本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種沙門氏菌鞭毛融合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙門氏菌病的病原體，屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。己發(fā)現(xiàn)1800種以上。沙門氏菌不但引起禽類感染，也會(huì)引起人的細(xì)菌性感染，進(jìn)而導(dǎo)致食物中毒、急性腸胃炎等疾病，被國際獸醫(yī)局列為B類疾病。目前歐盟、美、英、法、日等對(duì)肉、蛋、奶類畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌的規(guī)定均為不得檢出。但就目前現(xiàn)狀而言，國內(nèi)大多畜禽場采用藥物控制和淘汰清除措施來消滅沙門氏菌，飼料中抗生素的使用和抗生素治療存在諸多弊端，多次反復(fù)用藥不僅使成本上升，而且?guī)砹瞬≡退幮院退幬餁埩舻纫幌盗袉栴}。盡管疫苗接種是一種較好的方法，遺憾的是目前仍沒有能夠有效控制雞白痢沙門氏菌的活疫苗，而滅活疫苗所產(chǎn)生的保護(hù)水平較低，多不能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力以抵抗野毒株的感染。減毒活疫苗在國內(nèi)外研究使用中發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生較高免疫水平，但疫苗的接種使用過程繁瑣，價(jià)格也比較昂貴，安全評(píng)價(jià)方法帶有一定缺陷性，動(dòng)物機(jī)體排菌周期也比較長。

目前，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，各種基因工程疫苗研究發(fā)展異?；钴S，植物作為生物制品的反應(yīng)器，其具有成本廉價(jià)、保存運(yùn)輸方便、安全等諸多優(yōu)點(diǎn)。沙門氏菌抗原易變異的特性帶來的現(xiàn)地流行毒株與疫苗株不匹配的問題日益突出，因此，迫切需要開發(fā)一種可以產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用的沙門氏菌“通用疫苗”。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可以在馬鈴薯植物中表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白。

本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述沙門氏菌鞭毛融合蛋白的基因。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述沙門氏菌鞭毛融合蛋白的基因工程方法。

本發(fā)明的另一目的提供上述沙門氏菌鞭毛融合蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明選取選取鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白基因(FliC)1521bp(基因序列來源NCBI genebank Sequence ID:AL513382.1 CDS 1013788..1015308gene＝"fliC")，以及霍亂腸毒素B亞基基因(CTB)375bp(基因序列來源NCBI genebank Sequence Vibrio cholerae strain I-1300 cholera toxin B subunit(ctxB)gene complete cds(Sequence ID：HM366179.1))，通過密碼子偏好文庫將上述兩個(gè)基因中密碼子根據(jù)http://www.kazusa.or.jp/codon/中codon usage database Solanum tuberosum改造成馬鈴薯偏好的密碼子。將上述兩個(gè)基因進(jìn)行拼接，并對(duì)其酶切位點(diǎn)用Mapdraw進(jìn)行分析，最后在融合好的FliC和CTB基因序列前加Kozak序列，后面加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留肽，兩端加所需酶切位，上游Ndel、Sal1，下游Sac1，設(shè)計(jì)完成后通過TAKARA公司人工合成該序列并將其插入到克隆載體中獲得含沙門氏菌鞭毛融合蛋白基因的重組載體T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB，并進(jìn)一步通過雙酶切人工構(gòu)建獲得可以在馬鈴薯植物中表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白的植物表達(dá)載體pRI-101-AN-fliC-CTB。

本發(fā)明提供了一種沙門氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

其中，該酶基因編碼635個(gè)氨基酸。

本發(fā)明提供了編碼上述蛋白的沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB。具體地，該基因全長1932bp，其基因組序列如SEQ ID NO.2所示：

其中該編碼基因的開發(fā)閱讀框(ORF)長1908bp，具體如SEQ ID NO.3所示：

本發(fā)明還提供了包含上述沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB的重組植物表達(dá)載體，優(yōu)選為pRI 101-AN-fliC-CTB。將本發(fā)明的沙門氏菌鞭毛蛋白基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的沙門氏菌鞭毛蛋白基因插入到載體T-Vector pMD19(simple)上的Ndel和Sac1限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)載體T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB。并進(jìn)一步通過雙酶切人工構(gòu)建獲得可以在馬鈴薯植物中表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白的植物表達(dá)載體pRI-101-AN-fliC-CTB。

本發(fā)明還提供了包含上述沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB的重組馬鈴薯植株。具體為將包含上述沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB重組載體轉(zhuǎn)染到普通馬鈴薯植株上，獲得可表達(dá)沙門氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的馬鈴薯植株。

本發(fā)明還提供了一種制備沙門氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的方法，包括以下步驟：

1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組沙門氏菌鞭毛融合蛋白表達(dá)；

3)回收并純化所表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB。

其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌，優(yōu)選將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到重組菌株DH5α/fliC-CTB。

本發(fā)明還提供了上述沙門氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的應(yīng)用。優(yōu)選地，提供上述沙門氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，進(jìn)一步優(yōu)選在沙門氏菌植物口服疫苗中的應(yīng)用。

現(xiàn)在畜禽養(yǎng)殖國家提倡無公害可持續(xù)發(fā)展的路線。而目前大量和超量用藥，導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)。超范圍使用人藥來治療畜禽場的細(xì)菌病，會(huì)畜禽場中很快出現(xiàn)耐藥的菌株。這些耐藥菌株的出現(xiàn)不但對(duì)畜禽業(yè)來說是威脅，而且對(duì)人的食品安全也是威脅。由于細(xì)菌的一些耐藥因子(質(zhì)粒)能夠在相同菌種或不同菌種間傳遞，所以畜禽中出現(xiàn)的耐藥菌株也具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義。并且藥物殘留本身對(duì)人來說就存在很大的危害。疫苗的使用，無疑是解決藥物濫用的一個(gè)有效途徑，而植物口服疫苗作為新型疫苗更應(yīng)該值得研究和推廣。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，植物已成為基因重組生物制品的重要表達(dá)載體。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗是目前新興的研究領(lǐng)域，尤其將馬鈴薯作為植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗，可直接將生產(chǎn)的馬鈴薯作為飼料添加到飼料中，經(jīng)過畜禽的采食即可通過腸道黏膜免疫系統(tǒng)，使得畜禽或人體獲得免疫原性。由于其獨(dú)特的優(yōu)越性，植物口服疫苗將成為繼滅活疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗后的一種新型疫苗。

本發(fā)明利用沙門氏菌的鞭毛C區(qū)(fliC)亞基，該基因在不同種屬的沙門氏菌中序列高度保守(如腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等)，并有較強(qiáng)的免疫原性，在融合霍亂腸毒素B亞基這個(gè)有效的粘膜免疫佐劑，利用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將沙門氏菌fliC基因與霍亂腸毒素B亞基基因融合轉(zhuǎn)入馬鈴薯，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，并在分子水平上證實(shí)了目的基因的整合、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過對(duì)植物外源融合蛋白檢測，證明融合蛋白具有抗原活性，該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯將會(huì)成為生產(chǎn)沙門氏菌“通用口服疫苗”，為沙門氏菌病防治提供廉價(jià)有效的植物口服疫苗。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的陽性克隆大腸桿菌PCR鑒定；其中，1為Marker III；2為陽性大腸桿菌。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例的陽性農(nóng)桿菌PCR鑒定；其中，1為200bp ladder Marker；2為陽性農(nóng)桿菌。

圖 3為本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)fliC-CTB融合基因植株的PCR檢測(pRI101-fliC-CTB)；其中，1為LD10K Marker；2-4為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR結(jié)果；5為非轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因陽性株融合基因相對(duì)表達(dá)量。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因植物的western blot檢測；其中，1-3為陽性植株；4為陰性植株對(duì)照。

具體實(shí)施方式

試驗(yàn)材料和試劑

1、菌株及載體

T載體pMD19(Simple)及菌株DH5α均為市售。

2、酶類及其它生化試劑

內(nèi)切酶與連接酶均為市售。本申請(qǐng)所使用的試劑均為市售。

說明：以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

實(shí)施例1基因的選取與優(yōu)化

選取鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白基因(FliC)1521bp，以及霍亂腸毒素B亞基基因(CTB)375bp，通過密碼子偏好文庫將上述兩個(gè)基因中密碼子改造成馬鈴薯偏好的密碼子。將分析后的基因用DNA star軟件翻譯成蛋白序列，通過NCBI中的pBLAST進(jìn)行蛋白比對(duì)分析。比對(duì)一致后進(jìn)行基因的拼接構(gòu)建，在融合序列前后分別加了增強(qiáng)和穩(wěn)定序列，并在兩端加了所需的酶切位點(diǎn)。

實(shí)施例2基因的融合與構(gòu)建

將上述兩個(gè)基因進(jìn)行拼接，并對(duì)的酶切位點(diǎn)用Mapdraw進(jìn)行分析。最后在融合好的FliC和CTB基因序列前加Kozak序列，后面加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留肽，兩端加所需酶切位，上游Ndel、Sal1，下游Sac1。將優(yōu)化好的基因送到公司合成，合成基因全長為1932bp。合成序列連接到T載體pMD19(Simple)中，最終合成T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB。融合基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，其ORF長1908bp，堿基序列如SEQ ID NO.3。該基因編碼635個(gè)氨基酸，包含一個(gè)終止密碼子。

實(shí)施例3植物表達(dá)載體構(gòu)建

T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB重組子質(zhì)粒、pRI 101-AN DNA空載體分別用Ndel+Sac1雙酶切，1％瓊脂糖電泳，電壓為3-5v/cm，目的的片段FliC-CTB與pRI 101-AN DNA載體分離后，在紫外燈下用手術(shù)刀片分離切割，用瓊脂糖回收試劑盒回收目的片斷、載體。目的片段與載體按l：l等摩爾比例用T4連接酶連接。16℃連接反應(yīng)l小時(shí)，70℃終止反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，取200μL轉(zhuǎn)化菌液鋪于含有的卡那霉素LB平扳上，用涂布器涂勻，置于37℃培養(yǎng)箱水平培養(yǎng)1小時(shí)，然后將平板倒置培養(yǎng)12小時(shí)。挑取克隆菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和測序鑒定，采用融合基因特異引物進(jìn)行PCR顯示，陽性克隆可擴(kuò)增出一條約1900bp的目的條帶，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。將PCR鑒定的陽性克隆菌落進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與融合序列結(jié)果一致。將鑒定重組成功的菌落進(jìn)行搖菌。

實(shí)施例4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1)取保存于-80℃的LBA4404菌株，用接種環(huán)在含有250μg/mL Rif的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃倒置培養(yǎng)2天左右；

2)挑取單菌落，接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃160rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；

3)取2mL菌液于100mL培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，測OD₆₀₀達(dá)0.5～1.0之間。

4)4℃6000rmp離心20min，棄上清；

5)用5mL預(yù)冷的20mM CaCl₂將菌體懸浮起來；

6)4℃6000rmp離心20min，棄上清；

7)用1mL預(yù)冷的20mM CaCl₂將菌體輕輕懸浮起來；

8)將菌液分裝到1.5mL的離心管中(每管200μL)；

9)液氮處理后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5轉(zhuǎn)化菌株的鑒定

挑取在抗性平板上長出的單菌落，按質(zhì)粒小提的方法提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒，然后對(duì)所提質(zhì)粒再次進(jìn)行PCR鑒定(見圖2)，引物同表達(dá)載體鑒定所用的特異引物，擴(kuò)增到一條約1900bp，與陽性對(duì)照一致的帶，結(jié)果如圖1所示；通過以上鑒定，可以證明已將含目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌當(dāng)中。

實(shí)施例6農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯

1)在超凈工作臺(tái)上取馬鈴薯無菌苗培養(yǎng)2周左右的費(fèi)烏瑞它組培苗，剪取頂部3-4片幼嫩葉片，予預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d；

2)將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸入菌液，輕輕搖動(dòng)使得外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，5min后取出外植體，用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d；

3)無菌水洗滌外植體3次，不含激素的MS液體培養(yǎng)基沖洗2次，無菌濾紙吸干表面水分，將葉片轉(zhuǎn)入M1(預(yù)傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基)和MSJK(篩選培養(yǎng)基)中，16h光照/8h黑夜，25℃/23℃培養(yǎng)，3周后更換培養(yǎng)基；

4)兩到三周后，葉片出現(xiàn)預(yù)傷組織后，轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成芽；

5)3-4周后，待芽長到2～3cm時(shí)，將芽轉(zhuǎn)入含有誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的上生根，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。

實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的鑒定

7.1轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

取抗性植株葉片，以未轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株作對(duì)照，在圖中，分別以融合基因特異引物均擴(kuò)增到一條約1900bp、與陽性對(duì)照一致的帶，結(jié)果如圖3所示；通過以上鑒定，可以初步證明己將目的基因轉(zhuǎn)化到馬鈴薯中。

7.2轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平檢測

提取采用Real-Time PCR的方法，試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司TransStart Green qPCR SuperMix熒光檢測試劑盒。

7.2.1植物RNA提取

取2g陽性株葉片放入研缽中，倒入液氮，研成粉未。收進(jìn)50mL離心管中，加入10mL(5mL/g)65℃預(yù)熱的抽提buffer，振蕩30s。65℃水浴，振蕩2～3min。加入等體積氯仿，振蕩10min，18℃，12000g離心5min。(重復(fù)一次)加入1/4體積的LiCl(10M)，4℃過夜。10000g離心20min。500μL 0.5％SDS溶解沉淀。加入等體積氯仿，再次抽提一次。加入2倍體積無水乙醇，-20℃2h。10000g，離心20min；吹干沉淀10min。DEPC處理水溶解沉淀，-70℃保存。

7.2.2反轉(zhuǎn)錄cDNA

(1)將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和Rnase-Free Water溶解并置于冰上備用。

(2)根據(jù)表1配制反應(yīng)體系，總體積為20μL。

(3)渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

(4)在PCR儀上42℃孵育40min，85℃孵育5min，反應(yīng)結(jié)束。

(5)反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。

表1 cDNA合成的反應(yīng)體系

7.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

(1)qPCR反應(yīng)體系見表2：

表2 PCR反應(yīng)體系

(2)PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序的設(shè)定見表3：

表3 PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序

(3)用法表示相對(duì)定量結(jié)果

以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)公式ΔCt＝[Ct(目標(biāo)基因)]-[Ct(內(nèi)參基因)]、ΔΔCt＝[ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)]-[ΔCt(對(duì)照組)]，2^-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因相對(duì)于正常對(duì)照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異，利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P<0.05為各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果如圖4所示，陰性株未擴(kuò)增出目的基因條帶，隨機(jī)抽取三株陽性株進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，從結(jié)果中看出當(dāng)將陽性株1號(hào)結(jié)果作為參照的話，2號(hào)與3號(hào)陽性株的FliC-CTB融合基因的表達(dá)量分別0.84與0.58。從而說明各個(gè)陽性株之間雖然存在一定的表達(dá)差異，但轉(zhuǎn)入的融合基因在陽性植株中都得到了表達(dá)。

7.3轉(zhuǎn)基因外源蛋白檢測

7.3.1轉(zhuǎn)基因植物蛋白抽提

選擇陽性轉(zhuǎn)化株，取其試管薯塊莖進(jìn)行可溶性蛋白提取。具體操作為：取新鮮馬鈴薯塊莖，用解剖刀切成小薄片放入研缽，加入液氮冷凍后，迅速用研缽磨成粉末。按200μL/100mg的比例加入提取緩沖液(200mmol/L Tris-HCI pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巰基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)，待樣品充分溶解后，于4℃、13000rpm離心20min取上清備用。用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。

7.3.2陽性轉(zhuǎn)化株外源蛋白的檢測

取50μL轉(zhuǎn)基因植物蛋白抽提液加入等體積的樣品緩沖液(20％蔗糖，0.05％溴酚蘭，0.125％mol/L Tris-HCl pH6.8，4％SDS，14mmol/L巰基乙醇)，沸水煮5min，冰水浴2min使冷卻。離心棄沉淀后樣品用于電泳分析。取樣品30.40μL上樣12％SDS-PAGE凝膠。SDS-PAGE用Laemmli的方法進(jìn)行，使用無濃縮膠的2.3％～4％、2％～15％、2％～6％的梯度凝膠，凝膠染色使用考馬斯亮藍(lán)染色。

蛋白印記時(shí)，先用SDS-PAGE將蛋白質(zhì)分離后，轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素(NC)膜。使用含3％明膠(Gelatin)的TBS緩沖液(pH 7.5)將此膜封閉，使用含1％明膠的TBS緩沖液(pH 7.5)稀釋的一抗進(jìn)行反應(yīng)。TBS緩沖液漂洗后，使用含1％明膠的TBS緩沖液(pH 7.5)稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng)。用TBS緩沖液漂洗后，ECL反應(yīng)，暗室膠片曝光，可見一條大約63KDa的特異條帶，而未轉(zhuǎn)基因植株葉片中未見表達(dá)。結(jié)果見圖5。

本發(fā)明未詳細(xì)闡述部分屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)。

最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。盡管參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

<110> 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種沙門氏菌鞭毛融合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 635

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以在馬鈴薯植株中表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白

<400> 1

MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSALGTAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTANIKG 60

LTQASRNAND GISIAQTTEG ALNEINNNLQ RVRELAVQSA NGTNSQSDLD SIQAEITQRL 120

NEIDRVSGQT QFNGVKVLAQ DNTLTIQVGA NDGETIDIDL KEISSKTLGL DKLNVQDAYT 180

PKETAVTVDK TTYKNGTDPI TAQSNTDIQT AIGGGATGVT GADIKFKDGQ YYLDVKGGAS 240

AGVYKATYDE TTKKVNIDTT DKTPLATAEA TAIRGTATIT HNQIAEVTKE GVDTTTVAAQ 300

LAAAGVTGAD KDNTSLVKLS FEDKNGKVID GGYAVKMGDD FYAATYDEKT GAITAKTTTY 360

TDGTGVAQTG AVKFGGANGK SEVVTATDGK TYLASDLDKH NFRTGGELKE VNTDKTENPL 420

QKIDAALAQV DTLRSDLGAV QNRFNSAITN LGNTVNNLSS ARSRIEDSDY ATEVSNMSRA 480

QILQQAGTSV LAQANQVPQN VLSLLRIKLK FGVFFTVLLS SAYAHGTPQN ITDLCAEYHN 540

TQIHTLNDKI FSYTESLAGK REMAIITFKN GATFQVEVPG SQHIDSQKKA IERMKDTLRI 600

AYLTEAKVEK LCVWNNKTPH AIAAISMANS EKDEL 635

<210> 2

<211> 1932

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以在馬鈴薯植株中表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白的編碼基因

<400> 2

catatggtcg acgccaccat ggctcaagtt attaatacta attctctttc tcttcttact 60

caaaataatc ttaataagtc tcaatctgct cttggaactg ctattgaaag actttcttct 120

ggacttagaa ttaattctgc taaggatgat gctgctggac aagctattgc taatagattt 180

actgctaata ttaagggact tactcaagct tctagaaatg ctaatgatgg aatttctatt 240

gctcaaacta ctgaaggtgc tcttaatgaa attaataata atcttcaaag agttagagaa 300

cttgctgttc aatctgctaa tggtactaat tctcaatctg atcttgattc tattcaagct 360

gaaattactc aaagacttaa tgaaattgat agagtttctg gacaaactca atttaatgga 420

gttaaagttc ttgctcaaga taatactctt actattcaag ttggtgctaa tgatggtgaa 480

actattgata ttgatcttaa agaaatttct tctaaaacac ttggacttga taagcttaat 540

gttcaagatg cttacactcc taaagaaact gctgttactg ttgataaaac tacttataaa 600

aatggtacag atcctattac agctcaatct aatactgata ttcaaactgc tattggaggt 660

ggtgctactg gagttactgg agctgatatt aaatttaaag atggtcaata ctatcttgat 720

gttaaaggag gtgcttctgc tggtgtttat aaagctactt atgatgaaac tacaaagaaa 780

gttaatattg atactactga taaaactcct ttggctactg ctgaagctac agctattaga 840

ggaactgcta ctattactca taatcaaatt gctgaagtta caaaagaagg tgttgatact 900

actacagttg ctgctcaact tgctgctgct ggagttactg gagctgataa ggataatact 960

tctcttgtta aactttcttt tgaagataaa aatggtaagg ttattgatgg tggttatgct 1020

gttaaaatgg gagatgattt ttatgctgct acttatgatg aaaaaacagg tgctattact 1080

gctaaaacta ctacttatac agatggtact ggagttgctc aaactggagc tgttaaattt 1140

ggtggagcta atggtaaatc tgaagttgtt actgctactg atggtaagac ttaccttgct 1200

tctgatcttg ataaacataa ttttagaaca ggaggtgaac ttaaagaagt taatacagat 1260

aagactgaaa atccacttca aaaaattgat gctgctttgg ctcaagttga tacacttaga 1320

tctgatcttg gtgctgttca aaatagattt aattctgcta ttactaatct tggaaatact 1380

gttaataatc tttcttctgc tagatctaga attgaagatt ctgattacgc tactgaagtt 1440

tctaatatgt ctagggctca aattcttcaa caagctggta cttctgttct tgctcaagct 1500

aatcaagttc ctcaaaatgt tctttctctt cttagaatta aattaaaatt tggtgttttt 1560

tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac ctcaaaatat tactgatttg 1620

tgtgcagaat accacaacac acaaatacat acgctaaatg ataagatatt ttcgtataca 1680

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aaggataccc tgaggattgc atatcttact gaagctaaag tcgaaaagtt atgtgtatgg 1860

aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg caaatagtga aaaggatgaa 1920

ctttaagagc tc 1932

<210> 3

<211> 1908

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以在馬鈴薯植株中表達(dá)的沙門氏菌鞭毛融合蛋白的編碼基因的ORF

<400> 3

atggctcaag ttattaatac taattctctt tctcttctta ctcaaaataa tcttaataag 60

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