本發(fā)明涉及腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種抗CD47和EGFR的雙功能蛋白。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在各種致死性的疾病中高居第二位。近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率明顯上升，同時(shí)，其治療效果較差，晚期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳。目前臨床上，所采用的常規(guī)治療方法如放化療和手術(shù)治療很大程度緩解了疼痛，但這些療法的副作用及局限性仍很大，療效難以進(jìn)一步提高。

正常細(xì)胞的增殖是通過(guò)各自的配體嚴(yán)格激活其生長(zhǎng)因子受體來(lái)控制的，比如生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶。癌細(xì)胞也是在生長(zhǎng)因子受體的激活下增殖的，但失去了正常增殖時(shí)的嚴(yán)格控制。這種失控可能是由很多因素引起的，比如生長(zhǎng)因子的過(guò)度表達(dá)或生長(zhǎng)因子受體的過(guò)度表達(dá)，以及由生長(zhǎng)因子調(diào)控的生化途徑的自發(fā)性激活。參與致癌的受體包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)，類胰島素生長(zhǎng)因子受體(IGFR)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)和成纖維生長(zhǎng)因子受體(FGF)等。

表皮生長(zhǎng)因子受體(即EGFR)也稱作c-erbB l/Herl，其家族成員都是生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶，它們?cè)诩?xì)胞表面與特異的生長(zhǎng)因子或天然配體相互作用，如與EGF或TGFα相互作用，由此活化受體酪氨酸激酶。EGFR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、修復(fù)和生存、新生血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，同時(shí)在相當(dāng)一部分的人類腫瘤中都有表達(dá)。在很多惡性腫瘤中，EGFR的表達(dá)往往與較差的預(yù)后和較低的生存率相關(guān)。由此可知，如果有藥物能阻斷EGFR的活性，那將會(huì)抑制其磷酸化和信號(hào)傳導(dǎo)，從而起到多重途徑的抗腫瘤作用，同時(shí)也能增加化療和放療的抗腫瘤療效。在一些研究中，EGFR抑制劑與多種化療藥物和放療藥物聯(lián)合作用于一些腫瘤細(xì)胞株時(shí)，表現(xiàn)出累加和協(xié)同作用。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個(gè)多因素多機(jī)制多種因子參與的過(guò)程。CD47即整合素相關(guān)蛋白(Integrin-Associated Protein，IAP)，表達(dá)于細(xì)胞表面，可結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白-α(Signal-RegμLatory Proteinα，SIRPα)進(jìn)而磷酸化SIRPα的胞質(zhì)內(nèi)免疫受體酪氨酸抑制性基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motifs，ITIMs)，招募磷酸酶SHP-1后向巨噬細(xì)胞發(fā)出“別吃我(Don’t eat me)”的抑制性信號(hào)。CD47分子在腫瘤細(xì)胞表面的廣泛表達(dá)抑制了巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬效應(yīng)。據(jù)此，研究人員開(kāi)發(fā)了可激活巨噬細(xì)胞吞噬效應(yīng)的CD47拮抗劑(CD47 antagonists)。CD47拮抗劑將通過(guò)封閉CD47和SIRPα結(jié)合而激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。

由此可見(jiàn)，如果能同時(shí)阻斷CD47和EGFR，不但可以抑制EGFR信號(hào)激活導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞增殖，也將阻斷CD47介導(dǎo)的腫瘤抑制性信號(hào)，激活對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，故可能會(huì)比單獨(dú)阻斷EGFR或CD47有更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)增殖的協(xié)同作用，對(duì)腫瘤的治療將具有重要意義。

CD47拮抗劑主要包括靶向CD47的抗體和SIRPα突變體兩種。研究表明，靶向CD47的單克隆抗體Ab400在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中都顯示了對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)的顯著抑制效應(yīng)。同樣，在用于對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體腫瘤治療時(shí)，靶向CD47抗體也顯示了有效抑瘤效果。最近研究表明，工程化改造的SIRPα突變體(SIRPα-Fc)具有對(duì)CD47更高的親和力且顯示出對(duì)多種腫瘤的抑制效應(yīng)，亦是一種極具潛力的CD47拮抗劑。EGFR抑制劑主要包括單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑、配體-毒素和免疫毒素聯(lián)結(jié)物，以及反義核苷酸和EGFR/配體主導(dǎo)的疫苗等。靶向EGFR的抗體可以抑制表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)，在肺癌及結(jié)直腸癌的治療療中，顯示了明顯的抑瘤效果。帕妥木單抗(Panitumumab，ABX-EGF，AMG954，商品名：VECTIBIX)為全人源的IgG2類單克隆抗體，其親和力約為5×10^-11mol/L。該抗體是由Amgen公司生產(chǎn)和銷售，2006年9月FDA批準(zhǔn)帕妥木單抗用于治療表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。其主要作用機(jī)制即是阻斷EGF與腫瘤細(xì)胞表面EGFR的結(jié)合，誘導(dǎo)EGFR內(nèi)化，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

但是，單抗聯(lián)合應(yīng)用具有多方面的限制。首先，臨床上應(yīng)用兩種抗體的安全性和效果至今未有詳盡的報(bào)道，可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)；另外，聯(lián)合應(yīng)用兩種抗體也存在調(diào)節(jié)障礙和造價(jià)太高的缺陷，限制了其臨床應(yīng)用。

因此，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建一個(gè)可以同時(shí)阻斷兩個(gè)靶點(diǎn)的雙功能蛋白，既能阻斷EGFR，又能阻斷CD47，進(jìn)而更有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖，這一直是本領(lǐng)域的技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種抗CD47和EGFR的雙功能蛋白及其制備方法，所述雙功能蛋白既可以抑制EGFR，也能拮抗CD47，可用于制備抗腫瘤藥物。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種抗CD47和EGFR的雙功能蛋白EGFR/CD47-BsAb-Ig(簡(jiǎn)稱Bi-SP)，所述雙功能蛋白包含抗EGFR側(cè)的重鏈、抗EGFR側(cè)的輕鏈以及抗CD47側(cè)的Fc融合蛋白。

所述抗EGFR側(cè)的重鏈、抗EGFR側(cè)的輕鏈以及抗CD47側(cè)的Fc融合蛋白可通過(guò)在CHO細(xì)胞內(nèi)形成二硫鍵組成得到一種即可抑制EGFR，又可拮抗CD47的雙功能蛋白。

為了避免在上述元件的組成過(guò)程中發(fā)生抗EGFR側(cè)抗體或抗CD47側(cè)融合蛋白的自我連接或組合，本發(fā)明對(duì)上述抗EGFR側(cè)的重鏈和抗CD47側(cè)的Fc融合蛋白中的恒定區(qū)CH3區(qū)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，具體如下：在抗EGFR側(cè)重鏈恒定區(qū)CH3引入四個(gè)突變，包括SEQ ID NO.2中第348位由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼?，?50位由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，?74位酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，第330位酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?。在Bi-SP的抗CD47側(cè)Fc區(qū)引入兩個(gè)突變，包括SEQ ID NO.12中第166位由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼峒暗?52位絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?。?jīng)突變后抗CD47側(cè)Fc段和抗EGFR側(cè)重鏈恒定區(qū)可通過(guò)這些氨基酸形成類似于“鎖匙結(jié)構(gòu)(Knob-in-hole)”的結(jié)合模式，大大增加了正確配對(duì)的幾率，降低了形成自身配對(duì)的可能性。

基于上述調(diào)整，所述雙功能蛋白具體包含SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。

第二方面，本發(fā)明提供了前述雙功能蛋白的制備方法，包括如下步驟：

S1、構(gòu)建分別含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的載體，并將其用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定表達(dá)雙功能蛋白的細(xì)胞克??；

S2、對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分離純化，得到雙功能蛋白Bi-SP。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的載體，例如pCDNA3.1、pDHFF等。表達(dá)載體中包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的融合DNA序列。

可選地，如在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，使用真核表達(dá)載體pcDNA3.1。

進(jìn)一步地，用于表達(dá)所述雙功能蛋白的宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞，例如DH5α、BL21(DE3)、TG1等；也可為哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞，COS、CHO、NSO、sf9及sf21等均可適用于本發(fā)明。

作為優(yōu)選，本發(fā)明選擇CHO-K1細(xì)胞(ATCC)作為宿主細(xì)胞進(jìn)行雙功能蛋白的表達(dá)。

進(jìn)一步地，宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)條件，例如使用含10％血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，S2中，用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)雙功能蛋白的細(xì)胞克隆。利用上述方法，可將雙功能蛋白純化為基本均一的物質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上為單一條帶。更進(jìn)一步地，可以利用親和層析的方法對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的雙功能蛋白進(jìn)行分離純化，根據(jù)所利用的親和柱的特性，可以使用常規(guī)方法例如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的雙功能蛋白。

本發(fā)明對(duì)Bi-SP進(jìn)行親和力檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其完好地保留了Panitumumab和SIRPα突變體的親和力。利用Bi-SP進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，包括腫瘤細(xì)胞增殖、體內(nèi)抑瘤和促巨噬細(xì)胞吞噬等實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明公開(kāi)的雙功能蛋白Bi-SP同時(shí)具有Panitumumab和SIRPα突變體的功能，它能夠能阻斷CD47介導(dǎo)及EGFR誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，該雙功能蛋白Bi-SP可以和傳統(tǒng)的IgG分子一樣，最大程度地保留了傳統(tǒng)單克隆抗體結(jié)構(gòu)，因?yàn)橛蠪c片段的存在，可以用普通的Protein A柱親和層析法純化，利于大規(guī)模的生產(chǎn)純化。實(shí)驗(yàn)表明，在相同劑量下，雙功能蛋白Bi-SP具有明顯優(yōu)于Panitumumab的抗腫瘤治療效果。

三方面，基于前述技術(shù)方案，可同時(shí)表達(dá)SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列的宿主細(xì)胞，以及包括分別含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的載體的載體組合也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

第四方面，本發(fā)明還提供了含有前述雙功能蛋白Bi-SP的組合物。

以及，提供了前述雙功能蛋白Bi-SP或含有其的組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開(kāi)的上述雙功能蛋白Bi-SP，和藥學(xué)上可以接受的輔料一起組成藥物制劑組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，這些制劑可以保證本發(fā)明公開(kāi)的全人源抗體氨基酸核心序列的構(gòu)像完整性，同時(shí)還要保護(hù)蛋白質(zhì)的多官能團(tuán)防止其降解(包括但不限于凝聚、脫氨或氧化)。通常情況下，對(duì)于液體制劑，通?？梢栽?℃-8℃條件下保存至少穩(wěn)定一年，對(duì)于凍干制劑，在30℃至少六個(gè)月保持穩(wěn)定。在這里制劑可為制藥領(lǐng)域常用的混懸、水針、凍干等制劑，優(yōu)選水針或凍干制劑，對(duì)于本發(fā)明公開(kāi)的上述全人源抗體的水針或凍干制劑，藥學(xué)上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑和緩沖液之一或其組合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷基、亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量應(yīng)使雙功能蛋白的顆?；厔?shì)最小，溶液穩(wěn)定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類包括谷氨酸單鈉或組氨酸，醇類包括三元醇、高級(jí)糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩(wěn)定劑的加入量應(yīng)該使最后形成的制劑在本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，等滲調(diào)節(jié)劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液可以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。

上述制劑為包含雙功能蛋白的組合物，在對(duì)包括人在內(nèi)的動(dòng)物給藥后，抗腫瘤效果明顯。具體來(lái)講，對(duì)腫瘤的預(yù)防和/或治療有效，可以作為抗腫瘤藥物使用。

本發(fā)明中所稱的抗腫瘤藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)癥狀發(fā)展的延遲和/或這些癥狀嚴(yán)重程度的降低，它進(jìn)一步還包括已存在的腫瘤生長(zhǎng)伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現(xiàn)，還減少或防止轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明中雙功能蛋白Bi-SP及含有其的組合物在對(duì)包括人在內(nèi)的動(dòng)物給藥，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴(yán)重性，以及給藥途徑而異，可以參考動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和種種情況，總給藥量不能超過(guò)一定范圍。

本發(fā)明公開(kāi)的雙功能蛋白Bi-SP及含有其的組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯(lián)合給藥，用于腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括：

1、細(xì)胞毒類藥物(1)作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物：烷化劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉑類化合物如順鉑、卡鉑和草酸鉑等；絲裂霉素(MMC)；(2)影響核酸合成的藥物：二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5FU、FT－207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑如6－巰基嘌呤(6－MP)和6－TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3)作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物：選擇性作用于DNA模板，抑制DNA依賴RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如：放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光輝霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的藥物：紫杉醇、泰索帝、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春瑞濱、鬼臼鹼類、高三尖杉酯堿；(5)其他細(xì)胞毒藥：門冬酰胺酶主要抑制蛋白質(zhì)的合成；

2、激素類抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑：氨魯米特、蘭特隆、來(lái)曲唑、瑞寧德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激動(dòng)劑/拮抗劑：諾雷德、依那通等；

3、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：主要通過(guò)機(jī)體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白細(xì)胞介素－2；胸腺肽類；

4、單克隆抗體：西妥昔Cetuximab(C225)；赫賽汀單抗(Trastuzumab)貝伐單抗(Avastin)；

5、其他包括一些目前機(jī)制不明和有待進(jìn)一步研究的藥物；細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑如維甲類；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。本發(fā)明公開(kāi)的雙功能蛋白Bi-SP及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯(lián)合用藥。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明采用基因工程技術(shù)構(gòu)建一個(gè)可以同時(shí)阻斷兩個(gè)靶點(diǎn)的雙功能蛋白，既能阻斷EGFR，又能阻斷CD47，進(jìn)而更有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。

附圖說(shuō)明

圖1為雙功能蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為雙功能蛋白的SDS-PAGE驗(yàn)證試驗(yàn)；第一泳道為蛋白質(zhì)分子量對(duì)照品，第二泳道為雙功能蛋白Bi-SP，第三泳道為帕妥木單抗(Panitumumab)，第四泳道為SIRPα突變體蛋白；

圖3為雙功能蛋白與EGFR及CD47結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖4為雙功能蛋白與EGFR及CD47雙陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證結(jié)果；

圖5為雙功能蛋白激活巨噬細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)；

圖6為雙功能蛋白抑制荷瘤小鼠A431細(xì)胞腫瘤生成實(shí)驗(yàn)；

圖7為雙功能蛋白抑制荷瘤小鼠H292細(xì)胞腫瘤生成實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例不包括對(duì)傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括MolecμLar Cloning(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.and Maniais，T.，1989)：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

本發(fā)明中所涉及的定義如下：

Bi-SP：靶向CD47和EGFR的雙功能蛋白；Panitumumab：帕尼單抗；SIRPα突變體-Fc：信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白-α可結(jié)晶片段融合蛋白；CD47：整合素相關(guān)蛋白；EGFR：表皮生長(zhǎng)因子受體；TKI：酪氨酸激酶抑制劑；IgG：免疫球蛋白G；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；SPR：表面等離子共振技術(shù)；CI：置信區(qū)間；LC，抗體輕鏈；HC，抗體重鏈；CRC：結(jié)腸癌；ECD：細(xì)胞外區(qū)域；SEC：分子篩層析；CCK-8：活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8；SDS-PAGE：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

實(shí)施例1人抗體輕、重鏈恒定區(qū)和Fc區(qū)基因的克隆

用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人淋巴細(xì)胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取總RNA，根據(jù)文獻(xiàn)(Cell，1980，22：197-207)和文獻(xiàn)(Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079)報(bào)道的序列分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增IgG1型抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因，PCR反應(yīng)均采用熱啟動(dòng)，反應(yīng)條件：94℃5分鐘；94℃45秒，60℃45秒，72℃70秒，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，測(cè)序驗(yàn)證后確認(rèn)獲得了正確的克隆。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分別顯示了重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12分別顯示了恒定區(qū)Fc段(Fc)的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL、pGEM-T/Fc。

實(shí)施例2雙功能蛋白Bi-SP的構(gòu)建

具體構(gòu)建方法：全基因合成Panitumumab的重、輕鏈可變區(qū)基因，Panitumumab的輕、重鏈可變區(qū)序列請(qǐng)參見(jiàn)專利文獻(xiàn)(WO9850433)，SIRPα突變體的序列參見(jiàn)Science 341，88(2013)。Panitumumab的重鏈可變區(qū)與人IgG1抗體的重鏈恒定區(qū)連接，組成了Bi-SP的抗EGFR側(cè)重鏈基因；PCR克隆出SIRPα與人IgG1抗體的重鏈恒定區(qū)Fc段連接，組成了Bi-SP的抗CD47側(cè)融合蛋白基因。Panitumumab的輕鏈可變區(qū)通過(guò)overlap PCR的方法與人IgG1抗體的輕鏈恒定區(qū)連接，組成了Bi-SP的抗EGFR側(cè)輕鏈基因。將上述重、輕鏈基因及融合蛋白基因分別裝入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen公司產(chǎn)品)。上述質(zhì)粒一起用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞(ATCC)，并用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)雙功能蛋白的細(xì)胞克隆。利用Protein A柱通過(guò)親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清純化雙功能蛋白Bi-SP。

下面以Bi-SP為例詳細(xì)說(shuō)明雙功能蛋白的構(gòu)建表達(dá)過(guò)程：

Bi-SP抗EGFR側(cè)的重鏈和輕鏈可變區(qū)及抗CD47側(cè)SIRPα突變體分別為Bi-SPVH，Bi-SPVL及Bi-SPSIRPα，經(jīng)Overlap PCR合成后回收目的條帶并克隆到pGEM-T載體中，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，分別得到pGEM-T/Bi-SPVH(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)，pGEM-T/Bi-SPVL(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)及pGEM-T/Bi-SPSIRPα(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)。PCR采用Roche公司的高保真擴(kuò)增系統(tǒng)，反應(yīng)條件均為：95℃5分鐘；94℃50秒，55℃45秒，72℃55秒，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。

采用Overlap PCR將pGEM-T/Bi-SPVH基因與pGEM-T/CH中的重鏈恒定區(qū)基因連接，并克隆到pGEM-T載體中，挑選正確克隆后以HindIII和EcoRI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與同酶切的質(zhì)粒pCDNA3.1(+)用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)。

采用Overlap PCR將pGEM-T/Bi-SIRPα基因與pGEM-T/Fc中的Fc段基因連接，并克隆到pGEM-T載體中，挑選正確克隆后以HindIII和EcoRI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與同酶切的質(zhì)粒pCDNA3.1(+)用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPSIRPαFc)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ NO：17和SEQ NO:18)。

采用Overlap PCR將pGEM-T/Bi-SPVL中的Bi-SPVL基因與pGEM-T/CL中的輕鏈恒定區(qū)基因相連，并克隆到pGEM-T載體中，挑選正確克隆后以HindIII和EcoRI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與同酶切的質(zhì)粒pCDNA3.1(+)用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVLCL)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示)。

于3.5cm組織培養(yǎng)皿中接種3×10⁵個(gè)CHO-K1細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至90％-95％融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染：取質(zhì)粒9μg(質(zhì)粒pCDNA3.1(+)pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVHCH)3μg，pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVLCL)3μg，pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SP SIRPαFc)3μg)和20μL Lipofectamine2000Reagent[Invitrogen公司產(chǎn)品]分別溶于500μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成，其間用3mL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到板中，CO₂孵箱培養(yǎng)4小時(shí)后補(bǔ)加2mL含10％血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于CO₂孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后細(xì)胞換含600μg/mLG418和250μg/mL Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。將篩選得到的高表達(dá)克隆用無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用Protein A親和柱(GE公司產(chǎn)品)分離純化雙功能蛋白Bi-SP。將Bi-SP用PBS進(jìn)行透析，最后以紫外吸收法定量。Bi-SP的結(jié)構(gòu)如圖1所示，左側(cè)為Bi-SP的抗EGFR側(cè)重鏈與輕鏈，右側(cè)為Bi-SP的抗CD47側(cè)的SIRPα突變體Fc融合蛋白。

實(shí)驗(yàn)例1雙功能蛋白純度的驗(yàn)證試驗(yàn)

配制含有SDS 10％丙烯酰胺濃度的聚丙烯酰胺凝膠，將抗體Panitumumab，融合蛋白SIRPα及雙功能蛋白Bi-SP分別上樣進(jìn)行凝膠電泳試驗(yàn)，以分析各組分的純度。結(jié)果如圖2所示，Bi-SP的純度在90％以上。

實(shí)驗(yàn)例2雙功能蛋白Bi-SP與EGFR和CD47的結(jié)合活性檢測(cè)

將EGFR(R&D公司產(chǎn)品)用0.05mmol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.6)稀釋成2μg/mL，50μL/孔，4℃包被過(guò)夜。10％脫脂奶室溫封閉2h后，加入不同濃度的雙功能蛋白，SIRPα突變體和Panitumumab(Amgen公司產(chǎn)品)，50μL/孔，每個(gè)濃度取3個(gè)平行孔，室溫孵育2h。棄上清液，PBS洗滌3次，加入按效價(jià)稀釋好的HRP標(biāo)記的CD47，50μL/孔，室溫孵育45min。PBS充分洗滌后，TMB顯色后，置酶標(biāo)儀(酶標(biāo)比色儀，美國(guó)BIO-Rad公司)中測(cè)定450nm吸光度(A450)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖中縱坐標(biāo)為450nm的光密度值(或稱吸光度值)，橫坐標(biāo)為抗體濃度的對(duì)數(shù)。SIRPα和Panitumumab僅能結(jié)合CD47或EGFR，因此讀值接近于0，而B(niǎo)i-SP組顯示了隨加入抗體濃度升高，相應(yīng)OD值也增高的濃度依賴性效應(yīng)。通過(guò)此試驗(yàn)證實(shí)了Bi-SP既可結(jié)合CD47又可結(jié)合EGFR的結(jié)合特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：因雙功能蛋白Bi-SP可結(jié)合EGFR也可結(jié)合CD47，而顯現(xiàn)出濃度依賴效應(yīng)呈S曲線。Panitumumab和SIRPα突變體因只能結(jié)合EGFR或CD47，因此無(wú)結(jié)合活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，構(gòu)建的雙功能蛋白Bi-SP同時(shí)保留了親本Panitumumab和SIRPα突變體的結(jié)合活性。

實(shí)驗(yàn)例3流式細(xì)胞術(shù)分析

將EGFR和CD47雙陽(yáng)性的肺癌H292和表皮癌A431細(xì)胞用2％FCS-PBS重懸成1×10⁶個(gè)/mL，分別加入不同稀釋度的Bi-SP和對(duì)照品IgG，置于4℃孵育1h，用2％FCS-PBS洗細(xì)胞2遍。再加入FITC標(biāo)記的羊抗人IgG(H+L)的二抗于4℃孵育1h，用2％FCS-PBS洗細(xì)胞2遍后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，計(jì)算染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)并比較各抗體的相對(duì)親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖中橫坐標(biāo)為抗體的濃度，縱坐標(biāo)為平均熒光強(qiáng)度。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，Bi-SP對(duì)CD47和EGFR雙陽(yáng)性的細(xì)胞結(jié)合具有濃度依賴性結(jié)合，呈現(xiàn)S曲線。對(duì)照組為加入無(wú)關(guān)IgG組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Bi-SP可以結(jié)合EGFR和CD47雙陽(yáng)性的A431和H292細(xì)胞，即Bi-SP可以同時(shí)結(jié)合細(xì)胞表面的EGFR和CD47。

實(shí)驗(yàn)例4雙功能蛋白Bi-SP體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)

利用無(wú)血清培養(yǎng)基灌洗小鼠腹腔，灌洗液制備鼠腹腔巨噬細(xì)胞，具體方法如下：對(duì)三只NOD-SCID小鼠提前5天腹腔注射1-2mL巰基乙酸鹽培養(yǎng)基；5天后，頸椎脫臼法處死小鼠。用注射器抽取5mL含有雙抗的RPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基注入腹腔；用棉球輕揉腹部1-2分鐘后吸取細(xì)胞懸液；1000rpm離心5min后，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細(xì)胞于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)；接著利用熒光顯微鏡觀察吞噬效果，其具體方法如下：以5×10⁴個(gè)/孔的密度將腹腔來(lái)源的鼠巨噬細(xì)胞鋪在24孔板中培養(yǎng)過(guò)夜；將5×10⁶個(gè)A431或H292細(xì)胞標(biāo)記上羧基熒光素乙酰乙酸酯(CFSE)。將培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為不添加血清的培養(yǎng)基，饑餓處理2小時(shí)。每孔加入2×10⁵個(gè)CFSE標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞；接下來(lái)加入以下組別的抗體，每組三個(gè)復(fù)孔，終濃度為10μg/mL：(1)IgG組；(2)Bi-SP組，37℃孵育2-3小時(shí)。用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三次，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算每100個(gè)巨噬細(xì)胞(三個(gè)視野)中CFSE陽(yáng)性細(xì)胞的比率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，A圖為Bi-SP組處理后，較之對(duì)照組IgG抗體處理，巨噬細(xì)胞對(duì)A431細(xì)胞吞噬效能顯著增強(qiáng)。B圖為統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，顯示了Bi-SP處理組被吞噬的細(xì)胞數(shù)目與IgG組比較有顯著差異。C圖為Bi-SP組處理后，較之對(duì)照組IgG抗體處理，巨噬細(xì)胞對(duì)H292細(xì)胞吞噬效能顯著增強(qiáng)。D圖為統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，顯示了Bi-SP處理組被吞噬的細(xì)胞數(shù)目與IgG組比較有顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bi-SP可以有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬。

實(shí)驗(yàn)例5雙功能蛋白Bi-SP體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

以表皮癌A431細(xì)胞或肺癌H292細(xì)胞皮下接種雌性NOD-SCID鼠，在接種腫瘤細(xì)胞后待腫瘤組織達(dá)到80mm³-120mm³，靜脈注射以下3組，每組6只小鼠：①人IgG對(duì)照組②Bi-SP③Panitumumab。每周注射2次，共注射4周。給藥過(guò)程中，每隔2日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤大小以評(píng)價(jià)Bi-SP的抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7所示，圖6中橫坐標(biāo)為A431腫瘤的荷瘤小鼠接受藥物處理的時(shí)間，縱坐標(biāo)為腫瘤體積，箭頭為兩次藥物注射的時(shí)間，表明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的藥物Bi-SP治療后，較之無(wú)關(guān)IgG治療組及Panitumumab組，Bi-SP組顯示了顯著的腫瘤消退趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖7中橫坐標(biāo)為H292腫瘤的荷瘤小鼠接受藥物處理的時(shí)間，縱坐標(biāo)為腫瘤體積，箭頭為兩次藥物注射的時(shí)間，表明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的藥物Bi-SP治療后，較之無(wú)關(guān)IgG治療組及Panitumumab組，Bi-SP組顯示了顯著的腫瘤消退趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bi-SP可以有效抑制荷瘤小鼠身上的腫瘤生長(zhǎng)，且其抑瘤效果顯著強(qiáng)于Pan組和IgG對(duì)照組組。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院

<120> 抗CD47和EGFR的雙功能蛋白及其制備方法與應(yīng)用

<130> KHP161116843.4Q

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人IgG1重鏈恒定區(qū)

<400> 1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttggtgag 300

aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac 360

gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac 420

ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca 480

ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg 540

tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc 600

accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc 660

agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 720

accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 780

tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 840

cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca 900

aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc 960

acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 1020

agacaaagcc gcgggaagag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg 1080

tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc 1140

tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag 1200

ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca 1260

acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1320

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1380

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1440

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1500

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1560

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc ggtaaa 1596

<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 人IgG1重鏈恒定區(qū)

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Gly Glu Arg Pro Ala Gln Gly Gly Arg Val Ser Ala Gly Ser

100 105 110

Gln Ala Gln Arg Ser Cys Leu Asp Ala Ser Arg Leu Cys Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Gly Gln Gln Gly Arg Pro Arg Leu Pro Leu His Pro Glu Ala Ser

130 135 140

Ala Arg Pro Thr His Ala Gln Gly Glu Gly Leu Leu Ala Phe Ser Pro

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gln Ala Gln Ala Arg Cys Pro Pro Arg Pro Cys Thr Gln

165 170 175

Arg Gly Arg Cys Trp Ala Gln Thr Cys Gln Glu Pro Tyr Pro Gly Gly

180 185 190

Pro Cys Pro Pro Lys Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Ser Thr Pro Ser

195 200 205

Ala Arg Thr Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Ser Asn Ser Gln Ser Ser

210 215 220

Leu Cys Arg Ala Gln Ile Leu Gln Asn Ser His Met Pro Thr Val Pro

225 230 235 240

Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Gln Leu Lys Ala Gly Gln Val Pro

245 250 255

Ser Ser Leu His Pro Gly Thr Gly Pro Ser Arg Val Leu Thr Arg Pro

260 265 270

Pro Pro Ser Leu Pro Gln His Leu Asn Ser Trp Gly Asp Arg Gln Ser

275 280 285

Ser Ser Ser Pro Gln Asn Pro Arg Thr Pro Ser Ser Pro Gly Pro Leu

290 295 300

Arg Ser His Ala Trp Trp Trp Thr Ala Thr Lys Thr Leu Arg Ser Ser

305 310 315 320

Ser Thr Gly Thr Trp Thr Ala Trp Arg Cys Ile Met Pro Arg Gln Ser

325 330 335

Arg Gly Lys Ser Ser Thr Thr Ala Arg Thr Val Trp Ser Ala Ser Ser

340 345 350

Pro Ser Cys Thr Arg Thr Gly Met Ala Arg Ser Thr Ser Ala Arg Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Pro Ser Gln Pro Pro Ser Arg Lys Pro Ser Pro Lys Pro

370 375 380

Lys Val Gly Pro Val Gly Cys Glu Gly His Met Asp Arg Gly Arg Leu

385 390 395 400

Gly Pro Pro Ser Ala Leu Arg Val Thr Ala Val Pro Thr Ser Val Pro

405 410 415

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

420 425 430

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

435 440 445

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

450 455 460

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

465 470 475 480

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

485 490 495

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

500 505 510

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 520

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 人Kappa輕鏈恒定區(qū)

<400> 3

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人Kappa輕鏈恒定區(qū)

<400> 4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> pGEM-T/Bi-SPVH

<400> 5

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg 120

cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat 180

tataacccct ccctcaagag cagactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc 240

tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat 300

cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> pGEM-T/Bi-SPVH

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 324

<212> DNA

<213> pGEM-T/Bi-SPVL

<400> 7

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttgatcatc tcccgctcgc tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acga 324

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> pGEM-T/Bi-SPVL

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> Bi-SP抗CD47側(cè)SIRPα突變體

<400> 9

gaagaagaac tgcagatcat ccagccggac aaatctgttt ctgttgcggc gggtgaatct 60

gcgatcctgc actgcaccat cacctctctg ttcccggttg gtccgatcca gtggttccgt 120

ggtgcgggtc cggcgcgtgt tctgatctac aaccagcgtc agggtccgtt cccgcgtgtt 180

accaccgttt ctgaaaccac caaacgtgaa aacatggact tctctatctc tatctctaac 240

atcaccccgg cggacgcggg cacctactac tgcatcaaat tccgtaaagg ttctccggac 300

accgaattta aatctggtgc gggcaccgaa ctgtctgttc gtgcgaaacc gtct 354

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> Bi-SP抗CD47側(cè)SIRPα突變體

<400> 10

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 11

<211> 696

<212> DNA

<213> Bi-SP抗CD47側(cè)Fc段

<400> 11

gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tcctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 696

<210> 12

<211> 232

<212> PRT

<213> Bi-SP抗CD47側(cè)Fc段

<400> 12

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 13

<211> 642

<212> DNA

<213> Bi-SP抗EGFR側(cè)輕鏈

<400> 13

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttgatcatc tcccgctcgc tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> Bi-SP抗EGFR側(cè)輕鏈

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 1953

<212> DNA

<213> Bi-SP中抗EGFR側(cè)重鏈

<400> 15

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg 120

cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat 180

tataacccct ccctcaagag cagactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc 240

tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat 300

cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tggtgagagg 660

ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 720

tcccggctat gcagccccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 780

gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc 840

tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 900

tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 960

ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1020

aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1080

gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1140

agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 1200

cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1260

acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1320

aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1380

caaagccgcg ggaagagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1440

tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1500

cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1560

cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga gagtgaccgc tgtaccaacc 1620

tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1680

gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1740

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1800

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1860

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1920

acgcagaaga gcctctccct gtctcccggt aaa 1953

<210> 16

<211> 643

<212> PRT

<213> Bi-SP中抗EGFR側(cè)重鏈

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Glu Arg Pro Ala Gln Gly

210 215 220

Gly Arg Val Ser Ala Gly Ser Gln Ala Gln Arg Ser Cys Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ser Arg Leu Cys Ser Pro Ser Pro Gly Gln Gln Gly Arg Pro Arg Leu

245 250 255

Pro Leu His Pro Glu Ala Ser Ala Arg Pro Thr His Ala Gln Gly Glu

260 265 270

Gly Leu Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ser Gly Gln Ala Gln Ala Arg Cys

275 280 285

Pro Pro Arg Pro Cys Thr Gln Arg Gly Arg Cys Trp Ala Gln Thr Cys

290 295 300

Gln Glu Pro Tyr Pro Gly Gly Pro Cys Pro Pro Lys Pro Thr Pro Lys

305 310 315 320

Ala Lys Leu Ser Thr Pro Ser Ala Arg Thr Pro Ser Leu Leu Pro Asp

325 330 335

Ser Ser Asn Ser Gln Ser Ser Leu Cys Arg Ala Gln Ile Leu Gln Asn

340 345 350

Ser His Met Pro Thr Val Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Gln

355 360 365

Leu Lys Ala Gly Gln Val Pro Ser Ser Leu His Pro Gly Thr Gly Pro

370 375 380

Ser Arg Val Leu Thr Arg Pro Pro Pro Ser Leu Pro Gln His Leu Asn

385 390 395 400

Ser Trp Gly Asp Arg Gln Ser Ser Ser Ser Pro Gln Asn Pro Arg Thr

405 410 415

Pro Ser Ser Pro Gly Pro Leu Arg Ser His Ala Trp Trp Trp Thr Ala

420 425 430

Thr Lys Thr Leu Arg Ser Ser Ser Thr Gly Thr Trp Thr Ala Trp Arg

435 440 445

Cys Ile Met Pro Arg Gln Ser Arg Gly Lys Ser Ser Thr Thr Ala Arg

450 455 460

Thr Val Trp Ser Ala Ser Ser Pro Ser Cys Thr Arg Thr Gly Met Ala

465 470 475 480

Arg Ser Thr Ser Ala Arg Ser Pro Thr Lys Pro Ser Gln Pro Pro Ser

485 490 495

Arg Lys Pro Ser Pro Lys Pro Lys Val Gly Pro Val Gly Cys Glu Gly

500 505 510

His Met Asp Arg Gly Arg Leu Gly Pro Pro Ser Ala Leu Arg Val Thr

515 520 525

Ala Val Pro Thr Ser Val Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

530 535 540

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

545 550 555 560

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

565 570 575

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

580 585 590

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

595 600 605

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

610 615 620

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

625 630 635 640

Pro Gly Lys

<210> 17

<211> 1050

<212> DNA

<213> Bi-SP抗CD47側(cè)Fc融合蛋白

<400> 17

gaagaagaac tgcagatcat ccagccggac aaatctgttt ctgttgcggc gggtgaatct 60

gcgatcctgc actgcaccat cacctctctg ttcccggttg gtccgatcca gtggttccgt 120

ggtgcgggtc cggcgcgtgt tctgatctac aaccagcgtc agggtccgtt cccgcgtgtt 180

accaccgttt ctgaaaccac caaacgtgaa aacatggact tctctatctc tatctctaac 240

atcaccccgg cggacgcggg cacctactac tgcatcaaat tccgtaaagg ttctccggac 300

accgaattta aatctggtgc gggcaccgaa ctgtctgttc gtgcgaaacc gtctgagccc 360

aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 420

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 780

ctgaccaaga accaggtcag cctgtcctgc gccgtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900

ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1050

<210> 18

<211> 350

<212> PRT

<213> Bi-SP抗CD47側(cè)Fc融合蛋白

<400> 18

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

165 170 175

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

245 250 255

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

305 310 315 320

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

325 330 335

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350