv)；參見例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意在包括于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”之中。另一個實例是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，(ii)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可以是重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。US 2003/0118592和US 2003/0133939中也公開了結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，篩選所述片段，以與完整抗體相同的方式使用所述片段。

本文中使用的抗體用于被動抗腫瘤免疫治療，并且可以或不可以連接治療效應(yīng)子部分(例如，放射性標(biāo)記、化學(xué)療法(例如適于癌癥治療的順鉑、氨甲喋呤、阿霉素等)、細(xì)胞毒素、治療性酶、誘導(dǎo)凋亡的藥劑等)以提供靶向的細(xì)胞毒性(即，殺傷腫瘤細(xì)胞)。

優(yōu)選地，本文所述的抗體通過誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)介導(dǎo)的裂解、抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)介導(dǎo)的裂解、凋亡、同質(zhì)性黏附和/或吞噬作用(優(yōu)選通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解)介導(dǎo)對細(xì)胞的殺傷。本文所述的抗體優(yōu)選地與免疫系統(tǒng)的組分相互作用，優(yōu)選通過ADCC或CDC相互作用。然而，本發(fā)明的抗體還可簡單地通過與細(xì)胞表面上的腫瘤抗原相結(jié)合而發(fā)揮作用，因而例如阻斷細(xì)胞的增殖。

ADCC描述本文所述的效應(yīng)細(xì)胞(特別是淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞殺傷能力，其優(yōu)選地要求靶細(xì)胞被抗體所標(biāo)記。

優(yōu)選地，當(dāng)抗體與腫瘤細(xì)胞上的抗原結(jié)合并且抗體Fc結(jié)構(gòu)域占用免疫效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體(FcR)時，ADCC發(fā)生。已鑒定數(shù)個Fc受體家族，并且特定細(xì)胞群特征性地表達(dá)確定的Fc受體。ADCC可被視為直接誘導(dǎo)不同程度的即時腫瘤破壞的機(jī)制，其還導(dǎo)致抗原呈遞以及腫瘤指導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。優(yōu)選地，體內(nèi)誘導(dǎo)ADCC將導(dǎo)致針對腫瘤的T細(xì)胞應(yīng)答和宿主源性抗體應(yīng)答。

CDC是另一種抗體指導(dǎo)的細(xì)胞殺傷方法。IgM是補(bǔ)體激活的最有效同種型。通過經(jīng)典的補(bǔ)體激活途徑，IgG1和IgG3也均非常有效地指導(dǎo)CDC。優(yōu)選地，在該級聯(lián)中，抗原-抗體復(fù)合物的形成導(dǎo)致所參與的抗體分子(例如，IgG分子)的C_H2結(jié)構(gòu)域上暴露多個緊鄰的C1q結(jié)合位點(C1q是補(bǔ)體C1的三個亞組分之一)。優(yōu)選地，這些暴露的C1q結(jié)合位點將之前低親和力的C1q-IgG相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力的相互作用，這觸發(fā)與一系列其他補(bǔ)體蛋白相關(guān)的事件級聯(lián)，并導(dǎo)致蛋白水解釋放效應(yīng)細(xì)胞趨化/激活劑C3a和C5a。優(yōu)選地，補(bǔ)體級聯(lián)在膜攻擊復(fù)合物形成后結(jié)束，所述膜攻擊復(fù)合物在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔，其促進(jìn)水和溶質(zhì)自由進(jìn)出通過所述細(xì)胞，從而可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

術(shù)語“抗體”包括“雙特異性分子”即具有兩個不同的結(jié)合特異性的分子。例如，所述分子可以與以下結(jié)合或相互作用：(a)細(xì)胞表面抗原，和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體。術(shù)語“抗體”還包括“多特異性分子”或“異特異性分子(heterospecific molecule)”，即具有超過兩個不同的結(jié)合特異性的分子。例如，所述分子可以與以下結(jié)合或相互作用：(a)細(xì)胞表面抗原，(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體，和(c)至少一種其他成分。因此，本發(fā)明包括但不限于針對CLDN6以及針對其他靶標(biāo)(例如，效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體)的雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子。術(shù)語“抗體”還包括“雙特異性抗體”，其還包括雙抗體(diabody)。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于單個多肽鏈上，但使用的接頭太短從而無法使相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，因而迫使所述結(jié)構(gòu)域與其他鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見例如Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。

術(shù)語“抗體”還包括“異種抗體(heteroantibody)”，該術(shù)語是指兩個或更多個抗體、其衍生物或連接在一起的抗原結(jié)合區(qū)，其中至少兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合特異性，以及對靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)上的抗原或表位的結(jié)合特異性。

“靶細(xì)胞”應(yīng)當(dāng)意為對象(例如，人或動物)中可被本發(fā)明抗體所靶向的任何不合需要的細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述靶細(xì)胞是表達(dá)CLDN6的細(xì)胞。表達(dá)CLDN6的細(xì)胞通常包括腫瘤細(xì)胞。

本文中使用的術(shù)語“效應(yīng)細(xì)胞”是指參與免疫應(yīng)答之效應(yīng)期(而不是免疫應(yīng)答的識別和激活期)的免疫細(xì)胞。示例性的免疫細(xì)胞包括骨髓或淋巴來源的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞(包括細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytolytic T cell，CTL))、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。一些效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特定的Fc受體并且執(zhí)行特定的免疫功能。在一些優(yōu)選的實施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)，例如嗜中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC。例如，表達(dá)FcR的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞參與對靶細(xì)胞的特異性殺傷并且將抗原呈遞至免疫系統(tǒng)的其他組分，或者與呈遞抗原的細(xì)胞結(jié)合。在另一些實施方案中，效應(yīng)細(xì)胞可吞噬靶抗原、靶細(xì)胞或微生物?？赏ㄟ^體液因子(例如細(xì)胞因子)調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上特定FcR的表達(dá)。例如，已發(fā)現(xiàn)干擾素γ(IFN-γ)上調(diào)Fc-γRI的表達(dá)。這種增強(qiáng)的表達(dá)提高荷有Fc-γRI之細(xì)胞對靶標(biāo)的細(xì)胞毒活性。效應(yīng)細(xì)胞可吞噬靶抗原或靶細(xì)胞或使其溶解。

本文所述的抗體可以是人抗體。本文中使用的術(shù)語“人抗體”意在包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列之可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不被人種系免疫球蛋白序列(例如，通過體外隨機(jī)或位點特異性誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變而引入的突變)所編碼的氨基酸殘基。

本文所述的抗體可以是單克隆抗體。本文中使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指單一分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。在一個實施方案中，單克隆抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的，所述雜交瘤包含與永生化細(xì)胞融合的獲自非人動物(例如，小鼠)的B細(xì)胞。

本文所述的抗體可以是重組抗體。本文中使用的術(shù)語“重組抗體”包括由重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有抗體，例如(a)從以免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如，小鼠)中或者從其制備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從轉(zhuǎn)化以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞中(例如，從轉(zhuǎn)染瘤中)分離的抗體，(c)從重組的、組合的抗體文庫中分離的抗體，和(d)由涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。

本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達(dá)抗體的重組真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌(包括酵母)細(xì)胞。

本文中使用的“異源抗體”是相對于產(chǎn)生所述抗體的轉(zhuǎn)基因生物而定義的。該術(shù)語是指具有下述氨基酸序列或與其對應(yīng)的編碼核酸序列的抗體，即所述氨基酸序列或與其對應(yīng)的編碼核酸序列存在于并非所述轉(zhuǎn)基因生物的生物體中，并且通常所述抗體衍生自不同于所述轉(zhuǎn)基因生物的物種。

本文中使用的“異雜合抗體(heterohybrid antibody)”是指具有不同生物來源之輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠輕鏈相關(guān)聯(lián)之人重鏈的抗體是異源雜合抗體。

本發(fā)明包括本文所述的所有抗體和衍生物，其對于本發(fā)明的目的而言均包括于術(shù)語“抗體”中。術(shù)語“抗體衍生物”是指抗體的任何修飾形式，例如，抗體與其他試劑或者抗體或抗體片段的綴合物。

本文所述的抗體優(yōu)選地是分離的。本文中使用的“分離的抗體”意指這樣的抗體，其基本沒有具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，與CLDN6特異性結(jié)合的分離抗體是這樣的抗體，其基本沒有與CLDN6以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。然而，與人CLDN6的表位、同種型或變體特異性結(jié)合的分離的抗體可以具有與其他相關(guān)抗原(例如，來自其他物種)(例如，CLDN6的物種同源物)的交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可基本沒有其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。在本發(fā)明的一個實施方案中，“分離的”單克隆抗體的組合表示具有不同特異性并且組合于明確界定的組合物中的抗體。

根據(jù)本發(fā)明，如果在標(biāo)準(zhǔn)測定中抗體與預(yù)先確定的靶標(biāo)有顯著的親和力并且與所述預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合，則所述抗體能夠與所述預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合。經(jīng)常通過平衡解離常數(shù)(K_D)衡量“親和力”或“結(jié)合親和力”。優(yōu)選地，術(shù)語“顯著的親和力”是指以10^-5M或更低、10^-6M或更低、10^-7M或更低、10^-8M或更低、10^-9M或更低、10^-10M或更低、10^-11M或更低或者10^-12M或更低的解離常數(shù)(K_D)與預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合。

如果在標(biāo)準(zhǔn)的測定中抗體不具有對靶標(biāo)的顯著親和力并且不與所述靶標(biāo)顯著地結(jié)合，則所述抗體(基本)不能與所述靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，如果在流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS分析)中(其中測定所述抗體與表達(dá)于完整細(xì)胞表面上的所述靶標(biāo)的結(jié)合)抗體不與靶標(biāo)可檢測地結(jié)合，則所述抗體(基本)不能與所述靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，如果以高達(dá)2μg/ml、優(yōu)選高達(dá)10μg/ml、更優(yōu)選高達(dá)20μg/ml、特別是高達(dá)50μg/ml或高達(dá)100μg/ml或者更高的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標(biāo)可檢測地結(jié)合。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標(biāo)以比與預(yù)先確定之靶標(biāo)(所述抗體所能夠與其結(jié)合)結(jié)合之K_D高至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍高的K_D結(jié)合，則抗體不具有對靶標(biāo)的顯著親和力。例如，如果抗體與所述抗體所能夠結(jié)合的所述靶標(biāo)相結(jié)合的K_D是10^-7M，則抗體不具有顯著親和力的與靶標(biāo)結(jié)合的K_D可以是至少10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選地能夠與預(yù)先確定的靶標(biāo)(特別是CLDN6)特異性結(jié)合。

如果抗體能夠與預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合而不能與其他靶標(biāo)結(jié)合(即，在標(biāo)準(zhǔn)測定中對其他靶標(biāo)沒有顯著的親和力并且不與其他靶標(biāo)顯著地結(jié)合)，則所述抗體對所述預(yù)先確定的靶標(biāo)是特異性的。根據(jù)本發(fā)明，如果抗體能夠與CLDN6結(jié)合但(基本)不能與其他靶標(biāo)(特別是除CLDN6之外的密蛋白，例如CLDN9、CLDN4、CLDN3和CLDN1)結(jié)合，則所述抗體是CLDN6特異性的。優(yōu)選地，如果與CLDN6之外的密蛋白(例如，CLDN9、CLDN4、CLDN3和CLDN1)的親和力和結(jié)合沒有顯著超過與密蛋白不相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)或非密蛋白的膜蛋白質(zhì)(例如，MHC分子或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)或任何其他指定的多肽)的親和力或結(jié)合，則所述抗體是CLDN6特異性的。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標(biāo)以比與預(yù)先確定之靶標(biāo)(所述抗體對其不是特異性的)結(jié)合之K_D低至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍的K_D結(jié)合，則所述抗體對預(yù)先確定的靶標(biāo)是特異性的。例如，如果抗體與對其特異性靶標(biāo)之結(jié)合的K_D是10^-7M，則與對其非特異性靶標(biāo)之結(jié)合的K_D可以是至少10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

可使用任何合適的方法實驗性測定抗體與靶標(biāo)的結(jié)合；參見例如Berzofsky等，″Antibody-Antigen Interactions″In Fundamental Immunology，Paul，W.E.，編，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company New York，N Y(1992)和本文所述的方法?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)很容易地測定親和力，例如，通過平衡透析；通過使用BIAcore 2000儀器，使用制造商所描述的一般方法；通過使用放射標(biāo)記的靶抗原的放射免疫測定；或通過技術(shù)人員已知的其他方法。例如，可通過Scatchard等，Ann N.Y.Acad.ScL，51：660(1949)的方法分析親和力數(shù)據(jù)。如果在不同條件(例如，鹽濃度、pH)下測量，所測量的具體抗體-抗原相互作用的親和力可以不同。因此，親和力的測量和其他抗原-結(jié)合參數(shù)(例如，K_D、IC₅₀)優(yōu)選地用抗體與抗原的標(biāo)準(zhǔn)化的溶液以及標(biāo)準(zhǔn)化的緩沖液制成。

本文中使用的“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因所編碼的抗體類型(例如，IgM或IgG1)。根據(jù)本發(fā)明的抗體包括多克隆和單克隆抗體，并且包括IgG2a(例如，IgG2a、κ、λ)、IgG2b(例如，IgG2b、κ、λ)、IgG3(例如，IgG3、κ、λ)和IgM抗體。然而，本發(fā)明還包括其他抗體同種型，包括IgG1、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗體。

本文中使用的“同種型轉(zhuǎn)換”是指抗體的類型或同種型從一種Ig類型變?yōu)榱硪环NIg類型的現(xiàn)象。

本文中使用的應(yīng)用于對象的術(shù)語“天然的(naturally occurring)”是指對象可在自然中找到的事實。例如，存在于可以從天然來源中分離的生物(包括病毒)中并且已在實驗室中被人刻意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。

本文中使用的術(shù)語“重排的”是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中在實質(zhì)上編碼完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中，V區(qū)段的位置分別緊鄰D-J或J區(qū)段?？赏ㄟ^比較種系DNA來鑒定重排的免疫球蛋白(抗體)基因座；重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。

本文中關(guān)于V區(qū)段而使用的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)型”是指這樣的構(gòu)型，其中V區(qū)段未重組，以使其緊鄰D或J區(qū)段。

根據(jù)本發(fā)明，抗體可來源于不同的物種，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人?？贵w還包括嵌合分子，其中源自一個物種(優(yōu)選人)的抗體恒定區(qū)與源自另一個物種的抗原結(jié)合位點組合。此外，抗體包括人源化分子，其中源自非人物種之抗體的抗原結(jié)合位點與人來源的恒定和框架區(qū)相組合。

可通過多種技術(shù)產(chǎn)生抗體，所述技術(shù)包括常規(guī)的單克隆抗體法，例如Kohler and Milstein，Nature 256：495(1975)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管優(yōu)選體細(xì)胞雜交法，原則上可采用用于產(chǎn)生單克隆抗體的其他技術(shù)，例如病毒或癌基因轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或使用抗體基因文庫的噬菌體展示技術(shù)。

用于制備分泌單克隆抗體之雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤生產(chǎn)是非常完善的方法。分離用于融合的經(jīng)免疫脾細(xì)胞的免疫方案和技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。融合伴侶(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是已知的。

用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的其他優(yōu)選動物系統(tǒng)是大鼠和兔系統(tǒng)(例如描述于Spieker-Polet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)，還參見Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，可使用帶有部分人免疫系統(tǒng)(而非小鼠系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來生成抗CLDN6的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因的和轉(zhuǎn)染色體的小鼠包括分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且其在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因小鼠”?？砂凑誛O2004 035607中對CD20的詳細(xì)描述那樣在這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體。

用于生成單克隆抗體的另一個策略是從所定義策略的產(chǎn)生抗體之淋巴細(xì)胞中直接分離編碼抗體的基因，例如參見Babcock等，1996；A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy。對于重組抗體工程的細(xì)節(jié)還參見Welschof and Kraus，Recombinant antibodes for cancertherapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.Lo Antibody EngineeringISBN 1-58829-092-1。

為產(chǎn)生CLDN6的抗體，如所描述的那樣可用載劑綴合的衍生自CLDN6序列的肽，重組表達(dá)的CLDN6抗原或其片段的富集制備物和/或表達(dá)CLDN6或其片段的細(xì)胞免疫接種小鼠?；蛘?，可用DNA編碼的全長人CLDN6或其片段免疫接種小鼠。在使用純化的或富集的CLDN6抗原制備物免疫接種而不產(chǎn)生抗體的情況中，還可用表達(dá)CLDN6的細(xì)胞(例如，細(xì)胞系)免疫接種小鼠以促進(jìn)免疫應(yīng)答。

可在免疫方案的過程中監(jiān)測免疫應(yīng)答，其中通過尾靜脈或眶后取血來獲得血漿和血清樣品。具有足夠效價的抗CLDN6免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在處死和取出脾之前3～5天，可用表達(dá)CLDN6的細(xì)胞腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)對小鼠進(jìn)行加強(qiáng)以提高分泌特定抗體之雜交瘤的比例。

為生成產(chǎn)生抗CLDN6單克隆抗體的雜交瘤，可從獲自經(jīng)免疫小鼠的淋巴結(jié)、脾或骨髓分離細(xì)胞，并使其與合適的永生化細(xì)胞系(例如，小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)融合。隨后可從所產(chǎn)生的雜交瘤中篩選抗原特異性抗體的產(chǎn)生。隨后可通過ELISA從各個孔篩選分泌抗體的雜交瘤。使用表達(dá)CLDN6的細(xì)胞，通過免疫熒光和FACS分析來鑒定對CLDN6具有特異性的抗體。可再次接種分泌抗體的雜交瘤，再次篩選，并且如果其仍然是抗CLDN6單克隆抗體陽性，則可通過有限稀釋進(jìn)行亞克隆?？呻S后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中生成用于表征的抗體。

還可使用例如現(xiàn)有技術(shù)中公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。

例如，在一個實施方案中，可將目的基因(例如，抗體基因)連接到表達(dá)載體(例如，真核表達(dá)質(zhì)粒(例如，WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)或現(xiàn)有技術(shù)中公知的其他表達(dá)系統(tǒng)所使用的真核表達(dá)質(zhì)粒))中?？蓪⒕哂兴寺〉目贵w基因的純化質(zhì)粒引入真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞或HEK293細(xì)胞或者其他真核細(xì)胞，例如植物來源的細(xì)胞、真菌或酵母細(xì)胞。用于引入這些基因的方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中所描述的方法，例如電穿孔、lipofectine、lipofectamine等。將這些抗體基因引入宿主細(xì)胞之后，可鑒定和選擇表達(dá)所述抗體的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表轉(zhuǎn)染瘤，隨后可放大其表達(dá)水平并提高規(guī)模以產(chǎn)生抗體?？蓮倪@些培養(yǎng)上清液和/或細(xì)胞中分離和純化重組抗體。

或者，可在其他表達(dá)系統(tǒng)(包括原核細(xì)胞(例如微生物(例如大腸桿菌(E.coli)))中表達(dá)所克隆的抗體基因。此外，可在轉(zhuǎn)基因的非人動物中產(chǎn)生抗體，例如在來自綿羊和兔的奶中，或在來自母雞的卵中，或在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生；參見例如Verma，R.，等(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，等(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；和Fischer，R.，等(1999)Biol.Chem.380：825-839。

當(dāng)用毒素或放射性同位素標(biāo)記后，鼠單克隆抗體可在人中被用作治療性抗體。非標(biāo)記的鼠抗體在人中是高度免疫原性的，當(dāng)重復(fù)應(yīng)用后導(dǎo)致治療作用的降低。主要的免疫原性是由重鏈恒定區(qū)介導(dǎo)的。如果使各個抗體嵌合化或人源化，可降低或完全避免鼠抗體在人中的免疫原性。嵌合抗體是其中的不同部分來自不同動物物種的抗體，例如具有來自鼠抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體?？贵w的嵌合化是通過將鼠抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)與人重鏈和輕鏈恒定區(qū)相連接而實現(xiàn)的(例如，Kraus等在Methods in Molecular Biology series，Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8中所描述的那樣)。在一個優(yōu)選的實施方案中，嵌合抗體是通過將人κ-輕鏈恒定區(qū)與鼠輕鏈可變區(qū)相連接而生成的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，可通過將人λ-輕鏈恒定區(qū)與鼠輕鏈可變區(qū)相連接而生成嵌合抗體。優(yōu)選的用于生成嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)是IgG1、IgG3和IgG4。其他優(yōu)選的用于生成嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)是IgG2、IgA、IgD和IgM。

抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與目標(biāo)抗原相互作用。為此，在各個抗體之間，CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更多樣化。因為CDR序列負(fù)責(zé)多數(shù)抗體-抗原相互作用，通過構(gòu)建包含從具有不同特性的不同抗體移植到框架序列上的來自特定天然抗體CDR序列的表達(dá)載體，可表達(dá)模擬特定天然抗體之特性的重組抗體(參見例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。這樣的框架序列可獲自包含種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫。這些種系序列會不同于成熟的抗體基因序列，因為它們不會包含完整組裝的可變區(qū)基因，完整組裝的可變區(qū)基因是通過B細(xì)胞成熟過程中的V(D)J連接而形成的。在可變區(qū)中均勻的各個位置上，種系基因序列還會不同于高親和力的二級全套抗體的序列。例如，體細(xì)胞突變在框架區(qū)1的氨基末端部分和在框架區(qū)4的羧基末端部分中相對罕見。此外，很多體細(xì)胞突變不明顯地改變抗體的結(jié)合特性。為此，并不必需獲得具體抗體的整個DNA序列以重新產(chǎn)生具有與原抗體相似結(jié)合特性的完整重組抗體(見WO 99/45962)?？缭紺DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于該目的通常是足夠的。所述部分序列被用于測定哪個種系可變區(qū)段和連接基因區(qū)段貢獻(xiàn)于重組的抗體可變基因。隨后將種系序列用于填充可變區(qū)的缺失部分。在蛋白質(zhì)成熟的過程中切除重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列，其并不貢獻(xiàn)于最終抗體的特性。為了添加丟失的序列，可通過連接或PCR擴(kuò)增來將被克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸組合?；蛘撸勺鳛橐唤M短的、重疊的、寡核苷酸來合成整個可變區(qū)，并通過PCR擴(kuò)增來組合以產(chǎn)生整個合成的可變區(qū)克隆。該過程具有某些優(yōu)勢，例如清除或包含特定的限制位點，或者優(yōu)化特定的密碼子。

使用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列來設(shè)計重疊的合成寡核苷酸組以產(chǎn)生具有與天然序列相同氨基酸編碼能力的合成V序列。合成的重鏈和κ鏈序列可以如下三種方式不同于天然序列：重復(fù)的核苷酸堿基串被中斷以促進(jìn)寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增；根據(jù)Kozak規(guī)則(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)并入最佳的翻譯起始位點；以及在翻譯起始位點的上游設(shè)計HindIII位點。

對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，優(yōu)化的編碼和對應(yīng)的非編碼鏈序列大約在對應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中點處被分解成30～50個核苷酸。因此，對于每條鏈，所述寡核苷酸可被組裝成為跨越150～400個核苷酸區(qū)段的重疊雙鏈組。隨后將匯集池(pool)用作模板以產(chǎn)生150～400個核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。一般來說，單個可變區(qū)核苷酸組將被分解成兩個匯集池，其被分別擴(kuò)增以生成兩個重疊的PCR產(chǎn)物。隨后通過PCR擴(kuò)增將這些重疊的產(chǎn)物組合以形成完整的可變區(qū)。還可在PCR擴(kuò)增中理想地包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段以生成很容易被克隆到表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。

隨后將所重建的嵌合化的或人源化的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、前導(dǎo)、翻譯起始、恒定區(qū)、3’非翻譯、聚腺嘌呤和轉(zhuǎn)錄終止序列組合以形成表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體可組合到單個載體中，共轉(zhuǎn)染、依次轉(zhuǎn)染或分別轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，隨后使所述宿主細(xì)胞融合形成表達(dá)這兩個鏈的宿主細(xì)胞。描述了用于構(gòu)建人IgGκ表達(dá)載體的質(zhì)粒。可這樣構(gòu)建所述質(zhì)粒，以使PCR擴(kuò)增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可被用于重新構(gòu)建完整的重鏈和輕鏈小基因(minigene)。這些質(zhì)?？杀挥糜谕暾乇磉_(dá)人或嵌合IgG1，κ或IgG4，κ抗體?？蓸?gòu)建類似的質(zhì)粒用于表達(dá)其他重鏈同種型，或用于表達(dá)包含λ輕鏈的抗體。

因此，在本發(fā)明的另一方面中，使用本文所述的抗CLDN6抗體的結(jié)構(gòu)特征以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的人源化抗CLDN6抗體，其保持至少一種本發(fā)明抗體的功能特性(例如，與CLDN6結(jié)合)。更具體地說，小鼠單克隆抗體的一個或更多個CDR區(qū)可與已知的人框架區(qū)和CDR重組地組合以產(chǎn)生其他重組改造的人源化抗CLDN6抗體。

使用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測定，例如實施例中列出的測定(例如，ELISA、Western印跡、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析)，可測定抗體與CLDN6結(jié)合的能力。

術(shù)語“表位”是指分子中的抗原決定簇，即是指分子中被免疫系統(tǒng)識別(例如被抗體識別)的部件。例如，表位是被免疫系統(tǒng)識別的抗原上離散的三維部位。在本發(fā)明的情況下，所述表位優(yōu)選地衍生自CLDN蛋白。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)(例如，氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并且經(jīng)常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑存在下，喪失與前者而不喪失與后者的結(jié)合。蛋白質(zhì)(例如，CLDN)的表位優(yōu)選地包含所述蛋白質(zhì)的連續(xù)或不連續(xù)部分，并且長度優(yōu)選地是5至100個、優(yōu)選5至50個、更優(yōu)選8至30個、最優(yōu)選10至25個氨基酸，例如，所述表位的長度可優(yōu)選地是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸。

本文中使用的術(shù)語“不連續(xù)表位”意為蛋白質(zhì)抗原上的構(gòu)象表位，其是由蛋白質(zhì)的一級序列中的至少兩個分開的區(qū)域形成的。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“結(jié)合”優(yōu)選涉及特異性結(jié)合?！疤禺愋越Y(jié)合”意指物質(zhì)(如抗體)與其特異性靶標(biāo)(如表位)的結(jié)合強(qiáng)于與其他靶標(biāo)的結(jié)合。如果物質(zhì)與第一種靶標(biāo)結(jié)合的解離常數(shù)(K_D)低于與第二種靶標(biāo)的解離常數(shù)，則其與第一種靶標(biāo)的結(jié)合強(qiáng)于與第二種靶標(biāo)的結(jié)合。優(yōu)選地，物質(zhì)特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)(K_D)比該物質(zhì)非特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)(K_D)低超過10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍或10¹⁰倍。

本文中使用的術(shù)語“核酸”意在包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)分子。根據(jù)本發(fā)明，核酸包括基因組DNA、cDNA、mRNA、重組產(chǎn)生和化學(xué)合成的分子。根據(jù)本發(fā)明，核酸可以是單鏈或雙鏈的線性或共價環(huán)狀閉合分子。

根據(jù)本發(fā)明描述的核酸優(yōu)選地已被分離。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“分離的核酸”意為所述核酸是(i)體外擴(kuò)增的，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，(ii)通過克隆重組產(chǎn)生的，(iii)純化的，例如通過切割和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如通過化學(xué)合成。分離的核酸是可用于重組DNA技術(shù)之操作的核酸。

根據(jù)本發(fā)明，核酸可單獨存在或與其他核酸聯(lián)合存在，所述其他核酸可以是同源的或異源的。在一些優(yōu)選的實施方案中，核酸與表達(dá)控制序列功能性連接，所述表達(dá)控制序列與所述核酸可以是同源或異源的，其中術(shù)語“同源的”意為所述核酸還天然地與表達(dá)控制序列功能性連接，而術(shù)語“異源的”意為所述核酸天然地不與表達(dá)控制序列功能性連接。

如果它們是彼此以這樣的方式共價連接以使所述核酸的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄在所述表達(dá)控制序列的控制或影響之下，則核酸(例如，表達(dá)RNA和/或蛋白質(zhì)或肽的核酸)與表達(dá)控制序列彼此功能性連接。如果要將所述核酸翻譯成為功能性蛋白質(zhì)，那么用表達(dá)控制序列與編碼序列功能性連接，誘導(dǎo)所述表達(dá)控制序列導(dǎo)致所述核酸的轉(zhuǎn)錄，而不引起編碼序列中的移碼或者所述編碼序列不能被翻譯成為所需的蛋白質(zhì)或肽。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“表達(dá)控制序列”或“表達(dá)控制元件”包含啟動子、核糖體結(jié)合位點、增強(qiáng)子和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯的其他控制元件。在本發(fā)明的一些具體的實施方案中，可調(diào)節(jié)所述表達(dá)控制序列。表達(dá)控制序列的精確結(jié)構(gòu)可根據(jù)物種或細(xì)胞類型而不同，但通常包含5′-非轉(zhuǎn)錄的以及5′-和3′-非翻譯序列，其分別參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。更具體地說，5′-非轉(zhuǎn)錄的表達(dá)控制序列包含啟動子區(qū)，其包含用于功能性連接的核酸之轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列。表達(dá)控制序列還可包括增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“啟動子”或“啟動子區(qū)”表示這樣的核酸序列，其位于被表達(dá)核酸序列的上游(5′)，并且通過提供對RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點而控制序列的表達(dá)?！皢幼訁^(qū)”還可包含識別和結(jié)合參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之其他因子的位點。啟動子可控制原核或真核基因的轉(zhuǎn)錄。此外，啟動子可以是“可誘導(dǎo)型的”并且可以響應(yīng)于誘導(dǎo)劑而起始轉(zhuǎn)錄，或者如果轉(zhuǎn)錄不受誘導(dǎo)劑控制，所述啟動子可以是“組成型的”。如果不存在誘導(dǎo)劑，在可誘導(dǎo)型啟動子控制之下的基因不表達(dá)或僅少量表達(dá)。在誘導(dǎo)劑存在下，所述基因被打開或轉(zhuǎn)錄水平提高。這一般是通過特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合所介導(dǎo)的。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的啟動子包括SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工的雜合啟動子(例如，CMV)，其中一個部件或一些部件與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如，人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氨酶))的基因啟動子的一個部件或一些部件融合，并且包含或不包含額外的內(nèi)含子。

根據(jù)本發(fā)明，以最通常的意義使用術(shù)語“表達(dá)”，其包括產(chǎn)生RNA或產(chǎn)生RNA和蛋白質(zhì)/肽。它還包括核酸的部分表達(dá)。此外，可以瞬時地或穩(wěn)定地進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語表達(dá)還包括“異常表達(dá)”或“不正常表達(dá)”。

根據(jù)本發(fā)明，“異常表達(dá)”或“不正常表達(dá)”意為與參比相比(優(yōu)選與非腫瘤發(fā)生性的正常細(xì)胞或健康的個體中的狀態(tài)相比)表達(dá)改變(優(yōu)選提高)。表達(dá)的提高是指提高至少10％，特別是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一個實施方案中，表達(dá)僅見于患病的組織，而健康組織中的表達(dá)被抑制。

在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明，核酸分子，在適當(dāng)情況下與控制核酸表達(dá)的啟動子一起，存在于載體中。在此以其最常用的意義使用的術(shù)語“載體”，其包括用于核酸的任何中間運(yùn)載體(vehicle)，其使所述核酸例如被引入原核和/或真核細(xì)胞，并且在適當(dāng)情況下被整合進(jìn)入基因組。這類載體優(yōu)選地在所述細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體或病毒基因組。本文中使用的術(shù)語“質(zhì)?！蓖ǔ１硎究瑟毩⒂谌旧wDNA而復(fù)制的染色體外遺傳物質(zhì)的構(gòu)建體，通常為環(huán)狀DNA雙鏈體。

對于表達(dá)抗體的載體，可使用其中抗體重鏈和輕鏈存在于不同的載體中的載體類型或者其中重鏈和輕鏈存在于同一載體中的載體類型。

本文中給出的關(guān)于特定核酸和氨基酸序列(例如，序列表中的序列)的教導(dǎo)解釋為還涉及所述特定序列的修飾形式，其導(dǎo)致功能性等同于所述特定序列的序列，例如，氨基酸序列表現(xiàn)出與所述特定氨基酸序列相同或相似的特性，并且編碼氨基酸序列的核酸序列表現(xiàn)出與所述特定核酸序列所編碼的氨基酸序列相同或相似的特性。

類似地，本文中給出的關(guān)于特定抗體或產(chǎn)生特異性抗體之雜交瘤的教導(dǎo)解釋為還涉及以相對于所述特定抗體的所述氨基酸序列和/或核酸序列是經(jīng)修飾的但是功能上等同的氨基酸序列和/或核酸序列為特征的抗體。一個重要的特性是保持抗體與其靶標(biāo)的結(jié)合或維持抗體的效應(yīng)功能。優(yōu)選地，當(dāng)用相對于特定序列修飾的序列替換抗體中的特定序列時，保持所述抗體與靶標(biāo)的結(jié)合，并且優(yōu)選保持本文所述的所述抗體的功能，例如CDC介導(dǎo)的裂解或ADCC介導(dǎo)的裂解。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可修飾高變區(qū)和可變區(qū)(特別是CDR的序列)而不失去與靶標(biāo)結(jié)合的能力。例如，CDR區(qū)會與本文中指定的抗體相同或高度同源。對于“高度同源”，考慮可在CDR中進(jìn)行1至5個(優(yōu)選1至4個，例如1至3個或者1或2個)替換。此外，可修飾高變區(qū)和可變區(qū)，以使其顯示出與本文中具體公開的抗體區(qū)域基本同源。

應(yīng)該理解，本文所述的特定核酸還包括為了優(yōu)化特定宿主細(xì)胞或生物中的密碼子使用而進(jìn)行了修飾的核酸。生物之間密碼子使用的差異可引起多種關(guān)于異源基因表達(dá)的問題。通過改變原始序列中的一個或多個核苷酸而進(jìn)行密碼子優(yōu)化可在待表達(dá)所述核酸的同源或異源宿主中引起核酸表達(dá)的優(yōu)化，特別是翻譯效率的優(yōu)化。例如，如果根據(jù)本發(fā)明需使用來自人并編碼抗體恒定區(qū)和/或構(gòu)架區(qū)的核酸，例如用于制備嵌合或人源化抗體，則為了優(yōu)化密碼子使用而修飾所述核酸可能是優(yōu)選的，特別是在如果所述核酸(任選地與異源核酸如來自本文所述其他生物的核酸融合)需在不同于人的生物(如小鼠或倉鼠)細(xì)胞中表達(dá)的情況下。例如，可修飾編碼人輕鏈和重鏈恒定區(qū)的核酸序列，以包含一個或多個、優(yōu)選至少1、2、3、4、5、10、15、20個以及優(yōu)選至多10、15、20、25、30、50、70或100個或更多核苷酸替換，所述替換引起密碼子使用的優(yōu)化。這樣的核苷酸替換優(yōu)選指不引起所編碼氨基酸序列改變的核苷酸替換，或者指分別編碼人輕鏈和重鏈恒定區(qū)的其他核酸序列中相應(yīng)位置的相應(yīng)替換。

優(yōu)選地，特定核酸序列與相對于所述特定核酸序列而修飾的核酸序列或所述特定核酸序列之變體的核酸序列的同一性程度會為至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％或者最優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％。對于CLDN6核酸變體，同一性的程度優(yōu)選針對至少約300、至少約400、至少約450、至少約500、至少約550、至少約600或至少約630個核苷酸的區(qū)域給出。在一些優(yōu)選的實施方案中，針對全長的參比核酸序列(例如，序列表中給出的核酸序列)給出同一性程度。優(yōu)選地，這兩個序列能夠彼此雜交并形成穩(wěn)定的雙鏈體，雜交優(yōu)選在允許多核苷酸之間特異性雜交的條件(嚴(yán)格條件)下進(jìn)行。嚴(yán)格條件描述于例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等，Editors，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989或者Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等，Editors，John Wiley&Sons，Inc.，New York，并且是指例如在65℃下在雜交緩沖液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH₂PO₄(pH 7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中的雜交。SSC是0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH 7。雜交之后，清洗已被轉(zhuǎn)移了DNA的膜，例如室溫下在2×SSC中清洗，并隨后在高達(dá)68℃的溫度下在0.1～0.5×SSC/0.1×SDS中清洗。

根據(jù)本發(fā)明，關(guān)于例如核酸和氨基酸序列的術(shù)語“變體”包括任何變體(特別是突變體，剪接變體，構(gòu)象、同種型、等位基因變體，物種變體和物種同源物)，特別是天然存在的變體。等位基因變體涉及基因正常序列中的改變，其意義經(jīng)常不清楚。全基因測序通常鑒定給定基因的大量等位基因變體。物種同源物是給定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。

關(guān)于核酸分子，術(shù)語“變體”包括簡并核酸序列，其中根據(jù)本發(fā)明的簡并核酸由于遺傳密碼的簡并性而不同于密碼子序列中的參比核酸。

另外，根據(jù)本發(fā)明的特定核酸序列的“變體”包括含有單個或多個(例如至少2個、至少4個或至少6個并且優(yōu)選多達(dá)3個、多達(dá)4個、多達(dá)5個、多達(dá)6個、多達(dá)10個、多達(dá)15個或多達(dá)20個)核苷酸替換、缺失和/或添加的核酸序列。

對于本發(fā)明的目的而言，氨基酸序列的“變體”包括氨基酸插入變體、氨基酸缺失變體和/或氨基酸替換變體。

在具有插入的氨基酸序列變體的情況中，向氨基酸序列的特定位點中插入一個或更多個氨基酸殘基，盡管隨機(jī)插入并對所產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行合適的篩選也是可能的。

氨基酸缺失變體的特征為從序列中除去一個或更多個氨基酸。

氨基酸替換變體的特征為序列中至少一個殘基被除去并在其位置中插入其他殘基。優(yōu)選在氨基酸序列中同源蛋白質(zhì)或肽之間非保守的位置處修飾和/或優(yōu)選將氨基酸置換為其他具有相似特性的氨基酸。

優(yōu)選地，蛋白質(zhì)變體中的氨基酸改變是保守性氨基酸改變，即替換帶有類似電荷的或不帶電荷的氨基酸。

特定氨基酸序列與相對于所述特定氨基酸而修飾的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體之間(例如，顯示基本同源的氨基酸序列之間)優(yōu)選的相似性程度、優(yōu)選的同一性會為至少70％，優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％或者最優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％。對于CLDN6多肽變體，優(yōu)選地針對至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個、至少約200個、至少約210個氨基酸的區(qū)域給出相似性或同一性程度。在一些優(yōu)選的實施方案中，針對全長的參比氨基酸序列(例如，序列表中所給出的氨基酸序列)給出相似性或同一性程度。

“序列相似性”表示相同或存在保守性氨基酸替換的氨基酸百分比。兩個多肽或核酸序列之間的“序列同一性”表示序列之間相同的氨基酸或核苷酸百分比。

術(shù)語“百分同一性”意在表示在最佳比對之后獲得的兩個待比較的序列之間相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分比，該百分比是純統(tǒng)計學(xué)的，并且這兩個序列之間的差異在其整個長度上隨機(jī)地分布。通過任選地比對它們之后，比較這些序列，常規(guī)地進(jìn)行兩個核苷酸或氨基酸序列之間的序列比較，所述比較是通過區(qū)段或“比較窗”進(jìn)行的，以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。除了手工進(jìn)行之外，可通過Smith and Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法，通過Neddleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，通過Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性搜索法，或者通過使用這些算法的計算機(jī)程序(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)來產(chǎn)生對用于比較之序列的最佳比對。

通過測定被比較的兩個序列之間相同位置的數(shù)目來計算百分同一性，將該數(shù)目除以所比較的位置數(shù)并使結(jié)果乘以100以獲得這兩個序列之間的百分同一性。

例如，可根據(jù)所涉殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)而進(jìn)行“保守性替換”。例如：(a)非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及(d)帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。替換通常可在組(a)～(d)之內(nèi)進(jìn)行。此外，根據(jù)甘氨酸和脯氨酸破壞α-螺旋的能力，它們可以彼此替換?？稍谝韵陆M之間進(jìn)行一些優(yōu)選的替換：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。鑒于已知的遺傳代碼以及重組和合成DNA技術(shù)，技術(shù)人員可很容易地構(gòu)建編碼保守性氨基酸變體的DNA。

本發(fā)明包括所述核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)(特別是本文所述的抗體)的衍生物。

術(shù)語“衍生物”包括核酸在核苷酸堿基、糖或磷酸酯上的任何化學(xué)衍生化。術(shù)語“衍生物”還包括含有非天然存在的核苷酸和核苷酸類似物。優(yōu)選地，核酸的衍生化提高其穩(wěn)定性。

根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)和肽的“衍生物”為蛋白質(zhì)和肽的修飾形式。這樣的修飾包括任何化學(xué)修飾并且包括單個或多個與蛋白質(zhì)或肽相關(guān)聯(lián)之任何分子(例如碳水化合物、脂和/或蛋白質(zhì)或肽)的替換、缺失和/或增加。術(shù)語“衍生物”還延伸至所述蛋白質(zhì)和肽的全部功能性化學(xué)等同物。優(yōu)選地，修飾的肽具有提高的穩(wěn)定性和/或提高的免疫原性。

根據(jù)本發(fā)明，核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)的變體、衍生物、修飾形式、片段、部件(part)或部分(portion)優(yōu)選地分別具有從其來源的核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)的功能特性。這樣的功能特性包括與肽或蛋白質(zhì)(例如抗體或抗體靶標(biāo)，特別是CLDN6)的相互作用、核酸的選擇性結(jié)合以及酶活性。在一個實施方案中，核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)的變體、衍生物、修飾形式、片段、部件(part)或部分(portion)分別與從其來源的核酸序列、氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)免疫學(xué)上等同。在一個實施方案中，功能特性是免疫學(xué)特性。

根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選地是完整細(xì)胞，即具有完整膜的未釋放其正常的細(xì)胞內(nèi)成分(例如，酶、細(xì)胞器或遺傳物質(zhì))的細(xì)胞。完整細(xì)胞優(yōu)選地是活細(xì)胞(viable cell)，即能夠進(jìn)行正常代謝功能的活細(xì)胞(living cell)。優(yōu)選地，細(xì)胞是人細(xì)胞。

如本文中使用的“細(xì)胞”可以是“宿主細(xì)胞”，其意為指重組核酸已被引入的細(xì)胞。

術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是指具有包含一個或更多個轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因)或轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)(整合或不整合到動物的天然基因組DNA中)的基因組的動物，并且其優(yōu)選能夠表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因以及人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，以使當(dāng)用CLDN6抗原和/或表達(dá)CLDN6的細(xì)胞免疫時，所述小鼠產(chǎn)生人抗-CLDN6抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可被整合到小鼠的染色體DNA中(如轉(zhuǎn)基因小鼠(例如，HuMAb小鼠(例如，HCo7或HCol2小鼠))中的情況那樣)，或者可以染色體外維持人重鏈轉(zhuǎn)基因(如WO 02/43478中描述的轉(zhuǎn)染色體(例如，KM)小鼠中的情況那樣)。通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，這樣的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠可以以能夠產(chǎn)生多同種型的抗CLDN6的人單克隆抗體(例如，IgG、IgA和/或IgE)。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“治療效應(yīng)子部分”意為可發(fā)揮治療作用的任何分子。根據(jù)本發(fā)明，將治療效應(yīng)分子優(yōu)選地選擇性引入表達(dá)CLDN6的細(xì)胞，其包括抗癌劑、放射性同位素、毒素、細(xì)胞靜止劑或細(xì)胞裂解藥等?？拱﹦┌?，例如氨魯米特、硫唑嘌呤、硫酸博來霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、cytarabidine、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干擾素-α、洛莫司汀、巰嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、鹽酸丙卡巴肼、硫鳥嘌呤、硫酸長春堿和硫酸長春新堿。其他抗癌劑例如在Goodman和Gilman，″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，第8版，1990年，McGraw-Hill，Inc.中尤其在第52章(Antineoplastic Agents(Paul Calabresi和Bruce A.Chabner))中有所描述。毒素可以是蛋白質(zhì)(例如美洲商陸抗病毒蛋白、霍亂毒素、百日咳毒素、蓖麻毒素、多花白樹毒蛋白、相思豆毒素、白喉外毒素或綠膿桿菌(Pseudomonas)外毒素。毒素殘基還可以是高能量發(fā)射放射性核素(例如鈷60)。

本文中使用的“降低”或“抑制”意為引起總體降低的能力，優(yōu)選5％或更高、10％或更高、20％或更高、更優(yōu)選50％或更高并且最優(yōu)選75％或更高水平的降低，例如細(xì)胞增殖水平的降低。術(shù)語“抑制”或類似的詞語包括完全或基本完全的抑制，即降低至0或基本降低至0。

術(shù)語例如“提高”或“增強(qiáng)”優(yōu)選地表示提高或增強(qiáng)約至少10％、優(yōu)選至少20％、優(yōu)選至少30％、更優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少50％、甚至更優(yōu)選至少80％并且最優(yōu)選至少100％。

術(shù)語“免疫學(xué)上等同”意為例如對于免疫作用的類型(例如誘導(dǎo)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)、所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和/或持續(xù)時間或者所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特異性而言，免疫學(xué)上等同分子(例如免疫學(xué)上等同氨基酸序列)表現(xiàn)出相同或基本相同的免疫特性和/或發(fā)揮相同或基本相同的免疫作用。在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“免疫學(xué)上等同”優(yōu)選地是相對于免疫的肽或肽變體或者抗體的免疫作用或特性而使用的。特定的免疫特性是與抗體結(jié)合和(在適當(dāng)情況下)產(chǎn)生免疫應(yīng)答(優(yōu)選地通過刺激抗體的產(chǎn)生)的能力。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于對象的免疫系統(tǒng)時誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(優(yōu)選抗體，其具有與參比氨基酸序列(例如，所述參比氨基酸序列形成CLDN6的部件)反應(yīng)的特異性)，則所述氨基酸序列與參比氨基酸序列免疫學(xué)上等同。

在本文的情況中，術(shù)語“免疫效應(yīng)子功能”包括免疫系統(tǒng)的組分所介導(dǎo)的任何功能，其導(dǎo)致抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤發(fā)生，包括抑制腫瘤的播散和轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，免疫效應(yīng)子功能導(dǎo)致殺傷腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的情況中的免疫效應(yīng)子功能是抗體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。這樣的功能包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、在帶有腫瘤相關(guān)抗原(例如CLDN6)的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(例如，通過抗體與表面抗原的結(jié)合)和/或抑制帶有腫瘤相關(guān)抗原之細(xì)胞的增殖，優(yōu)選ADCC和/或CDC。因此，能夠介導(dǎo)一種或更多種免疫效應(yīng)子功能的抗體優(yōu)選地能夠通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解、ADCC介導(dǎo)的裂解、凋亡、同質(zhì)性黏附和/或吞噬作用(優(yōu)選通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解)介導(dǎo)對細(xì)胞的殺傷。抗體還可簡單地通過與腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合而發(fā)揮作用。例如，抗體可僅通過與腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合而阻斷腫瘤相關(guān)抗原的功能或誘導(dǎo)凋亡。

本文所述的抗體、組合物和方法可用于治療患有腫瘤疾病(例如，以存在表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞為特征的疾病)的對象?？芍委熀?或預(yù)防的腫瘤疾病的實例包括所有表達(dá)CLDN6的癌癥和腫瘤實體(包括本文所述的那些)。

本文所述的抗體、組合物和方法還可用于免疫或接種疫苗，以預(yù)防本文所述的疾病。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疾病”是指任何病理狀態(tài)，包括癌癥，特別是本文中所描述形式的癌癥。

根據(jù)本發(fā)明，“與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞相關(guān)的疾病”意為與健康組織或器官中的狀態(tài)相比，病態(tài)的組織或器官的細(xì)胞中的CLDN6的表達(dá)優(yōu)選地提高。提高是指提高至少10％，特別是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或者甚至更高。在一個實施方案中，表達(dá)僅見于病態(tài)的組織，而健康組織中的表達(dá)被抑制。根據(jù)本發(fā)明，與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞相關(guān)或相關(guān)聯(lián)的疾病包括腫瘤疾病，例如癌疾病。此外，根據(jù)本發(fā)明，腫瘤疾病(例如癌疾病)優(yōu)選是這樣的疾病，其中腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞表達(dá)CLDN6。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“腫瘤”或“腫瘤疾病”指由細(xì)胞異常生長(稱為腫瘤細(xì)胞(neoplastic cell或tumor cell))所形成的膨脹或病變。“腫瘤細(xì)胞”意為通過迅速的、不可控的細(xì)胞增殖而生長并且在引起該新生長的刺激消除之后繼續(xù)生長的異常細(xì)胞。腫瘤表現(xiàn)為部分或完全缺乏結(jié)構(gòu)性組織(structrual organization)和與正常組織的功能性協(xié)調(diào)，并且通常形成獨特的組織塊，所述腫瘤可以是良性的、惡化前的或惡性的。

良性腫瘤是缺乏癌癥的所有三種惡性特征的腫瘤。因此，對于定義，良性腫瘤不會以無限制的侵略性方式生長，不會侵襲周圍組織，并且不會擴(kuò)散至非鄰近組織(轉(zhuǎn)移)。良性腫瘤的一般實例包括痣和子宮肌瘤。

術(shù)語“良性”意味著溫和且非進(jìn)展性的疾病，事實上很多類型的良性腫瘤對健康無害。然而，一些由于其缺乏癌癥的侵襲特征而被定義為“良性腫瘤”的腫瘤仍然可產(chǎn)生負(fù)面的健康影響。其實例包括產(chǎn)生“質(zhì)量效應(yīng)”(壓迫生命器官(例如血管))的腫瘤或者可過度產(chǎn)生某些激素的內(nèi)分泌組織的“功能性”腫瘤(實例包括甲狀腺腺瘤、腎上腺皮質(zhì)腺瘤和垂體腺瘤)。

良性腫瘤通常被抑制其能夠以惡性方式表現(xiàn)的外表面所圍繞。在一些情況中，某些“良性”腫瘤由于腫瘤之腫瘤細(xì)胞的亞群中另外的遺傳變化隨后可引起惡性癌癥。該現(xiàn)象顯著的實例是管狀腺瘤，普通型結(jié)腸息肉(結(jié)腸癌癥的重要前體)。管狀腺瘤中的細(xì)胞(像時常發(fā)展成癌癥的大部分腫瘤)顯示細(xì)胞成熟和外觀的某些異常，共同地稱為發(fā)育異常。這些細(xì)胞異常在很少或從不變?yōu)榘┑牧夹阅[瘤中未見，但是見于其他沒有形成離散團(tuán)塊的癌前組織異常(例如子宮頸的癌前病變)中。一些機(jī)構(gòu)傾向?qū)l(fā)育異常腫瘤稱為“惡化前”，并且對于很少或從不引起癌癥的腫瘤保留術(shù)語“良性”。

腫瘤是由于瘤形成(neoplasia)的異常組織團(tuán)塊。瘤形成(希臘語，新生長)是細(xì)胞的異常增殖。細(xì)胞生長過度并且與其周圍的正常組織不協(xié)調(diào)。生長以同一過度方式進(jìn)行，甚至在刺激停止之后仍然如此。這通常引起塊或腫瘤。腫瘤可以是良性的、惡化前的或惡性的。

根據(jù)本發(fā)明的“腫瘤的生長”或“腫瘤生長”指腫瘤提高其大小的趨勢和/或腫瘤細(xì)胞增殖的趨勢。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的“腫瘤疾病”是癌癥疾病(即惡性疾病)并且腫瘤細(xì)胞是癌細(xì)胞。優(yōu)選地，“腫瘤疾病”以表達(dá)CLDN6的細(xì)胞為特征并且腫瘤細(xì)胞表達(dá)CLDN6。

癌癥(醫(yī)學(xué)術(shù)語：惡性腫瘤)是一類疾病，其中一組細(xì)胞展現(xiàn)出不受控制的生長(超過正常限制的分裂)、侵襲(侵入并且破壞鄰近組織)并且有時轉(zhuǎn)移(通過淋巴和血液擴(kuò)散至身體中的其他位置)。癌癥的這三種惡性特征將它們與良性腫瘤區(qū)分開，良性腫瘤有自限性，并且不會侵襲或轉(zhuǎn)移。大部分癌癥來自腫瘤，但是有一些(如白血病)不是。

表達(dá)CLDN6的細(xì)胞優(yōu)選地是腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞，優(yōu)選本文所述的腫瘤和癌的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。優(yōu)選地，這樣的細(xì)胞不是胎盤細(xì)胞。

將癌癥通過類似腫瘤和由此假定腫瘤來源之組織的細(xì)胞類型進(jìn)行分類。它們分別是組織學(xué)和位置。

根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“癌癥(cancer)”包括白血病、精原細(xì)胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎部癌癥、腎上腺癌、甲狀腺癌、血癌、皮膚癌癥、腦的癌癥、宮頸癌癥、腸癌(intestinal cancer)、肝部癌癥、結(jié)腸癌癥、胃部癌癥、腸癌(intestine cancer)、頭頸部癌癥、胃腸癌、淋巴結(jié)癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌癥、耳鼻喉(ENT)癌、乳癌、前列腺癌、子宮的癌癥、卵巢癌癥和肺部癌癥以及其轉(zhuǎn)移。其實例為肺部癌癥、乳房癌、前列腺癌、結(jié)腸癌癥、腎細(xì)胞癌、宮頸癌癥或者上述癌癥類型或腫瘤的轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語癌癥還包括癌癥轉(zhuǎn)移。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的腫瘤疾病或癌癥選自：卵巢癌癥(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺部癌癥(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃部癌癥、乳癌、肝部癌癥、胰腺癌癥、皮膚癌癥(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸部癌癥(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌癥、膀胱癌癥(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎部癌癥(特別是腎細(xì)胞癌，包括透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌癥、小腸癌癥(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌癥、睪丸癌癥(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎睪丸癌癥)和子宮癌癥，及其轉(zhuǎn)移形式。

根據(jù)本發(fā)明的尤其優(yōu)選的腫瘤疾病或癌癥選自卵巢癌癥、肺部癌癥、轉(zhuǎn)移性卵巢癌癥和轉(zhuǎn)移性肺部癌癥。優(yōu)選地，所述卵巢癌癥是卵巢癌(ovarian carcinoma)或卵巢腺癌。優(yōu)選地，所述肺部癌癥是癌或腺癌，并且優(yōu)選地是細(xì)支氣管癌，例如細(xì)支氣管癌或細(xì)支氣管腺癌。在一個實施方案中，腫瘤細(xì)胞是這樣的癌的細(xì)胞。轉(zhuǎn)移性卵巢癌癥包括轉(zhuǎn)移性卵巢癌和轉(zhuǎn)移性卵巢腺癌，轉(zhuǎn)移性肺部癌癥包括轉(zhuǎn)移性肺癌、轉(zhuǎn)移性肺腺癌、轉(zhuǎn)移性細(xì)支氣管癌和轉(zhuǎn)移性細(xì)支氣管腺癌。

肺部癌癥的主要類型是小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。有三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌：鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。腺癌占肺部癌癥的約10％。與小細(xì)胞肺癌和鱗狀細(xì)胞肺癌(二者均傾向于位于更中心的位置)相反，這種癌通常見于肺的外周。

皮膚癌癥是皮膚上的惡性生長。最常見的皮膚癌癥是基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤。惡性黑色素瘤是嚴(yán)重類型的皮膚癌癥。它是由色素細(xì)胞(稱為黑素細(xì)胞)的不可控生長所引起的。

根據(jù)本發(fā)明，“癌(carcinoma)”是來源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。該組表示最常見的癌癥，包括乳房癌、前列腺癌和結(jié)腸癌癥的常見形式。

“細(xì)支氣管癌(bronchiolar carcinoma)”是肺的癌，被認(rèn)為源自終末細(xì)支氣管的上皮，其中腫瘤組織沿著肺泡壁延伸，并在肺泡中以小團(tuán)塊生長。在一些細(xì)胞中以及在肺泡中的物質(zhì)(其還包含裸露的細(xì)胞)中可展示出黏蛋白。

“腺癌”是源自腺組織的癌癥。該組織也是稱為上皮組織的較大組織分類的一部分。上皮組織包括皮膚、腺體以及內(nèi)襯于身體的腔和器官的多種其他組織。上皮在胚胎學(xué)上源自外胚層、內(nèi)胚層和中胚層。被分類為腺癌的細(xì)胞不一定必需是腺體的一部分，只要他們具有分泌特征即可。這種形式的癌可發(fā)生于一些高等哺乳動物(包括人)中。分化良好的腺癌傾向于與其所來源的腺組織類似，而低分化的腺癌可以不是這樣。通過染色來自活檢的細(xì)胞，病理學(xué)家將確定腫瘤是否是腺癌或其他一些類型的癌。因為身體內(nèi)腺體普遍存在的屬性，腺癌可源自身體的很多組織。雖然每種腺體可不分泌相同的物質(zhì)，只要細(xì)胞有外分泌功能，它就可被認(rèn)為是腺性的，并且它的惡性形式因而被命名為腺癌。只要有充足的時間，惡性腺癌侵襲其他組織并經(jīng)常轉(zhuǎn)移。卵巢腺癌是最常見類型的卵巢癌。它包括漿液和黏液性腺癌、透明細(xì)胞腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌。

“囊腺癌”是表面上皮-間質(zhì)腫瘤(surface epithelial-stromal tumor)(一種卵巢癌類型)的惡性形式。

表面上皮-間質(zhì)腫瘤是被認(rèn)為源自卵巢表面上皮(改性的腹膜)或源自異位子宮內(nèi)膜或輸卵管(管)組織的一類卵巢腫瘤。該組腫瘤占所有卵巢腫瘤的絕大多數(shù)。

“絨毛膜癌”是惡性的、滋養(yǎng)層的和侵襲性的癌，通常是胎盤的癌。它以早期血行擴(kuò)散至肺為特征。

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma)(還稱為腎細(xì)胞癌(renal cell cancer)或腎細(xì)胞腺癌)是源自近曲小管(腎中過濾血液并除去廢物的非常小的管)之襯里的腎部癌癥。目前，腎細(xì)胞癌是成人中最常見的腎部癌癥類型，并且是所有生殖泌尿腫瘤中最致命的。腎細(xì)胞癌的獨特亞型是透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌。透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌是最常見形式的腎細(xì)胞癌。當(dāng)在顯微鏡下觀察時，組成透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌的細(xì)胞表現(xiàn)的非常蒼白或透明。乳頭狀腎細(xì)胞癌是第二常見的亞型。這些癌在一些(如果不是大多數(shù)的話)腫瘤中形成小的手指樣突出(稱為乳頭狀突起)。

肉瘤是始于結(jié)締組織或間充質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤。這與上皮來源的癌相反?；と饬鍪呛币娦问降陌┌Y，其通常發(fā)生在臂或腿的關(guān)節(jié)附近。它是一種軟組織肉瘤。

生殖細(xì)胞腫瘤是源自生殖細(xì)胞的腫瘤。生殖細(xì)胞腫瘤可以是癌性或非癌性的腫瘤。生殖細(xì)胞通常發(fā)生于性腺(卵巢和睪丸)內(nèi)。源自性腺外(例如，頭中，口內(nèi)，頸，骨盆；在胎兒、嬰兒和幼兒中最常見于身體中線，特別地在尾骨的尖部)的生殖細(xì)胞腫瘤可以是源自胚胎發(fā)育過程中之錯誤的出生缺陷。

兩種主要類型的生殖細(xì)胞腫瘤是精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞瘤，其中非精原細(xì)胞瘤包括：畸胎癌、胚胎癌、卵黃囊瘤、絨毛膜癌和分化的畸胎瘤。來自非精原細(xì)胞的多數(shù)細(xì)胞系等同于胚胎癌，即它們幾乎完全由在基礎(chǔ)條件下不分化的干細(xì)胞組成，盡管其中一些可以響應(yīng)于分化誘導(dǎo)劑(例如，視黃酸)。

畸胎癌(teratocarcinoma)是指生殖細(xì)胞腫瘤，它是畸胎瘤(teratoma)與胚胎癌或與絨毛膜癌或與這二者的混合物。該類型的混合的生殖細(xì)胞腫瘤可簡單地認(rèn)為是具有胚胎癌或絨毛膜癌的元件的畸胎瘤，或者簡單地忽略畸胎瘤組分和僅僅指其惡性組分：胚胎癌和/或絨毛膜癌。

淋巴瘤和白血病是源自造血(血形成)細(xì)胞的惡性腫瘤。

母細(xì)胞瘤(Blastic tumor)或胚細(xì)胞瘤是類似不成熟或胚組織的腫瘤(一般是惡性的)。在兒童中常見許多這些腫瘤。

“轉(zhuǎn)移”意為癌細(xì)胞從其初始位置擴(kuò)散至身體的其他部分。轉(zhuǎn)移的形成是非常復(fù)雜的過程，有賴于惡性細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫離，侵襲細(xì)胞外基質(zhì)，穿透內(nèi)皮基底膜進(jìn)入體腔和血管，并隨后通過血液運(yùn)輸，然后浸潤靶器官。最后，新腫瘤(即繼發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤)在目標(biāo)位置的生長有賴于血管發(fā)生。甚至在除去原發(fā)腫瘤之后仍經(jīng)常發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，因為腫瘤細(xì)胞或組分可殘留并發(fā)展出轉(zhuǎn)移潛力。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”表示“遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移”，其表示遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤和局部淋巴結(jié)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。

繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞與原發(fā)性腫瘤中的細(xì)胞類似。這意味著例如如果卵巢癌癥轉(zhuǎn)移至肝，則所述繼發(fā)性腫瘤由異常的卵巢細(xì)胞(而不是異常的肝細(xì)胞)組成。隨后，肝中的腫瘤被稱為轉(zhuǎn)移性卵巢癌癥(而不是肝部癌癥)。

在卵巢癌癥中，轉(zhuǎn)移可通過以下方式發(fā)生：通過直接接觸或延伸，其可侵襲接近卵巢或卵巢周圍的附近組織或器官(例如輸卵管、子宮、膀胱、直腸等)；通過播種(seeding)或脫落至腹腔中，這是卵巢癌癥擴(kuò)散最常見的方式。癌細(xì)胞從卵巢團(tuán)塊表面斷開并且“掉”入腹部中的其他組織(例如肝、胃、結(jié)腸或隔膜)；通過從卵巢團(tuán)塊逃脫，侵襲淋巴管，之后轉(zhuǎn)移至身體的其他區(qū)域或遠(yuǎn)離的器官(例如肺或肝)；通過從卵巢團(tuán)塊逃脫，侵襲血液系統(tǒng)，之后轉(zhuǎn)移至身體的其他區(qū)域或遠(yuǎn)離的器官。

根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)移性卵巢癌癥包括輸卵管中的癌癥、腹部器官中的癌癥(例如腸中的癌癥、子宮中的癌癥、膀胱中的癌癥、直腸中的癌癥、肝中的癌癥、胃中的癌癥、結(jié)腸中的癌癥、隔膜中的癌癥)、肺中的癌癥、腹部內(nèi)層或骨盆(腹膜)中的癌癥和腦中的癌癥。類似地，轉(zhuǎn)移性肺部癌癥指這樣的癌癥，其從肺擴(kuò)散至身體中的遠(yuǎn)離的和/或數(shù)個位置并且包括肝中的癌癥、腎上腺中的癌癥、骨中的癌癥和腦中的癌癥。

當(dāng)人再次受到過去影響他們的條件影響時，發(fā)生復(fù)發(fā)或再發(fā)生。例如，如果患有腫瘤疾病的患者已經(jīng)得到成功治療所述疾病而且再次發(fā)生所述疾病，那么所述新發(fā)生的疾病可被認(rèn)為是復(fù)發(fā)或再發(fā)生。然而，根據(jù)本發(fā)明，腫瘤疾病的復(fù)發(fā)或再發(fā)生可未必在原始腫瘤疾病的位置發(fā)生。因此，例如，如果患者患有卵巢腫瘤并且接受成功治療，那么復(fù)發(fā)或再發(fā)生可以是發(fā)生卵巢腫瘤或在不同于卵巢的位置發(fā)生腫瘤。腫瘤的復(fù)發(fā)或再發(fā)生還可包括這樣的狀況，其中在不同于原始腫瘤之位置的位置以及在原始腫瘤的位置發(fā)生腫瘤。優(yōu)選地，患者接受治療的原始腫瘤是原發(fā)性腫瘤并且在不同于原始腫瘤之位置的位置上的腫瘤是繼發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。

“治療”意為向?qū)ο笫┯帽疚乃龅幕衔锘蚪M合物以：預(yù)防或清除腫瘤或使對象中的腫瘤的大小或腫瘤的數(shù)目降低；阻滯或減緩對象中的腫瘤生長；抑制或減緩對象中新腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生；降低目前患有或以前曾患有癌癥之對象中的癥狀和/或復(fù)發(fā)的頻率或嚴(yán)重程度；和/或延長(即，提高)所述對象的壽命。

尤其，術(shù)語“疾病的治療”包括疾病或其癥狀的治愈，縮短持續(xù)時間，改善、預(yù)防、減緩或抑制進(jìn)展或惡化，或者預(yù)防或延緩發(fā)生。

“有風(fēng)險”意為被鑒定為與一般人群相比具有高于患腫瘤疾病(特別是癌癥)正常幾率的對象(即，患者)。此外，已患有或目前患有腫瘤疾病(特別是癌癥)的對象是具有提高的患癌癥風(fēng)險的對象，因為這樣的對象可繼續(xù)患癌癥。目前已患有或曾患有腫瘤的對象還具有提高的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

術(shù)語“免疫治療”表示涉及特異性免疫反應(yīng)的治療。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語例如“保護(hù)”、“預(yù)防”、“預(yù)防性的(prophylactic)”、“預(yù)防的(preventive)”或“保護(hù)性的(protective)”表示在個體中預(yù)防或治療(或二者兼有)腫瘤的發(fā)生和/或傳播，并且尤其指使對象將患有腫瘤的機(jī)會最小化或延緩患有腫瘤。例如，如上述，有腫瘤發(fā)生風(fēng)險的對象應(yīng)是治療以預(yù)防腫瘤的人選。

預(yù)防性施用免疫治療(例如，預(yù)防性施用本發(fā)明的組合物)優(yōu)選地對接受者進(jìn)行保護(hù)以避免發(fā)生腫瘤生長。治療性施用免疫治療(例如，治療性施用本發(fā)明的組合物)可導(dǎo)致抑制腫瘤的進(jìn)展/生長。這包括使腫瘤的進(jìn)展/生長減速(特別是破壞腫瘤的進(jìn)展)，這優(yōu)選地導(dǎo)致腫瘤的清除。

術(shù)語“體內(nèi)”指在對象中的情況。

可互換地使用術(shù)語“對象”、“個體”或“患者”，其表示脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物。例如，在本發(fā)明的情況中，哺乳動物是人、非人靈長類、家養(yǎng)的動物(例如，犬、貓、綿羊、牛、山羊、豬、馬等)、實驗動物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)以及圈養(yǎng)的動物(例如，動物園中的動物)。本文中使用的術(shù)語“動物”還包括人。術(shù)語“對象”還可包括患者，即，患有疾病(優(yōu)選與CLDN6之表達(dá)相關(guān)的疾病(優(yōu)選腫瘤疾病(例如癌癥)))的動物(優(yōu)選人)。

作為用于免疫或接種疫苗之組合物的一部分，優(yōu)選地，本文所述的一種或更多種藥劑與一種或更多種用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或用于提高免疫應(yīng)答的佐劑一起施用。術(shù)語“佐劑”表示延長或增強(qiáng)或加速免疫應(yīng)答的化合物。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地在不添加佐劑的情況下發(fā)揮其作用。盡管如此，本申請的組合物可包含任何已知的佐劑。佐劑包含一組異質(zhì)的化合物，例如油乳劑(例如，弗氏佐劑)、無機(jī)化合物(例如，明礬)、細(xì)菌產(chǎn)物(例如，百日咳毒素桿菌(Bordetella pertussis)毒素)、脂質(zhì)體和免疫刺激復(fù)合物。

佐劑的實例是單磷?；?脂質(zhì)-A(MPL SmithKline Beecham)。皂苷，例如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So等，1997，Mol.Cells 7：178-186)，不完全弗氏佐劑，完全弗氏佐劑，維生素E，montanid，明礬，CpG寡核苷酸(Krieg等，1995，Nature 374：546-549)和多種以生物可降解的油(例如，角鯊烯和/或生育酚)制備的油包水型乳劑。

根據(jù)本發(fā)明，“樣品”可以是任何根據(jù)本發(fā)明可使用的樣品，特別是生物樣品，例如組織樣品(包括體液)和/或細(xì)胞樣品，并且可以以常規(guī)方式獲得，例如通過組織活檢(包括鉆取活檢)以及通過取血、支氣管吸出物、痰、尿、糞便或其他體液。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“樣品”還包括經(jīng)處理的樣品，例如生物樣品的級分或分離物(例如核酸和肽/蛋白質(zhì)分離物)。

也可施用刺激患者免疫應(yīng)答的其他物質(zhì)。例如，可能在接種免疫中使用細(xì)胞因子，這是因為其對淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)特性。例如，這樣的細(xì)胞因子例如包括白細(xì)胞介素-12(IL-12)(其顯示提高疫苗的保護(hù)性作用(Hall(1995)Science 268：1432-1434))、GM-CSF和IL-18。

有許多化合物增強(qiáng)免疫應(yīng)答并且因此可用于疫苗接種。所述化合物包括以蛋白質(zhì)或核酸形式提供的共刺激分子，例如B7-1和B7-2(分別為CD80和CD86)。

本發(fā)明的治療活性化合物可通過任何常規(guī)途徑(包括通過注射或輸注)施用。施用可例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或經(jīng)皮進(jìn)行。優(yōu)選地，抗體經(jīng)由肺噴霧治療施用。

在另一個實施方案中，可以這樣配制本發(fā)明的抗體以防止或降低其被運(yùn)輸通過胎盤。這可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法(例如，通過抗體的聚乙二醇化或通過使用F(ab)2′片段)來進(jìn)行。還可參照″Cunningham-RundlesC，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates.Resistance to enzymatic degradation.J.Immunol.Methods，152：177-190；和參照″Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins，Ann.Allergy AsthmaImmunol.74：279-283。

本發(fā)明組合物以有效量施用?！坝行Я俊敝竼为毣蚺c其他制劑一起達(dá)到預(yù)期反應(yīng)或預(yù)期作用的量。在治療特定疾病或特定狀況的情況中，預(yù)期反應(yīng)優(yōu)選地涉及抑制疾病的過程。這包括減緩疾病的進(jìn)展，特別地中斷或改變疾病的進(jìn)展。治療疾病或狀況中的期望反應(yīng)還可延緩或預(yù)防所述疾病或所述狀況發(fā)生。

本發(fā)明組合物的有效量將有賴于待治療的狀況、疾病的嚴(yán)重程度、患者的個體參數(shù)(包括年齡、生理狀況、尺寸和重量)、治療時間、伴隨治療(如果存在)的類型、施用的特定途徑及類似的因素。因此，施用本發(fā)明組合物的劑量可有賴于多種這樣的參數(shù)。在這樣的情況下，當(dāng)用初始劑量患者中的反應(yīng)不充分，可使用較高劑量(或者通過不同的更局部的給藥途徑而達(dá)到的有效地較高劑量)。

本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地是無菌的并且包含有效量的治療活性物質(zhì)，以產(chǎn)生期望反應(yīng)或期望作用。

本發(fā)明的藥物組合物通常以藥物可相容的量并且在藥物可相容的制備物中施用。術(shù)語“藥物可相容”指不與所述藥物組合物之活性組分的作用有相互影響的無毒材料。該類型的制備物一般可包括鹽、緩沖物質(zhì)、防腐劑、載劑、補(bǔ)充免疫增強(qiáng)物質(zhì)(例如佐劑(例如CpG寡核苷酸、細(xì)胞因子、趨化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA))和(在適當(dāng)情況下)其他治療活性化合物。當(dāng)用于醫(yī)藥時，所述鹽應(yīng)是藥物可相容的。然而，非藥物可相容的鹽可用于制備藥物可相容的鹽并且包括在本發(fā)明中。該類型的藥理學(xué)或藥物可相容的鹽以非限制的方式包括由以下酸制備的那些：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。藥物可相容的鹽還可如堿金屬鹽或堿土金屬鹽制備，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。

本發(fā)明的藥物組合物可包含藥物可相容載劑。術(shù)語“載劑(carrier)”指天然或合成性的有機(jī)或無機(jī)組分，其中組合活性組分以促進(jìn)應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥物可相容載劑”包括一種或更多種可相容固體或液體填料、稀釋劑或包封物質(zhì)，它們適于施用至患者。一般使得本發(fā)明藥物組合物的組分能夠不發(fā)生顯著破壞預(yù)期藥物功效的相互作用。

本發(fā)明的藥物組合物可包含合適的緩沖物質(zhì)，例如鹽中的乙酸、鹽中的檸檬酸、鹽中的硼酸和鹽中的磷酸。

藥物組合物還可(在適當(dāng)情況下)包含合適的防腐劑，例如苯扎氯銨、氯丁醇、尼泊金和硫柳汞。

所述藥物組合物一般以均一劑量形式提供并且可以本身已知的方式制備。本發(fā)明的藥物組合物可以是例如膠囊、片劑、錠劑、溶液、懸浮液、糖漿劑、酏劑的形式或者是乳劑的形式。

適于腸胃外施用的組合物一般包含活性化合物的無菌水性或非水性制備物，其優(yōu)選與受者血液等滲。可相容載劑或溶劑的實例為Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，一般無菌固定油用作溶液或懸浮介質(zhì)。

本發(fā)明通過以下圖和實施例進(jìn)行細(xì)節(jié)描述，圖和實施例僅用于示例目的并且不意為限制。由于本描述和本實施例，同樣包含在本發(fā)明中的其他實施方案為技術(shù)人員所得到。

附圖說明

圖1：

抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB 5F2D2、27A和36A的結(jié)合特異性。

muMAB 5F2D2、27A和36A抗體與表達(dá)CLDN6的細(xì)胞強(qiáng)結(jié)合，而他們不與表達(dá)CLDN3或CLDN4的細(xì)胞結(jié)合。

圖2：

muMAB 5F2D2分別與瞬時轉(zhuǎn)染CLDN6、3、4或9的HEK293T細(xì)胞結(jié)合的的滴定。

muMAB 5F2D2顯示與人CLDN6強(qiáng)結(jié)合，而與人CLDN9弱結(jié)合?？贵w不與人CLDN3或4相互作用。

圖3

muMAB 27A分別與瞬時轉(zhuǎn)染CLDN6、3、4或9的HEK293T細(xì)胞相結(jié)合的的滴定。

muMAB 27A顯示與人CLDN6強(qiáng)結(jié)合，而與人CLDN9非常弱地結(jié)合?？贵w不與人CLDN3或4相互作用。

圖4

muMAB 36A分別與瞬時轉(zhuǎn)染CLDN6、3、4或9的HEK293T細(xì)胞相結(jié)合的的滴定。

muMAB 36A顯示與人CLDN6強(qiáng)結(jié)合，而幾乎不與人CLDN9相結(jié)合。抗體不與人CLDN3或4相互作用。

圖5

抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB 5F2D2、27A和36A的相對親和力。

muMAB 5F2D2和27A表現(xiàn)的EC50值為350～450ng/ml并且在低濃度下達(dá)到飽和結(jié)合，而muMAB 36A沒有顯示飽和結(jié)合，甚至在最高濃度下也是如此。

圖6

抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB 5F2D2的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)活性。

muMAB 5F2D2顯示出劑量依賴的CDC活性。

圖7

抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB 27A和36A的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)活性。

muMAB 27A表現(xiàn)出劑量依賴的CDC活性，而muMAB 36A不能體外誘導(dǎo)CDC。

圖8

嵌合抗CLDN6抗體chimAB 5F2D2對內(nèi)源性表達(dá)CLDN6之NEC8和NEC8 LVTS2 54(CLDN6敲低)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的誘導(dǎo)。

嵌合抗CLDN6抗體chimAB 5F2D2以劑量依賴的方式誘導(dǎo)對具有兩個不同供體之效應(yīng)細(xì)胞的NEC8細(xì)胞的ADCC。使用chimAB 5F2D2誘導(dǎo)對NEC8 LVTS2 54(CLDN6敲低)的ADCC的效率強(qiáng)烈降低。

圖9

早期治療異種移植物模型中muMAB 5F2D2的治療作用。

在植入了穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6的HEK293細(xì)胞的小鼠中，muMAB 5F2D2顯示特異和強(qiáng)腫瘤生長抑制。

圖10

早期治療異種移植物模型中muMAB 5F2D2的治療作用。

在Kruskal-Wallis試驗中用muMAB 5F2D2治療后第28天(及其后)腫瘤體積顯著地減小。

圖11

早期治療異種移植物模型中muMAB 5F2D2的治療作用。

用單克隆鼠抗CLDN6抗體muMAB 5F2D2治療的小鼠相對于PBS對照組顯示了延長的存活。

圖12

早期治療異種移植物模型中muMAB 27A的治療作用。

在植入了穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6的HEK293細(xì)胞的小鼠中，muMAB 27A顯示特異和強(qiáng)腫瘤生長抑制。

圖13

早期治療異種移植物模型中muMAB 36A的治療作用。

在植入了穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6的HEK293細(xì)胞的小鼠中，muMAB 36A顯示特異并且強(qiáng)腫瘤生長抑制。

圖14

早期治療異種移植物模型中muMAB 27A和36A的治療作用。

用單克隆鼠抗CLDN6抗體muMAB 27A和36A治療的小鼠顯示了延長的存活。

圖15

在NEC8細(xì)胞中人CLDN3、4、6和9表達(dá)的免疫印跡分析。

睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系NEC8僅顯示了CLDN6的表達(dá)(A)，而分別顯示沒有表達(dá)CLDN3、4或9(B)。

圖16

使用流式細(xì)胞術(shù)分析在NEC8細(xì)胞上的CLDN6表面表達(dá)。

CLDN6在NEC8細(xì)胞上表達(dá)。

圖17

在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的早期治療異種移植物模型中muMAB 5F2D2的治療作用。

與鹽水對照組相比，在植入內(nèi)源性表達(dá)人CLDN6之NEC8細(xì)胞的小鼠中，muMAB 5F2D2顯示出特異和強(qiáng)腫瘤生長抑制。

圖18

在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的早期治療異種移植物模型中muMAB 5F2D2的治療作用。

Kruskal-Wallis試驗顯示在用muMAB 5F2D2治療后第21和42天腫瘤體積減小。

具體實施方式

實施例

本文中描述或以本身已知的和例如在Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.中所描述的方式實施本文中使用的技術(shù)和方法。除非具體指明，根據(jù)制造商的信息實施所有方法(包括試劑盒和試劑的使用)。

實施例1：材料和方法

A.生成抗CLDN6的鼠抗體

a.生成編碼全長CLDN6和CLDN6片段的表達(dá)載體

通過化學(xué)合成(GENEART AG，Germany)制備編碼全長CLDN6(SEQ ID NO：2)的非天然的、密碼子優(yōu)化的DNA序列(SEQ ID NO：10)并將其克隆到pcDNA3.1/myc-His載體(Invitrogen，USA)中以產(chǎn)生載體p3953。插入終止密碼子使得CLDN6蛋白的表達(dá)不與載體所編碼的myc-Hjs標(biāo)簽融合。使用市售的抗CLDN6抗體(ARP，01-8865；R&D Systems，MAB3656)，通過Western印跡、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析測試CLDN6的表達(dá)。

此外，制備密碼子優(yōu)化的DNA序列(SEQ ID NO：11)并將其克隆到pcDNA3.1/myc-His載體中以產(chǎn)生載體p3974，所述DNA序列編碼與源自N-末端Ig κ前導(dǎo)序列的信號肽融合的CLDN6(SEQ ID NO：5)的推定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域2(extracellular domain 2，EC2)片段，其后面有4個額外的氨基酸以確保正確的信號肽切割位點(SEQ ID NO：12)。免疫之前，使用市售的抗myc抗體(Cell Signaling，MAB 2276)，通過免疫熒光顯微術(shù)在瞬時轉(zhuǎn)染的且多聚甲醛(PFA)固定的CHO-K1細(xì)胞中確證EC2片段的表達(dá)。

b.生成穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的細(xì)胞系

使用載體p3953，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的HEK293和P3X63Ag8U.1細(xì)胞系。

c.免疫接種

MuMAB 5F2D2：通過在第0、16和36天腹膜內(nèi)注射，用25μg p3974質(zhì)粒DNA以及4μl PEI-甘露糖(PEI-Man；in vivo-jetPEI^TM-Man，來自PolyPlus Transfection)(含有5％葡萄糖的H₂O中的150mM PEI-Man)一起免疫接種Balb/c小鼠。在第48和62天時，通過腹膜內(nèi)注射2×10⁷個轉(zhuǎn)染了p3953載體以穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞免疫接種小鼠。在注射之前，以3000拉德(rad)輻照第62天所施用的細(xì)胞。

MuMAB 27A：在第0和13天時，通過腹膜內(nèi)注射2×10⁷個轉(zhuǎn)染了p3953載體以穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞免疫接種Balb/c小鼠。在第21天，通過腹膜內(nèi)注射2×10⁷個以p3953載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞加強(qiáng)具有腫瘤的小鼠。3天后，處死小鼠并制備脾細(xì)胞。通過靜脈注射，將5×10⁷個脾細(xì)胞移植至另一只Balb/c小鼠中。在第35、49、67和104天，通過腹腔內(nèi)注射2×10⁷個以p3953載體以及經(jīng)HPLC純化的硫代磷酸酯修飾的CpG寡脫氧核苷酸(PTO-CpG-ODN)(50μg；5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT；Eurofins MWG Operon，Germany)一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞免疫接種移植的小鼠。施用前，細(xì)胞用絲裂霉素C(5μg/ml，Sigma-Aldrich，M4287)處理。

MuMAB 36A：通過在第0、16和36天腹膜內(nèi)注射，用25μg p3974質(zhì)粒DNA以及4μl PEI-甘露糖(PEI-Man；in vivo-jetPEI^TM-Man，來自PolyPlus Transfection)(含有5％葡萄糖的H₂O中的150mM PEI-Man)一起免疫接種C57BL/6小鼠。在第55、69和85天，通過腹膜內(nèi)注射2×10⁷轉(zhuǎn)染了p3953載體以穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞免疫接種小鼠。在第85天，與經(jīng)HPLC純化的PTO-CpG-ODN(PBS中的50μg；5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT；Eurofins MWG Operon，Germany)一起施用細(xì)胞。

通過使用以編碼CLDN6的核酸和GFP共轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞的免疫熒光顯微鏡術(shù)監(jiān)測小鼠血清中抗CLDN6的抗體的存在。為此，轉(zhuǎn)染后24小時，PFA固定的或非固定的細(xì)胞與來自免疫的小鼠的1∶100稀釋的血清在室溫(RT)下孵育45分鐘。清洗細(xì)胞，與Alexa555標(biāo)記的抗鼠Ig抗體(Molecular Probes)孵育，并進(jìn)行熒光顯微鏡分析。

為生成單抗，在進(jìn)行脾切除術(shù)之前4天，通過腹膜內(nèi)注射2×10⁷個以p3953載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞加強(qiáng)具有可檢出的抗CLDN6免疫應(yīng)答的小鼠。

d.生成產(chǎn)生抗CLDN6鼠單克隆抗體的雜交瘤

使用PEG 1500(Roche，CRL 10783641001)，將從經(jīng)免疫小鼠中分離的6×10⁷個脾細(xì)胞與3×10⁷個小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8.653(ATCC，CRL 1580)融合。在平底微量滴定板中以約5×10⁴個細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，在含有10％經(jīng)熱滅活的胎牛血清、1％雜交瘤融合和克隆添加劑(hybridoma fusion and cloning supplement，HFCS，Roche，CRL 11363735)、10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、4.5％葡萄糖、0.1mM 2-巰基乙醇、1×青霉素/鏈霉素以及1×HAT添加劑(Invitrogen，CRL 21060)的PRMI選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。10至14天之后，通過流式細(xì)胞術(shù)篩選每個孔的抗CLDN6單克隆抗體。通過有限稀釋對分泌抗體的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并再次測試抗CLDN6的單克隆抗體。培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中生成少量用于表征的抗體。從來自保持母體細(xì)胞之反應(yīng)性(通過流式細(xì)胞術(shù)測試)的每個雜交瘤中選擇至少一個克隆。為每個克隆生成9小瓶細(xì)胞的庫并將其儲存于液氮中。

B.流式細(xì)胞術(shù)

為測試單克隆抗體與CLDN6及其他密蛋白的結(jié)合，用相應(yīng)的編碼密蛋白的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)。為了區(qū)分轉(zhuǎn)染的和非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用熒光標(biāo)記物作為報道基因共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時之后，用0.05％胰蛋白酶/EDTA收獲細(xì)胞，用FACS緩沖液(含有2％FCS和0.1％疊氮化鈉的PBS)清洗，以2×10⁶個細(xì)胞/ml的濃度懸于FACS緩沖液中。在4℃下，將100μl細(xì)胞懸液與指定濃度的合適抗體一起孵育30分鐘。市售的小鼠抗密蛋白抗體抗CLDN6(R&D，CRL MAB3656)、抗CLDN3(R&D，MAB4620)和抗CLDN4(R&D，MAB4219)充當(dāng)陽性對照，而小鼠IgG2b(Sigma，CRL M8894)充當(dāng)同種型對照。用FACS緩沖液清洗細(xì)胞三次，并將其與別藻藍(lán)蛋白(APC)綴合的抗小鼠IgG1+2a+2b+3a特異性的二抗(Dianova，CRL 115-135-164)一起孵育30分鐘。清洗細(xì)胞兩次，重懸于FACS緩沖液中。使用BD FACSArray通過流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合。以熒光標(biāo)志物的表達(dá)為橫軸，相對于縱軸上的抗體結(jié)合進(jìn)行作圖。

單克隆抗體與內(nèi)源性表達(dá)CLDN6的細(xì)胞系的結(jié)合以類似的方式進(jìn)行分析。

C.免疫印跡分析

通過免疫印跡對于CLDN6、3、4和9的表達(dá)分析NEC8細(xì)胞。瞬時轉(zhuǎn)染了CLDN6、3、4、9的HEK293T細(xì)胞作為陽性對照并且瞬時轉(zhuǎn)染了模擬質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞作為陰性對照。在Laemmli緩沖液中收集細(xì)胞，裂解并進(jìn)行SDS-PAGE。將凝膠進(jìn)行印跡并且分別用抗-CLDN3(Invitrogen，34-1700)、抗-CLDN4(Invitrogen，32-9400)、抗-CDLN6(ARP，01-8865)或抗-CLDN9(Santa Cruz，sc-17672)抗體染色。用過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育之后，印跡用ECL試劑顯色并且使用LAS-3000顯像儀(Fuji)進(jìn)行可視化。

D.CDC分析

向與抗CLDN6抗體一起孵育的靶細(xì)胞中添加人補(bǔ)體之后，通過測量未裂解細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)ATP的含量測定補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒作用(CDC)。作為非常靈敏的分析方法，使用螢光素酶的生物發(fā)光反應(yīng)測量ATP。

用0.05％胰蛋白酶/EDTA收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CLDN6的CHO-K1細(xì)胞(CHO-K1-CLDN6)，用X-Vivo 15培養(yǎng)基(Lonza，BE04-418Q)清洗兩次，以1×10⁷個細(xì)胞/ml的濃度懸于X-Vivo 15培養(yǎng)基中。將250μl的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到0.4cm電穿孔杯(electroporation cuvette)中并將其與7μg體外轉(zhuǎn)錄的編碼螢光素酶的RNA(螢光素酶IVT RNA)混合。使用GenePulser Xcell(Bio Rad)以200V和300μF電穿孔細(xì)胞。電穿孔之后，將細(xì)胞懸于2.4ml預(yù)熱的含有10％(v/v)FCS、1％(v/v)青霉素/鏈霉素和1.5mg/ml G418的具有GlutaMaX-I的D-MEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(Invitrogen，31331-093)中。將50μl/孔細(xì)胞懸液接種進(jìn)入白色96孔PP板中，在37℃和7.5％CO₂下孵育。電穿孔之后24小時，以指定濃度向細(xì)胞中添加50μl60％RPMI(含有20mM HEPES)和40％人血清(獲自6位健康供體的混合血清)中的單克隆鼠抗CLDN6抗體。向總裂解對照中添加每孔10μl PBS中的8％(v/v)Triton X-100，而向最大活細(xì)胞對照和向?qū)嶋H樣品中添加每孔10μl的PBS。在37℃和7.5％CO₂下孵育80分鐘之后，每孔添加50μl熒光素混合物(ddH₂O中的3.84mg/ml D-熒光素、0.64U/ml ATP酶和160mM HEPES)。在RT下，將板在黑暗中孵育45分鐘。使用發(fā)光計(Infinite M200，TECAN)測量生物發(fā)光。以積分?jǐn)?shù)字相對光單位(relative light unit，RLU)給出結(jié)果。

按以下計算比裂解(specific lysis)：

最大活細(xì)胞：10μl PBS，沒有抗體

總裂解：10μl PBS中的8％(v/v)Triton X-100，沒有抗體

E.ADCC分析

在基于螢光素酶的測定系統(tǒng)中對于其能夠誘導(dǎo)對內(nèi)源性表達(dá)CLDN6之NEC8細(xì)胞和具有CLDN6敲低的NEC8細(xì)胞(NEC8 LVTS2 54)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)進(jìn)行嵌合化單克隆抗CLDN6抗體分析。

用0.05％胰蛋白酶/EDTA收獲NEC8或NEC8 LVTS2 54靶細(xì)胞，用X-Vivo 15培養(yǎng)基清洗兩次，然后使用Gene Pulser Xcell(Bio Rad)用7μg螢光素酶IVT RNA(200V，400μF)電穿孔2.5×10⁶個細(xì)胞。電穿孔之后，將細(xì)胞懸于2.4ml預(yù)熱的含有10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中。將50μl/孔細(xì)胞懸液(5×10⁴個細(xì)胞)接種進(jìn)入白色96孔PP板中，在37℃和5％CO₂下孵育6小時。使用Ficoll(Ficoll-Paque TM Plus，GE Healthcare，17-1440-03)從健康供體血液樣品中富集人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC懸浮于含有5％熱滅活人血清的X-Vivo 15(Lonza，BE04-418Q)中，在37℃和5％CO₂下孵育。孵育2～4小時之后，在自然殺傷(NK)細(xì)胞中富集上清液。以指定濃度向NEC8細(xì)胞中添加25μl在PBS中稀釋的抗體。以20∶1的比率(效應(yīng)細(xì)胞比靶細(xì)胞)添加富集的NK細(xì)胞，并且將樣品在37℃和5％CO₂下孵育24小時。如在“CDC”中描述的，通過測量具有螢光素酶的細(xì)胞內(nèi)ATP的含量來測量細(xì)胞裂解。

F.早期治療測定

對于早期抗體治療，將200μl PBS中的5×10⁶個HEK293-CLDN6細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的HEK293細(xì)胞)皮下接種進(jìn)入無胸腺的Nude-Foxnl^nu小鼠的脅部。HEK293-模擬細(xì)胞用作陰性對照。每個實驗組由8只6～8周齡的雌性小鼠組成。(在分別植入HEK293-CLDN6細(xì)胞或HEK293-模擬細(xì)胞的小鼠的情況下，鹽水對照組由10只小鼠組成。)接種之后3天，每周兩次交替靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射應(yīng)用200μg純化的鼠單克隆抗體muMAB 5F2D2、27A和36A 46天。以PBS治療的實驗組充當(dāng)陰性對照。每兩周監(jiān)測一次腫瘤體積(TV＝(長度×寬度²)/2)。以mm³表示TV，允許構(gòu)建隨時間的腫瘤生長曲線。當(dāng)腫瘤達(dá)到大于1500mm³的體積時，殺死小鼠。

實施例2：根據(jù)本發(fā)明所獲得的抗體與密蛋白的結(jié)合

使用瞬時表達(dá)相應(yīng)的人密蛋白的HEK293T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析鼠單克隆抗體muMAB 5F2D2、27A和36A與人CLDN6、3、4和9的結(jié)合。與熒光標(biāo)志物共轉(zhuǎn)染HEK293T以區(qū)分未轉(zhuǎn)染的(Q3群)和轉(zhuǎn)染的(Q4群)細(xì)胞。所使用的抗體濃度是飽和結(jié)合CLDN6的濃度(25μg/ml)。用抗人密蛋白-6(R&D Systems，MAB3656)、人密蛋白-3(R&D Systems，MAB4620)和人密蛋白-4(R&D Systems，MAB 4219)的市售單克隆抗體確證人CLDN6、3、4和9的表達(dá)。

muMAB 5F2D2、27A和36A抗體顯示與表達(dá)CLDN6的細(xì)胞強(qiáng)結(jié)合，而他們不與表達(dá)CLDN3或CLDN4的細(xì)胞相結(jié)合，參見圖1。

muMAB 5F2D2、27A和36A抗體在不同濃度(0.01、0.1、1、10、100、1000、10000和25000ng/ml)下與瞬時表達(dá)人CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的HEK293T細(xì)胞孵育。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)合；參見圖2、3和4。y軸表示通過抗體結(jié)合的細(xì)胞的百分比(Q2群)，而x軸表示所使用的抗體的濃度。

muMAB 5F2D2顯示與人CLDN6的強(qiáng)結(jié)合和與人CLDN9的弱結(jié)合。muMAB 27A顯示與人CLDN6的強(qiáng)結(jié)合和與人CLDN9的弱結(jié)合。muMAB 36A顯示與人CLDN6的強(qiáng)結(jié)合和幾乎不與人CLDN9結(jié)合。沒有抗體與CLDN3或4相互作用。

為測定相對親和力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6抗體與HEK293細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)的人CLDN6的結(jié)合。在飽和結(jié)合實驗中，將抗體的濃度相對于FACS信號(熒光強(qiáng)度的中位值)作圖；參見圖5。通過非線性回歸計算EC50(在平衡時與一半的結(jié)合位點結(jié)合的抗體濃度)。結(jié)果顯示抗體具有特有的結(jié)合方式。muMAB 5F2D2和27A表現(xiàn)出非常低的EC50值(EC50 350～450ng/ml)，并且在低濃度達(dá)到飽和結(jié)合，而muMAB 36A沒有顯示飽和結(jié)合，甚至在最高濃度下也是如此。

實施例3：根據(jù)本發(fā)明所獲得的抗體的效應(yīng)子功能

使用檢測未裂解細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的螢光素酶依賴的測定分析抗CLDN6抗體的CDC活性。為此，用不同濃度的muMAB 5F2D2、27A或36A或者作為內(nèi)部對照(internal control)的抗CLDN6(R&D Systems，MAB3656)處理穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6的CHO-K1細(xì)胞。

muMAB 5F2D2以劑量依賴的方式表現(xiàn)出CDC活性；參見圖6。muMAB 27A表現(xiàn)劑量依賴性CDC活性，而muMAB 36A不能體外誘導(dǎo)CDC；參見圖7。

測定嵌合抗CLDN6抗體chimAB 5F2D2誘導(dǎo)對內(nèi)源性表達(dá)CLDN6之NEC8和NEC8LVTS2 54(CLDN6敲低)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的能力；參見圖8。嵌合抗CLDN6抗體chimAB 5F2D2和陽性對照赫塞汀(Herceptin)以劑量依賴的方式誘導(dǎo)對具有兩個不同供體之效應(yīng)細(xì)胞的NEC8細(xì)胞的ADCC。與NEC8親本細(xì)胞相比，誘導(dǎo)對NEC8 LVTS2 54細(xì)胞(CLDN6敲低)的ADCC的效率隨chimAB 5F2D2劇烈減少，證明chimAB 5F2D2的靶標(biāo)特異性。

實施例4：根據(jù)本發(fā)明所獲得的抗體的治療效果

在早期治療異種移植物模型中測試muMAB 5F2D2的治療效果，其中將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293-CLDN6和HEK293-模擬異種移植物植入無胸腺的Nude-Foxnl^nu小鼠中。

muMAB 5F2D2在植入穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6的HEK293細(xì)胞之小鼠中顯示特異和強(qiáng)腫瘤生長抑制；參見圖9。muMAB 5F2D2對植入模擬對照細(xì)胞的小鼠中的腫瘤生長沒有影響。分開的小鼠鹽水對照組以應(yīng)用抗體等同的注射體積接受作為媒介物的PBS。

另外，在用muMAB 5F2D2治療之后的第28天(及其后)，Kruskal-Wallis測試顯示腫瘤體積顯著減??；參見圖10。此外，用單克隆鼠抗CLDN6抗體muMAB 5F2D2治療的小鼠與PBS對照組相比顯示延長的存活。在植入HEK293-模擬細(xì)胞的小鼠(作為對照組)中沒有觀察到抗體依賴性效果；參見圖11。

類似地，在早期治療異種移植物模型中，muMAB 27A和muMAB 36A的測試在植入穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6的HEK293細(xì)胞之小鼠中顯示特異和強(qiáng)腫瘤生長抑制；參見圖12和13。此外，muMAB 27A和36A在延長植入的小鼠的存活中是有效的；參見圖14。

實施例5：在生殖細(xì)胞腫瘤中CLDN6作為癌癥靶標(biāo)

在NEC8細(xì)胞中通過免疫印跡分析測試CLDN3、4、6和9表達(dá)。睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系NEC8僅顯示了CLDN6的表達(dá)(A)，但是沒有顯示分別表達(dá)CLDN3、4或9(B)；參見圖15。使用瞬時轉(zhuǎn)染了編碼對應(yīng)人密蛋白的表達(dá)載體的HEK293細(xì)胞通過Western印跡測試所使用的抗CLDN3、4或9抗體的特異性。

使用流式細(xì)胞術(shù)分析NEC8細(xì)胞上的CLDN6表面表達(dá)。市售抗CLDN6抗體(R&D Systems，MAB3656)檢測NEC8細(xì)胞上CLDN6的表達(dá)；參見圖16。將鼠IgG2b(Sigma，CRL M8894)用作同種型對照。

在早期治療異種移植模型中使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8的小鼠測試muMAB 5F2D2的治療效果。與鹽水對照組相比，muMAB 5F2D2在植入內(nèi)源性表達(dá)人CLDN6之NEC8細(xì)胞的小鼠中顯示出特異和強(qiáng)腫瘤生長抑制；參見圖17。在用muMAB 5F2D2治療后的第21和42天，Kruskal-Wallis測試顯示腫瘤體積減?。粎⒁妶D18。

保藏微生物或其他生物材料的證明

表PcT/Ro/134(1998年7月；2004年1月重印)

生物材料的附加頁

另外保藏物的識別

1)保藏機(jī)構(gòu)的名稱和地址：

DSMZ-德國微生物菌種和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心

Inhoffenstr.7B

38124 Brauschweig

DE

針對上述保藏物的額外指示：

-小鼠(Mus musculus)骨髓瘤P3X63Ag8.653與小鼠(Mus musculus)脾細(xì)胞融合

-分泌抗人CLDN6抗體的雜交瘤

2)保藏人：

所有上述保藏物均由以下單位制備：

加尼梅德藥物公司

Freiligrathstrasse 12

55131 Mainz

DE

以下部分對應(yīng)于母案申請中的權(quán)利要求書：

1.體內(nèi)抑制腫瘤生長的抗體，其中所述腫瘤的細(xì)胞表達(dá)密蛋白6(CLDN6)，并且其中所述抗體能夠與CLDN6相結(jié)合。

2.項1的抗體，其中所述抗體通過結(jié)合CLDN6來抑制所述腫瘤的生長。

3.項1或2的抗體，其中所述抗體是CLDN6特異性的。

4.項1至3中任一項的抗體，其中所述抗體是單克隆、嵌合、人或人源化抗體、或者是抗體片段或合成抗體。

5.項1至4中任一項的抗體，其中所述腫瘤選自：卵巢癌癥，特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺部癌癥，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌；胃部癌癥；乳癌；肝部癌癥；胰腺癌癥；皮膚癌癥，特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌；惡性黑色素瘤；頭頸部癌癥，特別是惡性多形性腺瘤；肉瘤，特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤；膽管癌癥；膀胱癌癥，特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌；腎部癌癥，特別是腎細(xì)胞癌，包括透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌；結(jié)腸癌癥；小腸癌癥，包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌；睪丸胚胎癌；胎盤絨毛膜癌；子宮頸癌癥；睪丸癌癥，特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎睪丸癌癥；子宮癌癥；生殖細(xì)胞腫瘤，特別是畸胎癌或胚胎癌，優(yōu)選地睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤；及其轉(zhuǎn)移形式。

6.抗體，其選自以下：

(i)由以如下登錄號保藏的克隆產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體：DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)、DSM ACC3058(GT512muMAB 27A)或DSM ACC3057(GT512muMAB 5F2D2)，

(ii)(i)中所述抗體的嵌合化或人源化形式的抗體，

(iii)具有(i)中所述抗體的特異性的抗體，和

(iv)包含(i)中所述抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點的抗體，

其中，(i)中所述抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點優(yōu)選地包含(i)中所述抗體的可變區(qū)。

7.項1至6中任一項的抗體，其與至少一個治療效應(yīng)子部分相連接，其中所述治療效應(yīng)子部分優(yōu)選地是放射性標(biāo)記、細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性酶。

8.能夠產(chǎn)生項1至7中任一項的抗體的雜交瘤。

9.雜交瘤，其以登錄號DSM ACC3059(GT512muMAB 36A)，DSMACC3058(GT512muMAB 27A)或DSM ACC3057(GT512muMAB 5F2D2)保藏。

10.包含項1至7中任一項的抗體的藥物組合物，其中所述藥物組合物優(yōu)選地為治療性或預(yù)防性腫瘤疫苗的形式。

11.項10的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防腫瘤疾病。

12.治療患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發(fā)生風(fēng)險之患者的方法，其中所述腫瘤的細(xì)胞表達(dá)密蛋白6(CLDN6)，并且其中所述方法包括施用能夠結(jié)合CLDN6的抗體。

13.項12的方法，其中所述抗體在施用至所述患者時通過結(jié)合CLDN6來抑制所述患者中所述腫瘤的生長。

14.項12或13的方法，其中所述抗體連接至少一個治療效應(yīng)子部分，其中所述治療效應(yīng)子部分優(yōu)選地是放射性標(biāo)記、細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性酶。

15.項12至14中任一項的方法，其中所述抗體是CLDN6特異性的。

16.項12至15中任一項的方法，其中所述抗體是單克隆、嵌合、人或人源化抗體、或者是抗體片段或合成抗體。

17.項12至16中任一項的方法，其中所述方法包括施用項10或11的藥物組合物。

18.項11的藥物組合物或項12至17中任一項的方法，其中所述腫瘤疾病選自：卵巢癌癥，特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺部癌癥，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌；胃部癌癥；乳癌；肝部癌癥；胰腺癌癥；皮膚癌癥，特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌；惡性黑色素瘤；頭頸部癌癥，特別是惡性多形性腺瘤；肉瘤，特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤；膽管癌癥；膀胱癌癥，特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌；腎部癌癥，特別是腎細(xì)胞癌，包括透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌；結(jié)腸癌癥；小腸癌癥，包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌；睪丸胚胎癌；胎盤絨毛膜癌；子宮頸癌癥；睪丸癌癥，特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎睪丸癌癥；子宮癌癥；生殖細(xì)胞腫瘤疾病，特別是畸胎癌或胚胎癌，優(yōu)選地睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤疾病；及其轉(zhuǎn)移形式。

19.項1至7中任一項的抗體、項10、11和18中任一項的藥物組合物或項12至18中任一項的方法，其中CLDN6包含由包含序列表SEQ IDNO：1之核酸序列或所述核酸序列之變體的核酸所編碼的氨基酸序列。

20.項1至7和19中任一項的抗體、項10、11、18和19中任一項的藥物組合物或項12至19中任一項的方法，其中CLDN6包含序列表SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體。