本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及可活化的嵌合受體，其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用日益受到重視?；诿庖咝?yīng)細(xì)胞的過繼性免疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方法可以克服抗體治療的上述缺陷，但在大多數(shù)腫瘤的療效仍不能令人滿意[GruppSA，etal.Adoptivecellulartherapy.CurrTopMicrobiolImmunol.，2011；344:149-72.]。近年來，根據(jù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別特異性依賴于T淋巴細(xì)胞受體(TCellReceptor，TCR)的發(fā)現(xiàn)，將針對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的抗體的scFv與T淋巴細(xì)胞受體的CD3ζ或FcεRIγ等胞內(nèi)信號(hào)激活基序融合成嵌合抗原受體(Chimericantigenreceptor，CAR；現(xiàn)也稱為嵌合受體(Chimericreceptor，CR))，并將其通過如慢病毒感染等方式基因修飾在T淋巴細(xì)胞表面。這種CART淋巴細(xì)胞能夠以主要組織兼容性復(fù)合物(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)非限制性方式選擇性地將T淋巴細(xì)胞定向到腫瘤細(xì)胞并特異性地殺傷腫瘤。CART淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一個(gè)新的免疫治療策略[SchmitzM，etal.Chimericantigenreceptor-engineeredTcellsforimmunotherapyofCancer.JBiomedBiotechnol，2010，doi:10.1155/2010/956304.]。此外，CAR修飾的NK細(xì)胞(KlingemannH.Challengesofcancertherapywithnaturalkillercells.Cytotherapy.2014Dec18.pii：S1465-3249(14)00791-9)或者NKT細(xì)胞也在臨床前研究中展示了良好的抗腫瘤活性(HeczeyA1，LiuD1，TianG2，CourtneyAN1，WeiJ1，MarinovaE1，GaoX1，GuoL1，YvonE3，HicksJ2，LiuH4，DottiG5，MetelitsaLS6.InvariantNKTcellswithchimericantigenreceptorprovideanovelplatformforsafeandeffectivecancerimmunotherapy.Blood. 2014；124(18):2824-33)。嵌合抗原受體包括胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。通常胞外區(qū)包含能夠識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的scFv，跨膜區(qū)采用CD8，CD28等分子的跨膜區(qū)，胞內(nèi)信號(hào)區(qū)采用免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信號(hào)分子CD28、CD27、CD137、CD134等的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)僅包含ITAM的為第一代CART淋巴細(xì)胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-ITAM。該種CART可以激發(fā)抗腫瘤的細(xì)胞毒性效應(yīng)，但是細(xì)胞因子分泌比較少，并且在體內(nèi)不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應(yīng)[ZhangT.etal.ChimericNKG2D-modifiedTcellsinhibitsystemicT-celllymphomagrowthinamannerinvolvingmultiplecytokinesandcytotoxicpathways，CanRes2007，67(22)：11029-11036.]。隨后發(fā)展的第二代CART淋巴細(xì)胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)發(fā)生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴細(xì)胞的持續(xù)增殖，并能夠提高T淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子的水平，同時(shí)提高CART在體內(nèi)的存活周期和抗腫瘤效果[DottiG.etal.CD28costimulationimprovesexpansionandpersistenceofchimericantigenreceptormodifiedTcellsinlymphomapatients.JClinInvest，2011，121(5)：1822-1826.]。近些年發(fā)展的第三代CART淋巴細(xì)胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，進(jìn)一步提高了CART在體內(nèi)的存活周期和其抗腫瘤效果[CarpenitoC.，etal.ControloflargeestablishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumanTcellscontainingCD28andCD137domains.PNAS，2009，106(9)：3360–3365.]。盡管CART淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫治療中具有誘人的前景，但其較高風(fēng)險(xiǎn)亦需要考慮。比如，由于某些/種正常組織低表達(dá)CAR所能識(shí)別的特異性抗原可能造成CART淋巴細(xì)胞對(duì)表達(dá)抗原的正常組織的損傷。如，針對(duì)腎細(xì)胞癌患者腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一個(gè)用于臨床的CART淋巴細(xì)胞過繼治療的案例，也是第一個(gè)報(bào)道含CAR細(xì)胞的脫靶效應(yīng)的案例。 病人在多次輸入CART淋巴細(xì)胞后出現(xiàn)2-4級(jí)肝毒性。分析原因?yàn)楦文懝苌掀ぜ?xì)胞低表達(dá)CAIX，原臨床試驗(yàn)被迫中斷同時(shí)排除了病人治療效果的任何評(píng)價(jià)[StoterG.etal.TreatmentofmetastaticrenalcellcarcinomawithautologousT-lymphocytesgeneticallyretargetedagainstcarbonicanhydraseIX：firstclinicalexperience.Jclinoncol，2006，24(13)：e20-e22.；NgoMC.，etal.Exvivogenetransferforimprovedadoptiveimmunotherapyofcancer.HumanMolecularGenetics，2011，R1-R7]。另外，CAR中過多的共刺激信號(hào)會(huì)降低效應(yīng)細(xì)胞激活所需的閾值，使得基因修飾的T淋巴細(xì)胞在低水平抗原或沒有抗原觸發(fā)的條件下也可能會(huì)被活化，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的釋放以致可能引發(fā)所謂的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。這種信號(hào)外漏(signalleakage)會(huì)導(dǎo)致脫靶細(xì)胞毒性，從而產(chǎn)生非特異性的組織損傷。例如，在采用針對(duì)Her2的第三代CAR臨床治療一個(gè)具有肝和肺轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)腸癌患者的過程中由于正常肺組織中低表達(dá)Her2而引發(fā)所謂的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”致病人猝死[MorganRA.，etal.ReportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationofTcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingErbb2.MolecularTherapy，2010，18(4)：843-851.]。因此，需要找到合適的方法，來使基于CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞能夠更為精準(zhǔn)地作用于腫瘤，避免應(yīng)用于腫瘤免疫治療時(shí)存在的較高風(fēng)險(xiǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種可活化的嵌合受體，其制備方法及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種可活化的嵌合受體(ActivatableChimericReceptor，ACR)，其包括：嵌合受體(ChimericReceptor，CR)，其在活化狀態(tài)下能靶向(結(jié)合)病理性組織高表達(dá)的抗原；封閉元件(Blockingelement，BE)，其能抑制嵌合受體與所述病理性組織高表達(dá)的抗原結(jié)合；和可剪切元件(Cleavableelement，CE)，其位于嵌合受體與封閉元件之間。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的嵌合受體包含順序連接的：胞外的抗原結(jié)合區(qū)、 跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)；所述的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)選自：CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134，CD40的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列或Myd88，或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的胞外的抗原結(jié)合區(qū)是特異性結(jié)合所述病理性組織高表達(dá)的抗原的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性結(jié)合所述病理性組織高表達(dá)的抗原的抗體可以是：?jiǎn)捂溈贵w(scFV)，單克隆抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，F(xiàn)(ab’)2片段和其衍生物，或其它形式的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性結(jié)合所述病理性組織高表達(dá)的抗原的抗體選自(但不限于)：?jiǎn)捂溈贵w或單結(jié)構(gòu)域抗體。在另一優(yōu)選例中，嵌合受體在封閉元件不存在的情況下能有效識(shí)別所述病理性組織高表達(dá)的抗原，封閉元件可以干擾或競(jìng)爭(zhēng)嵌合受體與所述病理性組織高表達(dá)的抗原的結(jié)合。在另一優(yōu)選例中，所述的可活化的嵌合受體按照從氨基端到羧基端的順序，依次包括：封閉元件，可剪切元件，嵌合受體。在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合受體、封閉元件、可剪切元件之間，還包括連接肽。在另一優(yōu)選例中，所述的可活化的嵌合受體，其中含有第一連接多肽(LP1)和第二連接多肽(LP2)；其中可活化的嵌合受體按照從氨基端到羧基端的順序，依次包括：封閉元件，第一連接多肽，可剪切元件，第二連接多肽，嵌合受體。在另一優(yōu)選例中，所述的封閉元件選自但不限于：直接與所述的嵌合受體結(jié)合的多肽；或從空間上阻礙所述的嵌合受體與抗原結(jié)合的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的封閉元件是2～100aa(如10aa，20aa，30aa，40aa，50aa，60aa，70aa，80aa)；較佳地是2～40aa的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的可剪切元件是能被病理性組織特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶所剪切、還原或分解的元件，所述蛋白酶與所述病理性組織高表達(dá)的抗原共定位于同一病理性組織。在另一優(yōu)選例中，所述的病理性組織包括但不限于：腫瘤，自身免疫性疾病組織，受病毒(如HIV病毒)感染的組織。在另一優(yōu)選例中，所述的病理性組織是腫瘤，所述的病理性組織特異性 表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶包括(但不限于)：尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-typeplasminogenactivator，uPA)，legumain蛋白酶或matriptase(MT-SP1)。在另一優(yōu)選例中，所述的病理性組織特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶是尿激酶型纖溶酶原激活物或matriptase，所述的可剪切元件是SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的病理性組織高表達(dá)的抗原包括但不限于：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20或ASGPR1。在另一優(yōu)選例中，所述的病理性組織高表達(dá)的抗原是GPC3，所述的封閉元件是GC33抗體的結(jié)合多肽；較佳地，所述的封閉元件是SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述的病理性組織高表達(dá)的抗原是GPC3時(shí)，該病理性組織為腫瘤，包括：肝癌，黑色素瘤，卵巢透明細(xì)胞癌、卵黃囊瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤。在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼所述的可活化的嵌合受體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，其包含編碼所述的可活化的嵌合受體的核酸。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體來源于慢病毒質(zhì)粒pWPT。在本發(fā)明的另一方面，提供一種病毒，所述的病毒包含所述載體。在本發(fā)明的另一方面，提供前面任一所述的可活化的嵌合受體、或編碼其的核酸、或包含該核酸的表達(dá)載體或病毒的用途，用于制備靶向病理性組織的嵌合受體免疫效應(yīng)細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種嵌合受體免疫效應(yīng)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼 前面任一所述的可活化的嵌合受體的核酸，或前面所述的表達(dá)載體或所述的病毒；或其表面表達(dá)前面任一所述的可活化的嵌合受體。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括：T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞或NKT細(xì)胞，Treg細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的嵌合受體免疫效應(yīng)細(xì)胞的用途，用于制備靶向病理性組織的藥物，該病理性組織高表達(dá)所述嵌合受體能結(jié)合的抗原。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的病理性組織是腫瘤，所述的靶向病理性組織的藥物是抑制腫瘤的藥物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，其包括：前面所述的嵌合受體免疫效應(yīng)細(xì)胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、可活化的嵌合受體ACR的結(jié)構(gòu)示意圖。按照N端→C端依次為：Sp：分泌信號(hào)肽，BE：封閉元件，LP1：接頭1；CE1：可剪切元件；LP2：接頭2，Ab：抗原結(jié)合區(qū)；LP3：接頭3；TM：跨膜區(qū)；SD：胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。圖2、GC33-28BBZ-ACR的示意圖。按照N端→C端的方向，圖中各個(gè)模塊依次為CD8分泌信號(hào)，BE(封閉元件)，LP1，CE(可剪切元件，UP1的酶切底物)，LP2，CR(GC33-28BBZ)，F(xiàn)2A，eGFP。圖3、FACS分析T細(xì)胞的GC33-28BBZ-ACR陽性率。通過GFP的陽性率作為指示慢病毒感染后T細(xì)胞的GC33-28BBZ-ACR 陽性率。圖4、體外毒性實(shí)驗(yàn)。將肝癌細(xì)胞系Huh-7作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為體外培養(yǎng)11天的表達(dá)了GC33-28BBZ-ACR的T細(xì)胞，效靶比分別為3:1，1:1和1:3，靶細(xì)胞數(shù)量為10000個(gè)/孔，根據(jù)不同效靶比對(duì)應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞。分別加入uPA與MTSP1，各設(shè)置一個(gè)低劑量組，一個(gè)高劑量組及空白組。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，取5個(gè)復(fù)孔的平均值。檢測(cè)時(shí)間為第18h。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，揭示了一種基于嵌合抗原受體(CAR)技術(shù)的可活化的嵌合受體，該可活化的嵌合受體只有在病理性組織特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶存在的條件下才能夠靶向相應(yīng)的抗原，實(shí)現(xiàn)病理性組織或細(xì)胞的殺傷作用；而在蛋白酶不存在的條件下不發(fā)揮作用。本發(fā)明為避免on-target-off-tumor的提供了可行的解決方案。如本文所用，所述的“嵌合受體”與“嵌合抗原受體”可互換使用。如本發(fā)明所用，所述的“病理性組織高表達(dá)的抗原”是指活化的嵌合受體所靶向的抗原，該抗原在病理性組織或細(xì)胞中高表達(dá)。在本發(fā)明中，該“病理性組織高表達(dá)的抗原”也可能在病理性組織或細(xì)胞以外的正常組織或細(xì)胞中表達(dá)。較佳地，該“病理性組織高表達(dá)的抗原”是腫瘤相關(guān)抗原，例如選自(但不限于)：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20或ASGPR1。如本發(fā)明所用，所述的“病理性組織特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶”是指僅在病理性組織或細(xì)胞中表達(dá)，或在病理性組織或細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白(水解)酶，其能夠?qū)ζ涮禺愋缘孜镞M(jìn)行水解。如本發(fā)明所用，所述的“封閉元件”是指能夠阻斷所述的嵌合受體與其相應(yīng)的抗原結(jié)合的多肽，其通過直接與所述的嵌合受體結(jié)合或從空間上阻礙 所述的嵌合受體與抗原結(jié)合等方式來發(fā)揮阻斷嵌合受體與靶位點(diǎn)結(jié)合的作用。如本發(fā)明所用，所述的“可剪切元件”是一個(gè)位于嵌合受體與封閉元件之間的多肽，其是所述的“病理性組織特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶”的底物，當(dāng)存在所述的蛋白酶時(shí)，該“可剪切元件”可被剪切、還原或分解，從而使得封閉元件不再阻斷所述的嵌合受體與其相應(yīng)的抗原發(fā)生結(jié)合。如本發(fā)明所用，所述的“病理性組織”包括(但不限于)：腫瘤，自身免疫性疾病組織，受病毒(如HIV病毒)感染的組織等。本發(fā)明中，所述的病理性組織可以是機(jī)體內(nèi)的各種不利于健康的有害組織或病灶，有必要從機(jī)體內(nèi)去除。所述的病理性靶組織包括腫瘤。任何本領(lǐng)域已知的腫瘤均可包含在本發(fā)明中，只要該腫瘤能夠表達(dá)正常組織中低表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。例如，所述的腫瘤包括(但不限于)：肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、腦腫瘤、卵巢癌、骨腫瘤、結(jié)腸癌、甲狀腺腫瘤、縱隔腫瘤、腸腫瘤、腎腫瘤、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤、睪丸腫瘤、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、食管癌、胸腺間皮瘤、胰腺癌、白血病、頭頸部腫瘤、宮頸癌、皮膚癌、黑色素瘤、陰道上皮癌、膽囊癌、惡性纖維組織細(xì)胞瘤。例如，所述的腫瘤相關(guān)抗原包括(但不限于)：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，CD19，CD33，IL13R，LMP1，PLAC1，NY-ESO-1，MAGE4，MUC1，MUC16，LeY，CEA，CAIX(碳酸酐酶IX)，CD123。術(shù)語“嵌合受體疫效應(yīng)細(xì)胞”是本領(lǐng)域公知的，其是利用基因改造技術(shù)表達(dá)抗原(如腫瘤抗原)特異性嵌合受體的免疫效應(yīng)細(xì)胞，能靶向性發(fā)揮殺傷作用。所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞例如包括T細(xì)胞，NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatorycell，簡(jiǎn)稱Treg)。常規(guī)的制備“嵌合受體免疫效應(yīng)細(xì)胞”的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括讓其表達(dá)胞內(nèi)共刺激細(xì)胞分子胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域，例如CD28(較佳地包括CD28a，CD28b)，CD137，CD27，CD3ζ(較佳地為CD3ζ細(xì)胞內(nèi)域)，CD8，CD19，CD134，CD20，F(xiàn)cεRIγ中的一種或多種。通過它們與相應(yīng)配體結(jié)合，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞的第二信號(hào)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌功能，延長(zhǎng)活化免疫細(xì)胞的存活時(shí)間。鑒于腫瘤絕對(duì)特異的靶點(diǎn)少之又少，因此大多數(shù)的CAR修飾的免疫細(xì)胞(如CART細(xì)胞)針對(duì)的抗原(如CD19，CD20，Her2，EGFR，EpCAM等)或多或少地在正常組織中表達(dá)，因此難以避免地出現(xiàn)on-target-off-tumor的副作用。如何減少或降低這種On-target-off-tumor的作用變得非常重要。本發(fā)明人廣泛地比較了腫瘤組織的微環(huán)境與正常組織的微環(huán)境的差異，首次基于一些蛋白水解酶如uPA、MT-sp1、Legumainprotease等在腫瘤組織中高表達(dá)而在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)的特點(diǎn)，利用這些水解酶的特異性，改造了嵌合受體修飾的免疫細(xì)胞，所獲得的免疫細(xì)胞只有在這些水解酶作用后才能更有效地發(fā)揮抗腫瘤功能，從而可有效地提高免疫細(xì)胞的安全性。因此，本發(fā)明提供一種可活化的嵌合受體(ActivatableChimericReceptor，ACR)，它包括嵌合受體(ChimericReceptor，CR)、可剪切的元件(Cleavableelement，CE)以及封閉元件(Blockingelement，BE)連接，三者之間可以藉由連接多肽進(jìn)行連接。其中CE抗原被剪切、還原、光學(xué)分解或其他修飾后，ACRs可以展示出活化的構(gòu)象，使得CR可以更容易與靶點(diǎn)結(jié)合。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明的可活化的嵌合受體ACR的一種結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。從左到右排列，即從蛋白質(zhì)的N端到C端排列組成的一個(gè)跨膜受體即可活化得嵌合受體ACR的示意圖。在未活化狀態(tài)下，BE會(huì)與Ab區(qū)結(jié)合，或在空間上阻礙Ab與靶抗原的結(jié)合；而一旦CE1被蛋白酶等剪切，那么Ab就可以與靶抗原結(jié)合。所述的封閉元件可以是任何可通過直接與所述的嵌合受體結(jié)合或從空間上阻礙所述的嵌合受體與抗原結(jié)合等方式來發(fā)揮阻斷嵌合受體與靶位點(diǎn)結(jié)合的作用的多肽?？梢愿鶕?jù)嵌合受體的抗原結(jié)合區(qū)的類型來選擇該封閉元件。例如，所述的抗原結(jié)合區(qū)是一種抗體，則該封閉元件可以是該抗體的結(jié)合多肽。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，嵌合受體的抗原結(jié)合區(qū)采用抗GPC3的抗體 GC33，而應(yīng)用其結(jié)合多肽(NSQQATPKDNEISTFH)作為封閉元件。所述的可剪切元件是可以被病理性組織特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶剪切、還原或分解的底物?？梢愿鶕?jù)所對(duì)應(yīng)的適應(yīng)癥，來選擇其中特異性表達(dá)或高表達(dá)的蛋白酶，其底物即可作為可剪切元件。所述的蛋白酶的表達(dá)特異性越高，則越是優(yōu)選的。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，適應(yīng)癥為腫瘤，腫瘤組織的微環(huán)境與正常組織的微環(huán)境存在不同，其中的蛋白水解酶如uPA，MT-sp1，Legumainprotease等在腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)，因此本發(fā)明人利用這些水解酶的特異性，來改造嵌合受體修飾的免疫細(xì)胞，該免疫細(xì)胞只有在這些水解酶作用后才能更有效地發(fā)揮抗腫瘤功能，從而有效地提高CAR修飾的免疫細(xì)胞的安全性。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，采用uPA和MT-SP1蛋白酶的底物多肽LSGRSDNH作為可剪切元件。所述的嵌合受體、封閉元件、可剪切元件之間，還可包括連接肽。所述的連接肽沒有特別的限制，可以是任何能夠提供所述的嵌合受體、封閉元件、可剪切元件之間柔性連接，不影響各元件自身的功能的任何多肽。較佳地，所述的連接子包括2-40個(gè)氨基酸；較佳地為3-30個(gè)氨基酸，如5、8、10、15、20、25個(gè)氨基酸。本發(fā)明也包括編碼所述可活化的嵌合受體的核酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明還提供了包含上述可活化的嵌合受體的核酸的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的載體是一種慢病毒質(zhì)粒載體pWPT。應(yīng)理解，其它表達(dá)載體也是可用的。本發(fā)明還包括包含上述載體的病毒。本發(fā)明的病毒包括包裝后的具有感染力的病毒，也包括包含包裝為具有感染力的病毒所必需成分的待包裝的病毒。本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它可用于將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入免疫效應(yīng)細(xì)胞的病毒及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒載體也可用于本發(fā)明。本發(fā)明還提供了基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼所述的可活化的嵌合受體的核酸或被轉(zhuǎn)導(dǎo)有上述包含所述含有該核酸的重組質(zhì)粒，或包 含該質(zhì)粒的病毒。本領(lǐng)域常規(guī)的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，包括非病毒和病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法都可以用于本發(fā)明?；诜遣《镜霓D(zhuǎn)導(dǎo)方法包括電穿孔法和轉(zhuǎn)座子法。近期Amaxa公司研發(fā)的Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀能夠直接將外源基因?qū)爰?xì)胞核獲得目的基因的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，基于睡美人轉(zhuǎn)座子(SleepingBeautysystem)或PiggyBac轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較普通電穿孔有較大提高，將nucleofector轉(zhuǎn)染儀與睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用已有報(bào)道[DaviesJK.，etal.CombiningCD19redirectionandalloanergizationtogeneratetumor-specifichumanTcellsforallogeneiccelltherapyofB-cellmalignancies.CancerRes，2010，70(10):OF1-10.]，該方法既具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率又能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的定點(diǎn)整合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)嵌合受體(本發(fā)明中為可活化的嵌合受體)基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法是基于病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。該方法具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)，且可以縮短體外培養(yǎng)免疫效應(yīng)細(xì)胞到達(dá)臨床級(jí)數(shù)量的時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。在該轉(zhuǎn)基因免疫效應(yīng)細(xì)胞表面，轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸通過轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)在其表面。通過對(duì)各種不同的培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞具有高度特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷效果(亦稱細(xì)胞毒性)。因此本發(fā)明的編碼嵌合受體蛋白的核酸，包含該核酸的質(zhì)粒，包含該質(zhì)粒的病毒和轉(zhuǎn)導(dǎo)有上述核酸，質(zhì)?；虿《镜霓D(zhuǎn)基因免疫效應(yīng)細(xì)胞可以有效地用于腫瘤的免疫治療。本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以攜帶外源的細(xì)胞因子的編碼序列；所述的細(xì)胞因子包括但不限于：IL-12，IL-15或IL-21等。這些細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)或抗腫瘤的活性，能增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞及活化的NK細(xì)胞的功能，或直接發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這些細(xì)胞因子的運(yùn)用有助于所述的免疫細(xì)胞更好地發(fā)揮作用。本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)除了上述嵌合受體以外的另一種嵌合受體，該受體不含有CD3ζ，但含有CD28的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域或者這兩者的組合。本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)趨化因子受體；所述的趨化因子受體包括但不限于CCR2。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述的CCR2趨化因子受體可以使得體內(nèi)的CCR2與之競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，對(duì)于阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移是有利的。本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)能降低PD-1表達(dá)的siRNA或者阻斷PD-L1的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷PD-L1與其受體PD-1的相互作用，有利于恢復(fù)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)安全開關(guān)；較佳地，所述的安全開關(guān)包括：iCaspase-9，TruancatedEGFR或RQR8。本發(fā)明的嵌合受體免疫效應(yīng)細(xì)胞可以應(yīng)用于制備藥物組合物或診斷試劑。所述的組合物除了包括有效量的所述免疫細(xì)胞，還可包含藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如潤(rùn)濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等。本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。給藥方式例如可以采用注射或其它治療方式。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、抗GPC3第三代嵌合抗原受體的構(gòu)建利用之前構(gòu)建的抗磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)第三代嵌合抗原受體 (Chimericantigenreceptor，CAR)，該CAR中所用的單鏈抗體源自GC33抗體，該CART的構(gòu)建參見申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310164725.X中，其GPC3-28BBZ被應(yīng)用于本實(shí)施例中，也稱為GC33-28BBZ。本發(fā)明人將GC33抗體的結(jié)合多肽(NSQQATPKDNEISTFH(SEQIDNO:1))作為BE元件，而uPA和MT-SP1蛋白酶的底物多肽LSGRSDNH(SEQIDNO:2)作為CE元件。另外通過由來自口蹄疫病毒(food-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)的核糖體跳躍序列(ribosomalskippingsequence2A)(簡(jiǎn)稱F2A)將eGFP連接于ACR的C端，實(shí)現(xiàn)eGFP與ACR的共表達(dá)，從而通過eGFP的表達(dá)情況來間接說明ACR的表達(dá)。(1)Sp+BE+LP1+CE+LP2的片段的獲得設(shè)計(jì)如表1的引物。表1其中Sp+BE+LP1+CE+LP2的片段采用如表1的引物，通過OverlapPCR獲得，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性：94℃，4min；如下25個(gè)循環(huán)：變性：94℃，30s，退火：50℃，30s，延伸：68℃，20s；然后，68℃再延伸10min。隨后采用常規(guī)方法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，獲得Sp+BE+LP1+CE+LP2相互連接的DNA片段。(2)LP2-GC33-28BBZ片段的獲得設(shè)計(jì)如2的引物。表2取GC33-28BBZ質(zhì)粒(該質(zhì)粒參見CN201310164725.X專利)1微升(100ng)為模板，分別將GPC3scfv-F、3z-F2A-R作為上下游引物，50微升體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，從而獲得LP2-GC33-28BBZ片段。(3)F2A-EGFP的獲得設(shè)計(jì)如3的引物。表3取GC33-28BBZ質(zhì)粒1微升(100ng)為模板，分別將F2A-EGFP-F、 pwpt-EGFP-R作為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，從而得到F2A-EGFP。(4)慢病毒質(zhì)粒pWPT-GC33-28BBZ-ACR的獲得將上述(1)～(3)制備獲得的三段片段進(jìn)行overlapPCR，具體地講三段片段，按照等摩爾比進(jìn)行混合，按上述步驟(1)所述進(jìn)行overlapPCR，上下游引物是CD8sp-F與EGFP-R。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。采用限制性內(nèi)切酶對(duì)MluI及SalI雙酶切后連入慢病毒質(zhì)粒pWPT載體的相應(yīng)位點(diǎn)內(nèi)。獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)12h左右進(jìn)行挑克隆驗(yàn)證。選擇包含有重組質(zhì)粒的克隆送測(cè)序。選擇序列正確的克隆進(jìn)行病毒制備和包裝。獲得的載體命名為pWPT-GC33-28BBZ-ACR。實(shí)施例3、CAR-T的制備1、GC33-28BBZ-ACR的慢病毒的包裝以6×106的密度接種培養(yǎng)至第6～10代的HEK-293T細(xì)胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(購自gibco公司)的DMEM(購自gibco公司)。轉(zhuǎn)染的步驟如下：(1)將10μg目的基因質(zhì)粒pWPT-GC33-28BBZ-ACR，分別與6.5μg包裝質(zhì)粒PAX2：和3.5μg包膜質(zhì)粒pMD2.G，溶入800μL的無血清DMEM培養(yǎng)液中，混勻。(2)將60μlPEI(聚乙烯亞胺，購自Polysciences公司，配成1μg/μL濃度的工作液)，加入上述帶有質(zhì)粒的800μL的無血清DMEM培養(yǎng)液中，渦旋混勻，室溫靜置孵育25min。(3)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物800μL加入待轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞中，6-8h小時(shí)后，用10％FBS的DMEM培基給轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞換液。(4)在轉(zhuǎn)染后約24h，觀察轉(zhuǎn)染效率(即呈綠色熒光的細(xì)胞比例)。在轉(zhuǎn)染 72h后，使用0.45μm濾器(購自Millipore公司)過濾收集病毒，超速離心(BeckmanOptimaL-100XP超速離心機(jī)28000rpm，4℃離心2小時(shí))，濃縮病毒。離心所得沉淀用1/30原液體積的AIM-V培養(yǎng)液(購自Gibco公司)進(jìn)行重懸，以100μL/管分裝凍存于-80℃，用以感染T淋巴細(xì)胞。同時(shí)，將獲得的濃縮病毒進(jìn)行滴定。2、GC33-28BBZ-ACR的感染由健康人外周血通過密度梯度離心法獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(上海市血液中心提供)。外周血單個(gè)核細(xì)胞通過CD4+/CD8+細(xì)胞磁珠(購自StemCellTechnologies)負(fù)性分選方法獲得CD4+與CD8+陽性的原代人T淋巴細(xì)胞。分選后的T細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其純度，以目標(biāo)細(xì)胞的陽性率≥95％為宜進(jìn)行下一步操作。以1×106/mL密度加入AIM-V淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基液(購自Gibco公司，含有2％人ABserum)培養(yǎng)并以細(xì)胞：磁珠比例為1:1加入同時(shí)包被有抗CD3和CD28抗體的磁珠(Invitrogen公司)和終濃度300U/mL的重組人IL-2(購自上海華新生物高技術(shù)有限公司)刺激培養(yǎng)24h。感染前，將CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞按照1:1的比例混合，然后以MOI≈5-10將上述病毒濃縮液與待感染T細(xì)胞混合，同時(shí)加入終濃度為6μg/mL的polybrene。感染后的細(xì)胞，隔天換液，換不含有病毒的培基。每隔一天采用5×105/mL的密度進(jìn)行傳代，同時(shí)在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中補(bǔ)加終濃度300U/mL的重組人IL-2。感染后的原代T細(xì)胞在第9-11天(即第一輪擴(kuò)增周期結(jié)束)時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嵌合抗原受體GC33-28BBZ-ACR的表達(dá)，由于eGFP與GC33-28BBZ-ACR共表達(dá)，檢測(cè)eGFP的陽性細(xì)胞即為表達(dá)嵌合抗原受體的陽性細(xì)胞，并以未感染的T淋巴細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3，通過GFP的陽性率作為指示慢病毒感染后T細(xì)胞的GC33-28BBZ-ACR陽性率，可見陽性率為61.0％。實(shí)施例4、外源重組uPA促進(jìn)BE-GPC3-CART的活化體外毒性實(shí)驗(yàn)使用的材料如下：將肝癌細(xì)胞系Huh-7作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為體外培養(yǎng)11天的表達(dá)了 GC33-28BBZ-ACR的T細(xì)胞(陽性率61％)，效靶比分別為3:1，1:1和1:3，靶細(xì)胞數(shù)量為10000個(gè)/孔，根據(jù)不同效靶比對(duì)應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞。分別加入uPA與MTSP1，各設(shè)置一個(gè)低劑量組(uPA：0.08μg/mL；MT-SP1：0.04μg/mL)，一個(gè)高劑量組(uPA：0.4μg/mL；MT-SP1：0.2μg/mL)及空白組(uPA：0μg/mL；MT-SP1：0μg/mL)。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，取5個(gè)復(fù)孔的平均值。檢測(cè)時(shí)間為第18h。其中各實(shí)驗(yàn)組和各對(duì)照組如下：實(shí)驗(yàn)組(空白組)：靶細(xì)胞Huh-7+GC33-28BBZ-ACRT細(xì)胞+不同濃度的酶，對(duì)照組1：靶細(xì)胞最大釋放LDH+不同濃度的酶，對(duì)照組2：靶細(xì)胞自發(fā)釋放LDH+不同濃度的酶，對(duì)照組3：效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放LDH+不同濃度的酶。檢測(cè)方法：采用CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞毒性計(jì)算公式為：從圖4可以看出，GC33-28BBZ-ACRT細(xì)胞(感染了GC33-28BBZ-ACR的T細(xì)胞)的抗腫瘤活性較低，但在uPA或者M(jìn)T-SP1的作用下均能夠有效地活化，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的設(shè)計(jì)是合理的，那就是通過封閉元件的作用確實(shí)能使T細(xì)胞的殺傷作用減弱；但是在腫瘤局部環(huán)境中如果有足夠量的uPA或者M(jìn)T-SP1等相應(yīng)蛋白酶的作用ACR可得到激活并殺傷腫瘤細(xì)胞，從而起到局部抗腫瘤活性，減少對(duì)正常組織的損傷。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容 之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3